Introduction
Musculoskeletale aandoeningen invloed op miljoenen mensen in de Verenigde Staten en de huidige ernstige gevolgen voor de nationale en lokale systemen gezondheid 1. Deze aandoeningen worden gekenmerkt door het verlies van bot-en gewrichtsziekten functie die uitgebreide behandeling en lange periodes van herstel nodig hebben. Gewoonlijk, een relatieve toename van het aantal en / of activiteit van osteoclasten, cellen gespecialiseerd bot resorberen, bij osteoporose en artritis waargenomen 2. Onder fysiologische omstandigheden het aantal en de activiteit van osteoclasten wordt geregeld door receptor activator van nucleaire factor κ B-ligand (RANKL), die wordt geproduceerd door osteoblasten. Osteoprotegerine (OPG), is een decoy receptor voor RANKL ook geproduceerd door osteoblasten 3 In vivo diermodellen dat de systemische overexpressie van sRANKL, of verwijdering van OPG betrokken zijn zeer waardevol bij osteoporose onderzoek.; Deze werkwijzen vereisen het genereren van transgene muizen 4,5. Hier, een nieuw alternatiefWerkwijze overexpressie sRANKL voor de studie van spier-gerelateerde stoornissen beschreven. Specifiek minicircle (MC)-DNA-technologie en hydrodynamische levering methoden werden gebruikt om genoverdracht van sRANKL in vivo te bereiken en overexpressie muis sRANKL systemisch 6.
Deze methode is ook een aanvulling op andere in vivo modellen van osteoporose, zoals hormonale modulatie van osteoclasten na ovariëctomie 7 en dieetinterventie door laag-calcium dieet 8. Deze modellen zijn zeer nuttig om de verschillende aspecten van het bewegingsapparaat gerelateerde stoornissen maar ze chirurgische procedures vereisen en kan tot enkele maanden, tegen aanzienlijke kosten 9 bestuderen. Ovariëctomie (OVX) knaagdier model is een proefdiermodel waar verwijdering van de eierstokken leidt tot een tekort aan oestrogeen waardoor de menselijke postmenopauzale osteoporose 10 nabootsen. Human postmenopauzale osteoporose, een aandoening waarbij oestrogeen Deficirantie leidt tot een verhoogd risico op botbreuken en osteoporose treft ongeveer acht miljoen vrouwen in de Verenigde Staten alleen. Hoewel de OVX model is handig voor postmenopauzale osteoporose biedt beperkte voordelen in het bestuderen van osteoporose in het algemeen. Oestrogeen onderdrukt botverlies, door het induceren van osteoclasten en osteoblasten remmen apoptose, derhalve in zijn afwezigheid een verhoogde activiteit van de osteoclasten wordt waargenomen 10-12. Een RANKL-OPG-ratio onbalans die botresorptie gunsten is ook waargenomen 13. Echter oestrogeendeficiëntie in vivo ook gepaard met verlaagde transformerende groeifactor β (TGF β), verhoogde interleukine-7 (IL-7) en TNF, IL-1 en IL-6 14,15. Aangezien deze cytokinen bekend botremodellering modulerende functies onafhankelijk van de RANKL-route, is het onmogelijk om eventuele osteoclast activering kenmerk uitsluitend de RANKL RANK-as. De in dit document beschreven model stelt onderzoekers in staat om te studeren in vivo RANKL-RANK as in osteoclastogenese en botverlies zonder pro-inflammatoire cytokines in vergelijking met OVX knaagdier modellen.
Bovendien, in vitro osteoclastogenese technieken zijn essentiële instrumenten om osteoclasten activering studeren voor potentiële therapeutische behandelingen van musculoskeletale aandoeningen. Eerdere studies hebben ook aangetoond dat het kweken van muizen beenmerg afgeleide macrofagen (BMMs), muis-macrofaag kolonie stimulerende factor (M-CSF) en muis sRANKL kan leiden tot differentiatie van osteoclasten 3,16,17. Hier, de protocollen meerkernige osteoclast-achtige cellen uit muizen beenmerg en uit humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) in vitro 18 genereren beschreven. Het celgebaseerde proeven vereist een volwassen terminaal gedifferentieerd en volledig functionele osteoclasten bepalen worden ook kort beschreven. Deze in vitro technieken aanvulling op de roman in vivo benadering en samen dienen als powerful onderzoeksinstrumenten om de differentiatie van osteoclasten en activering te bestuderen. Met deze systemen kunnen wetenschappers osteoclasten in vivo en in vitro genereren en bepalen de prikkels en signalen nodig zijn voor de proliferatie en activering en test de effectiviteit van farmacologische en biologische remmers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hydrodynamische Levering van sRANKL MC DNA
- Hydrodynamische Levering via Muisstaartje Vein
- Weeg de muis voordat de staart ader injectie. Verdun sRANKL of groen fluorescerend eiwit (GFP) MC in Ringer's oplossing (voorverwarmen bij 37 ° C) in een totaal volume van ~ 10% van de muis lichaamsgewicht.
- Warm de muis in een kooi voor 10 minuten voorafgaand aan de injectie om de bloedvaten verwijden en maak zijnerven (GW) zichtbaar. Bewaak de muis zorgvuldig om uitdroging en hyperthermie te voorkomen.
- Zodra de LVs zijn verwijde en zichtbaar, de overdracht van de muis om de restrainer en steek de stekker ver genoeg in het vat om beweging te beperken. Monitor de muis voor normale activiteit zoals ademhaling. Pas de stekker van restrainer indien nodig.
- Ontsmet de injectieplaats 3/4 van de punt van de staart met een alcoholdoekje. Gebruik een 27-30 G naald voor muis staartaderinjectie. Houd de staart stevig met een hand en steek de naald inde staartader. Oefen druk uit op de spuit en vul de injectie binnen 5-7 sec.
- Haal de naald uit de staart ader en druk uit te oefenen met een watje op de injectieplaats te stoppen met bloeden. Monitor de muis voor 15-30 minuten, breng de muis terug naar vivarium zodra de ademhaling tarief wordt verlaagd tot het normale tarief.
- Bevestiging van Systemische Muis sRANKL Expressie en kwantificering van Muis Serum TRACP5b bericht Gene Transfer
- Warm de muis in een kooi gedurende 5-10 minuten om de bloedvaten verwijden en maak LVs zichtbaar. Bewaak de muis zorgvuldig om uitdroging en hyperthermie te voorkomen.
- Maak een kleine incisie met een mes aan de staart van de muis op een site een kwart van de punt van de staart.
- Verzamel ongeveer 100 pi bloed serum verdeelbuizen.
- Incubeer serumafscheiding buizen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer de monsters bij 10.000 xg gedurende 5 minuten en verzamel het serum. Store serum -80 ° C voor verdere analyse.
- Voer sRANKL ELISA en muisserum TRACP5b test op serum monsters met behulp van een commercieel verkrijgbare kit.
2. In vitro Osteoclast Generatie van Mouse BMMs
- Isolatie en kweken van BMMs
- Isolatie van het scheenbeen en het dijbeen botten: Euthanaseren de donor muis met CO 2, en desinfecteer de benen met 70% ethanol. Ontleden van het schaambeen naar de calcaneus bot, aan het bovenbeen en onderbeen botten intact te verwijderen.
- Verwijder de huid en spieren voorzichtig zonder beschadiging van het bot. Plaats verwerkt femur en tibia in een petrischaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Verwijdering van het beenmerg: Snij het puntje aan de ene kant van het bovenbeen en onderbeen botten en spoel het beenmerg in een 50 ml buis met behulp van een 1 ml spuit met een 25 G naald, geladen met α-MEM bevattende 1% penicilline / streptomycine (Osteoclast Cultuur Medium / OCM).
- Cultuur van macrofagen
- Tellen cellen met behulp van een hemocytometer of automatische cel teller.
- Plaat 1 x 10 6 cellen per putje van een 6-well plaat of 3 x 10 5 cellen op glazen dekglaasjes (5 mm) of dentineplakjes geplaatst in 96-well plaat en incubeer bij 37 ° C.
- Zuig alle media met niet-hechtende cellen en incubeer cellen bij 37 ° C met verse OCM (+) met 25 ng / ml muis M-CSF gedurende 48 uur.
- Zuig alle media en incubeer cellen bij 37 ° C met verse OCM (+) medium dat 25 ng / ml muis M-CSF en 30 ng / ml muis sRANKL osteoclastogenese te initiëren. Vullen media om de 3 dagen, zoals vereist.
- Groeien cellenongeveer 6-8 dagen tot reusachtige multinucleaire cellen kunnen resorbeerbare botvorming. Zodra meerkernige cellen blijken, voeren TRAP (tartraat resistente zure fosfatase) kleuring met behulp van een commercieel verkrijgbare kit, en wanneer deze volledig gerijpt, voert functionele testen. Visualiseer F-actine ringen op coverslips gebruik phalloidin vlek en het imago van de cellen die aan plakjes dentine door scanning elektronenmicroscopie (SEM), zoals eerder 19 beschreven.
3. In vitro osteoclasten Generatie van Human PBMC
- Isolatie van menselijke PBMC
- Voeg 10 ml van de voorverwarmde Histopaque-1077 in een 50 ml buis.
- Lege leukocyten filter verkregen uit bloedbank met steriele PBS in een 50 ml buis (1:1 verhouding van bloed met PBS). Het verdunde bloed over de histopaque oplossing heel langzaam in lagen, om ervoor te zorgen dat het bloed niet mengen met de Histopaque.
- Centrifugeer monsters bij 1000 xg gedurende 20 minuten bij 18 ° C. Volgening centrifugatie voorzichtig isoleren witte buffy coat laag die de witte bloedcellen en naar een nieuwe buis van 50 ml.
- Verdun cellen met PBS en centrifugeer opnieuw bij 650 xg gedurende 5 minuten om de cellen te verzamelen.
- Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in OCM (-) media en tel cellen met behulp van cel teller.
- Plating en kweken van PBMCs
- Resuspendeer de cellen in OCM (+) media en plaat 8 x 10 6 cellen / ml per putje in een 6-well plaat of 1 x 10 6 cellen / ml per putje in 96-well plaat. Plaat cellen op dekglaasjes (5 mm) overeenkomstig immunofluorescentie beeldvorming en op botplakjes voor botresorptie assays zoals eerder beschreven 20.
- Verandering kweekmedia, aanvulling van de cellen met humaan M-CSF elke 2-3 dagen of zoals vereist. Ga dan naar differentiatie stap op dag 5 door toevoeging van 30 ng / ml humaan sRANKL samen met 25 ng / ml humaan M-CSF in OCM (+) media om osteoclastogenes initiërenis.
- Kweek cellen ongeveer 14 tot 21 dagen tot reusachtige multinucleaire cellen vormen. Zodra meerkernige cellen blijken, kunnen deze cellen vervolgens gelabeld voor TRAP, en wanneer volledig gerijpt, kunnen functionele testen worden uitgevoerd. F-actine ringen kunnen worden gevisualiseerd op dekglaasjes met phalloidin vlek. De morfologie van de cel kan worden onderzocht in cellen bevestigd aan plakjes dentine met SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier wordt een nieuwe genoverdracht techniek voor differentiatie van osteoclasten in vivo en celkweek protocollen voor differentiëren voorlopercellen in osteoclasten in vitro als methode om de effecten van cytokines op osteoclastogenese studie beschreven. In figuur 1 zijn de representatieve resultaten van succesvolle genoverdracht van GFP en muis sRANKL MC bij muizen weergegeven. In figuur 2 zijn de representatieve beelden van muizen beenmerg of humane PBMC celdifferentiatie tijdsverloop kweken van voorlopercellen tot osteoclasten door helderveld microscopie getoond. Figuur 3, worden de representatieve beelden van drie onafhankelijke methoden voor het karakteriseren muis beenmerg afgeleide osteoclasten weergegeven . De aanwezigheid van muis sRANKL activeert de expressie van TRAP (figuren 3A en B) en de vorming van F-actine ringen (Figuren 3C en D). Scanning electron microscopy (SEM) blijkt dat muis sRANKL induceert de vorming van reuzencellen kunnen resorbeerbare bot (de figuren 3E en F). figuur 4 dezelfde karakteriseringsmethoden menselijke PBMC afgeleide osteoclasten worden getoond.
Figuur 1. SRANKL in vivo genenoverdracht leidt tot verhoogde osteoclastogenesis. Ventraal aanzicht A, B) muizenlever explantaten en C, D) gehele lichaam beelden van 12-weken oude C57BL / 6 mannelijke muizen geïnjecteerd met 5 ug van GFP of sRANKL MC DNA. De pijl geeft GFP expressie in vivo genoverdracht GFP muis. RANKL genoverdracht muizen dienen als geen achtergrond fluorescentie. Beelden die door Maestro 2 Imager, een dag na de gen-overdracht (rood en groen deNote achtergrond en GFP, respectievelijk). E) Plasmide kaart van sRANKL MC-DNA-construct en F) sRANKL niveau in het serum van 1, 5 en geanalyseerd 11 dagen na GFP of sRANKL genoverdracht. G) muizenserum TRACP5b niveau geanalyseerd 11 dagen na GFP of sRANKL genoverdracht. Schaalbalken dan 5 mm in A, B en 10 mm C, D
Figuur 2. In vitro osteoclastogenese in zowel muis als humane celculturen. Helderveld microscopie van muizencellen geïsoleerd uit beenmerg en gekweekt in aanwezigheid van 25 ng / ml muis M-CSF en 30 ng / ml muis sRANKL die een differentiatie tijdsverloop op dagen A), 2 B) 5, en C) 8. Bright-microscopie van menselijke cellen geïsoleerduit perifeer bloed en gekweekt in aanwezigheid van 25 ng / ml humaan M-CSF en 30 ng / ml humaan sRANKL die een differentiatie tijdsverloop op dag D), 4 E) 14 en F) 21. Schaalbalken dan 20 urn.
Figuur 3. Genereren en karakteriseren van muizen osteoclasten. TRAP-kleuring (roze) van muizencellen geïsoleerd uit beenmerg en gedurende 6 dagen gekweekt in aanwezigheid van A) 25 ng / ml muis M-CSF of B) 25 ng / ml muis M -CSF en 30 ng / ml muis sRANKL. Phalloidin (groen) en DAPI (blauw) kleuring van muizencellen geïsoleerd uit beenmerg en gedurende 8 dagen in aanwezigheid van C) 25 ng / ml muis M-CSF of D) 25 ng / ml muis M-CSF en 30 ng / ml muis sRANKL die de vorming van FaCTIN ring in meerkernige cellen. SEM microfoto van muizencellen geïsoleerd uit beenmerg en gedurende 8 dagen in de aanwezigheid van E) 25 ng / ml muis M-CSF of F) 25 ng / ml muis M-CSF en 30 ng / ml muis sRANKL die de vorming van resorptie gebieden op het bot, zoals aangegeven door de pijlen. Schaal balken geven 40 micrometer in AD, en 30 micrometer in E, F.
Figuur 4. Generatie en karakterisatie van menselijke osteoclasten. TRAP-kleuring (pink) van menselijke cellen geïsoleerd uit PBMC en gedurende 15 dagen in aanwezigheid van A) 25 ng / ml humaan M-CSF of B) 25 ng / ml humaan M- CSF en 30 ng / ml humaan sRANKL. Phalloidin (groen) en DAPI (blauw) kleuring van menselijke cellen geïsoleerd uit PBMC en gedurende 19 dagen in aanwezigheid van C) D) 25 ng / ml humaan M-CSF en 30 ng / ml humaan sRANKL die de vorming van F-actine ringen meerkernige cellen. SEM microfoto van menselijke cellen geïsoleerd uit PBMC en gedurende 18 dagen in aanwezigheid van E) 25 ng / ml humaan M-CSF of F) 25 ng / ml humaan M-CSF en 30 ng / ml humaan sRANKL die de vorming van resorptie gebieden op het bot, zoals aangegeven door de pijlen. Schaalbalken dan 10 um in A, B, 20 urn C, D 15 urn E, F.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Musculoskeletale aandoeningen zijn belangrijkste oorzaken van morbiditeit en invaliditeit en zijn samengesteld uit meer dan 150 ziekten en syndromen; die ongeveer 90 miljoen Amerikanen vandaag. Gewrichtsontsteking en botafbraak zijn overheersende kenmerken van musculoskeletale aandoeningen, met inbegrip van artritis en osteoporose. Osteoporose is een aandoening die bot integriteit verzwakt, wat vaak leidt tot breuken van het bot. Artritis is een chronische, invaliderende ziekte die wordt gekenmerkt door een ontsteking van de gewrichten die gezwollen, gevoelig en stijf-beperking van normale beweging te worden en kan leiden tot invaliditeit. Hoewel de pathogenese van musculoskeletale aandoeningen verschilt sterk van elkaar, botafbraak is de overkoepelende gemeenschappelijk kenmerk. Botafbraak in musculoskeletale aandoeningen wordt voornamelijk veroorzaakt door een onbalans tussen botresorptie en botvorming 21,22. Een therapeutische benadering is om te proberen om de capaciteit van deze cellen aan het bot vernietigen blokkeren
De in vivo model hier beschreven gebruikt minicircles, die kleine episomale DNA-vectoren (~ 4kb) bevrijd van bacteriële backbone, die ook dienen als transgen dragers 24 zijn. Minicircles express transgenen 10-1000 maal hoger dan normale bacteriële plasmiden met een stabiele expressie tot enkele maanden. De kleinere molecuulgrootte van minicircles draagt efficiëntere transfectie en aanzienlijke expressie vergelijken met normale bacteriële plasmiden 24. Daarom worden minicircles nu algemeen gebruikt in pre-klinische studies genoverdracht 25,26. Hydrodynamische levering is een goed ontwikkelde methode van hydrodynamische druk in de haarvaten van plasmide-DNA te leveren in het gehele lichaam van een muis. Hydrodynamische gen levering aan hepatocyten via staartaderinjectie bij muizen is gevestigde to uiten transgen door plasmide-DNA 6. In deze studies, overexpressie muis sRANKL in de in vivo muismodel wordt bereikt door sRANKL MC en hydrodynamische levering via staartader injecties. Muis sRANKL ELISA kan worden gebruikt om serumniveaus van RANKL sporen bij muizen. Significante verhoging van muisserum TRACP5b, een botresorptiemerker 27, wordt waargenomen in sRANKL genoverdracht muizen. Met name is deze techniek niet beperkt tot overexpressie van sRANKL; Het kan ook verder worden toegepast op andere uitgescheiden eiwitten 28 overexpressie. De belangrijkste technische moeilijkheid bij deze procedure is de hydrodynamische levering via de staartader. Naast de reguliere staartaderinjectie, hydrodynamische levering vereist levering van minicircles in grote hoeveelheden fysiologische oplossing in de muizen binnen 5-7 sec. Zo stabiele handling en injectie technieken zijn essentieel voor succes met deze procedure. Het genereren sRANKL transgene muizen is een andere aanpak voor in vivo osteoclastogenesis. Echter, een hoge sRANKL tot embryonale letaliteit 4 en transgene muizen is ook duur en tijdrovend.
In OVX knaagdier model, zowel inflammatoire cytokinen zoals TNF, IL-1 en IL-6 en de niet-inflammatoire cytokine sRANKL dragen aan in vivo osteoclastogenese en botverlies. sRANKL genoverdracht model leidt tot overexpressie van alleen het niet-inflammatoire cytokine sRANKL. Daarom is de sRANKL genoverdracht model hier beschreven biedt onderzoekers een krachtig instrument om de bijdrage van de RANKL-RANK as in botremodellering in afwezigheid van ontsteking te onderzoeken.
In vitro osteoclasten kweekmethode die co-kweken van beenmergcellen en osteoblasten omvat, werd in de late jaren 1980 voor de ontdekking van RANKL in de late 1990's 29,30. Recombinant M-CSF en RANKL induceren de differentiatie van osteoclasten efficiënt in vitro eennd methode is eerder beschreven in andere studies 3,31. M-CSF is bekend RANK expressie stimuleren begin osteoclastvoorlopers 32 en fungeren als een overlevingsfactor voor osteoclastvoorlopers en volwassen osteoclasten 33. RANKL is essentieel voor de differentiatie van osteoclasten en activering 3. Hier wordt de werkwijze in vitro osteoclastogenese beschreven. Succesvol kweken en differentiatie van voorlopercellen tot osteoclasten vereisen steriele celisolatie en de juiste plating technieken alsook een zorgvuldige begrip van getimede cel oogst. Berekend beplating van de cellen is cruciaal omdat de differentiatie van osteoclasten vereist fusie van osteoclasten voorloper cellen 34 en een ontoereikend aantal osteoclasten voorloper cellen zal niet fusie en de differentiatie van de voorlopercellen te vergemakkelijken in osteoclasten. Ook een overmaat aantal osteoclast precursor cellen, leidt tot de vorming en uiteindelijke celdood klonteren. Verwijdering van niet-Hechtende cellen 2 uur na het uitplaten van de cellen kan helpen een optimaal aantal cellen handhaven. Tenslotte, het tijdstip van celoogst is cruciaal als osteoclasten terminaal gedifferentieerd kortstondig cellen met een levensduur van ongeveer 48 uur 35. Zo moeten de cellen worden geoogst binnen 48 uur na de eerste waarneming van meerkernige cellen. Deze cellen kunnen vervolgens worden gekarakteriseerd door TRAP en F-actine kleuring door immunohistochemie en botresorptie activiteit kan worden gedetecteerd door scanning elektronenmicroscopie (SEM). Deze experimentele benaderingen zorgen voor een heldere definitie van de osteoclasten in termen van hun fenotype en functie.
De in vivo en in vitro technieken die hier beschreven zal de ontwikkeling van osteoclast inhibitors momenteel in pre-klinische studies te vergemakkelijken, waardoor effectieve therapeutische strategieën voor de miljoenen osteoporose en artritis patiënten wereldwijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
| Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
| Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
| Human RANK-Ligand - soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
| Mouse RANK-Ligand - soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
| Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
| Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
| MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |
References
- Yelin, E. Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline. The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).
- Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease. European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Mizuno, A., et al. Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis. Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).
- Bucay, N., et al. osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification. Gene., & development. 12, 1260-1268 (1998).
- Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).
- Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton. Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).
- Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats. Bone. 25, 687-695 (1999).
- Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).
- Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women. The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).
- Hughes, D. E., et al. Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta. Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).
- Kousteni, S., et al. Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity. Cell. 104, 719-730 (2001).
- Ominsky, M. S., et al. RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).
- Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice. The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).
- Weitzmann, M. N., Pacifici, R. Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale. The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).
- Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N.
- Asagiri, M., Takayanagi, H. The molecular understanding of osteoclast differentiation. Bone. 40, 251-264 (2007).
- Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).
- Adamopoulos, I. E., et al. Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption. The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).
- Adamopoulos, I. E., et al. Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors. Arthritis researc., & therapy. 12, (2010).
- Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection. J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).
- Sato, K., Takayanagi, H. Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology. Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).
- Das, S., Crockett, J. C. Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment. Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).
- Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. A robust system for production of minicircle DNA vectors. Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo. Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).
- Halleen, J. M., et al. Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).
- Adamopoulos, I. E., et al. IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass. J Immunol. 187, 951-959 (2011).
- Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J.
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).
- Fuller, K., et al. Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts. The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).
- Edwards, J. R., Mundy, G. R. Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models. Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).
- Weinstein, R. S., et al. Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids. The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).
