Introduction
Muskel-sykdommer påvirker millioner av mennesker i USA og presentere alvorlige konsekvenser for nasjonale og lokale helsesystemer en. Disse lidelser er karakterisert ved tapet av ben-og leddfunksjon som vil kreve omfattende behandling og lange perioder med utvinning. Vanligvis er en relativ økning i antallet og / eller aktiviteten til osteoklaster, celler spesialisert til å resorbere ben, i osteoporose og artritt blir observert to. Under fysiologiske betingelser antallet og aktiviteten av osteoklaster er regulert av reseptor aktivator av nukleær faktor κ-B ligand (RANKL), som er produsert av osteoblaster. Osteoprotegerin (OPG), er en lokkedue reseptor for RANKL også produsert av osteoblaster 3 In vivo dyremodeller som involverer systemisk overekspresjon av sRANKL, eller sletting av OPG er svært verdifull i osteoporose forskning.; Imidlertid er disse metoder krever generering av transgene mus 4,5. Her en ny alternativmetode for overekspresjon sRANKL for studiet av muskel-relaterte lidelser er beskrevet. Spesielt ble minicircle (MC) DNA-teknologi og hydrodynamiske levering metoder som brukes for å oppnå genoverføring av sRANKL in vivo og overuttrykker mus sRANKL systemisk seks.
Denne metoden er også komplementære til andre in vivo-modeller av osteoporose, slik som hormonelle modulering av osteoklaster etter ovariektomi 7 og kost inngrep med lavt kalsium diett 8.. Disse modellene er svært nyttig å studere ulike aspekter av muskel-relaterte lidelser, men de krever kirurgiske prosedyrer, og kan ta opp til flere måneder, til en betydelig kostnad ni. Ovariektomiserte (OVX) gnagermodellen er en eksperimentell dyremodell, hvor fjerning av eggstokkene fører til østrogenmangel derved å etterligne humant postmenopausal osteoporose 10.. Menneskelig postmenopausal osteoporose, en tilstand der østrogen deficiency fører til økt risiko for benbrudd og osteoporose påvirker om lag åtte millioner kvinner i USA alene. Selv om OVX modellen er nyttig for postmenopausal osteoporose det gir begrensede fordeler i å studere osteoporose generelt. Østrogen undertrykker bentap, ved å fremkalle osteoklast og hemme osteoblast apoptose, derfor i sitt fravær økt osteoklastaktiviteten er observert 10-12. En RANKL-OPG ratio ubalanse som favoriserer benresorpsjon er også observert 13. Imidlertid er østrogenmangel in vivo også ledsaget av reduserte nivåer av transformerende vekstfaktor β (TGF β), økt interleukin-7 (IL-7) og TNF, IL-1 og IL-6 14,15. Som disse cytokiner er kjent bein remodeling regulerende funksjoner uavhengig av RANKL veien, er det umulig å tilskrive noen osteoklast aktivering utelukkende til RANKL-RANK aksen. Modellen er beskrevet i denne artikkelen gjør forskerne å studere i vivo RANKL-RANG aksen i osteoclastogenesis og bentap uten proinflammatoriske cytokiner forhold til OVX gnager modeller.
I tillegg, in vitro osteoclastogenesis teknikker er viktige verktøy for å studere osteoklast aktivering for potensielle terapeutiske behandlinger av muskel-og skjelettsykdommer. Tidligere studier har også vist at dyrking mus benmarg avledet makrofager (BMMs) med musemakrofag koloni-stimulerende faktor (M-CSF) og mus sRANKL kan føre til osteoklast differensiering 3,16,17. Her er de protokoller generere multinucleated osteoclast lignende celler fra mus beinmarg samt fra humane perifere mononukleære blodceller (PBMCs) in vitro 18 beskrevet. De celle-baserte analyser som kreves for å definere en moden terminalt differensiert og fullt funksjonell osteoklastmediert er også kort beskrevet. Disse in vitro teknikker utfylle romanen in vivo tilnærming og sammen fungere som powerful undersøkende verktøy for å studere osteoklast differensiering og aktivering. Ved hjelp av disse systemer, har forskere i stand til å generere osteoklaster in vivo og in vitro, og definere stimuli og signaler som er nødvendige for deres proliferasjon og aktivering så vel som tester effektiviteten av farmakologiske og biologiske inhibitorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Hydrodynamisk Levering av sRANKL MC DNA
- Hydrodynamisk levering via Mouse Tail Vein
- Vei musen før halevene-injeksjon. Fortynn sRANKL eller grønt fluorescerende protein (GFP) MC i Ringers løsning (pre-varm til 37 ° C) i et totalvolum på ~ 10% av musekroppsvekt.
- Varm opp mus i et bur i 10 min før injeksjon for å utvide blodårene og gjør lateral årer (LVS) synlige. Overvåk musen nøye for å unngå dehydrering og hypertermi.
- Så snart de LVS er utvidede og synlige, overføre musen til rainer og sett pluggen langt nok inn i tønne for å begrense bevegelsen. Overvåk musen for normal aktivitet slik som å puste. Juster pluggen rainer hvis nødvendig.
- Desinfiser injeksjonsstedet 3/4 fra tuppen av halen med spritoppløsning. Bruk en 27-30 G nål for musehalevenen injeksjon. Hold halen fast med en hånd, og stikk nålen ii halevenen. Legge press på sprøyten og fullføre injeksjon innen 5-7 sek.
- Fjern nålen fra halen venen og press med en bomullsdott på injeksjonsstedet for å stoppe blødning. Overvåk musen for 15-30 min, deretter overføre musen tilbake til vivarium når pustefrekvens er redusert til sitt normale nivå.
- Bekreftelse på Systemisk Mouse sRANKL Expression og Kvantifisering av mus Serum TRACP5b Post genoverføring
- Varm opp mus i et bur for 5-10 min for å utvide blodårene og gjøre LVS synlig. Overvåk musen nøye for å unngå dehydrering og hypertermi.
- Lag et lite innsnitt med et blad til musens hale på en side en frem fra haletippen.
- Samle omtrent 100 ul blodserumseparasjons rør.
- Inkuber serumseparasjons rør ved romtemperatur i 30 min.
- Sentrifuger prøvene på 10 000 xg i 5 min og samle serum. Store serum på -80 ° C for videre analyse.
- Utfør sRANKL ELISA og mus serum TRACP5b analysen på serumprøver med et kommersielt tilgjengelig kit.
2. In vitro osteoklast Generation fra Mouse BMMs
- Isolering og dyrking av BMMs
- Isolering av tibia og femur bein: Avlive donor mus med CO 2, og desinfisere bena med 70% etanol. Dissekere fra skambeinet til calcaneus bein, for å fjerne femur og tibia bein intakt.
- Fjern huden og muskelen forsiktig uten skade på benet. Plasser behandlet femur og tibia ben i en petriskål inneholdende fosfatbufret saltvann (PBS).
- Fjerning av benmarg: Klipp av tuppen på den ene siden av femur og tibia bein og skylle ut benmargen til en 50 ml tube ved hjelp av en 1 ml sprøyte med en 25 G nål, lastet med α-MEM inneholder 1% penicillin / streptomycin (osteoklast Kultur Medium / OCM).
- Culture of Makrofager
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer eller automatisk celleteller.
- Plate 1 x 10 6 celler per brønn på en 6-brønners plate eller 3 x 10 5 celler til glass-dekkglass (5 mm) eller dentin skiver som er plassert i 96-brønns plate og inkuberes ved 37 ° C.
- Aspirer alle medier inneholdende ikke-adherente celler og inkuberes cellene ved 37 ° C med frisk OCM (+) inneholdende 25 ng / ml mus M-CSF i 48 timer.
- Aspirer alle medier og inkubere cellene ved 37 ° C med frisk OCM (+) media inneholdende 25 ng / ml mus M-CSF, og 30 ng / ml mus sRANKL å initiere osteoclastogenesis. Fylle media hver 3. dag etter behov.
- Grow cellerfor ca 6-8 dager å danne gigantiske multi-nukleære celler i stand til resorbing bein. Så snart multinucleated celler vises, utfører TRAP (tartrate motstandsdyktig syre fosfatase) flekker ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig kit, og når den er fullt modnet, utføre funksjonelle analyser. Visual F-aktin ringer på dekkglass ved hjelp phalloidin flekken og bilde cellene knyttet til dentin skiver ved scanning elektronmikroskopi (SEM) som beskrevet tidligere 19.
Tre. In vitro osteoklast Generation fra Menneskelig PBMC
- Isolering av Menneskelig PBMC
- Tilsett 10 ml forvarmet Histopaque-1077 i et 50 ml rør.
- Tom leukocytt filter erholdt fra blodbanken med steril PBS i et 50 ml rør (1:1 av blod med PBS). Layer fortynnet blod over Histopaque løsningen veldig sakte, noe som gjør at blodet ikke blandes med Histopaque.
- Sentrifuger prøvene ved 1000 xg i 20 min ved 18 ° C. Følging sentrifugering, isolere nøye den hvite buffy coat lag som inneholder de hvite blodceller og overføre til en ny 50 ml tube.
- Fortynn cellene med PBS og sentrifuger på nytt ved 650 xg i 5 minutter for å samle cellene.
- Fjern supernatanten og resuspender celler i OCM (-) medier og telle celler ved hjelp av celleteller.
- Plating og Dyrking PBMC
- Resuspender cellene i OCM (+) medier og platen 8 x 10 6 celler / ml per brønn i en 6-brønns plate eller en 6 x 10 celler / ml per brønn i 96-brønns plate. Plate celler på glassdekkglass (5 mm) som er nødvendige for immunfluorescens avbildning samt på bein stykker som er egnet for benresorpsjon assays som beskrevet tidligere 20.
- Endre kultur media, påfyll av celler med menneskelig M-CSF hver 2-3 dager eller etter behov. Fortsett deretter til differensiering skritt på dag 5 ved å legge til 30 ng / ml av menneskelig sRANKL sammen med 25 ng / ml human M-CSF i OCM (+) media å initiere osteoclastogeneser.
- Grow celler for ca 14 til 21 dager å danne gigantiske multikjernefysiske cellene. Så snart flerkjernede celler vises, kan disse celler deretter merkes for TRAP, og når den er fullt modnet, kan funksjonsanalysen utføres. F-aktin ringer kan visualiseres på dekkglass ved hjelp phalloidin flekken. Den cellemorfologi kan undersøkes i celler knyttet til dentin skiver av SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her blir en ny genoverføring teknikk for differensiering av osteoklaster in vivo-og cellekultur-protokoller for å differensiere forløper celler i osteoklaster in vitro som en fremgangsmåte for å studere effektene av cytokiner på osteoclastogenesis beskrevet. I figur 1, er de representative resultater for vellykket genoverføring av GFP og mus sRANKL MC i mus er vist. I figur 2, er de representative bilder av benmarg fra mus eller human PBMC celledifferensiering tidsforløpet kulturer av forløper celler til osteoklaster hos lyse felt mikroskopi er vist. Figur 3, er de representative bildene fra tre uavhengige metoder for karakterisering av musebenmargs avledet osteoklaster vist . Forekomsten av mus sRANKL aktiverer ekspresjonen av TRAP (figurene 3A og B), og dannelse av F-aktin ringene (figurene 3C og D). Scanning elektron mikroskopi (SEM) viser at mus sRANKL induserer dannelsen av gigantiske celler i stand til resorbing bein (Tall 3E og F). Figur 4, de samme karakterisering metoder på menneskers PBMC avledet osteoklaster vises.
Figur 1. SRANKL in vivo geninnkrysning fører til økt osteoclastogenesis. Anterior visning av A, B) muselever eksplantater og C, D) hele kroppen bilder av 12-ukers gamle C57BL / 6 hannmus injisert med 5 mikrogram av GFP eller sRANKL MC-DNA. Pilen viser GFP uttrykk in vivo i GFP genoverføring mus. RANKL genoverføring mus tjene som ingen bakgrunn fluorescens. Bilder tatt av Maestro 2 Imager, en-dagers post geninnkrysning (rød og grønn deNote bakgrunn og GFP, henholdsvis). E) Plasmid kart over sRANKL MC-DNA-konstruksjon og F) sRANKL nivået i serum analysert ved 1, 5 og 11 dager etter GFP eller sRANKL genoverføring. G) museserum TRACP5b nivå analysert 11 dager etter GFP eller sRANKL genoverføring. Scale barer indikerer 5 mm i A, B, og 10 mm i C, D.
Figur 2. In vitro osteoclastogenesis i både mus og humane cellekultursystemer. Bright-felt mikroskopi av museceller isolert fra benmarg og dyrket i nærvær av 25 ng / ml mus M-CSF, og 30 ng / ml mus sRANKL viser en differensiering Tidsforløpet på dager A), 2 B) 5, og C) 8. Bright-felt mikroskopi av humane celler isolertfra perifert blod og dyrket i nærvær av 25 ng / ml human M-CSF, og 30 ng / ml human sRANKL viser et differensierings tidsforløp på dag D), 4 E) 14 og F) 21. Scale barer indikerer 20 mikrometer.
Figur 3. Generering og karakterisering av mus osteoklaster. TRAP farging (rosa) museceller isolert fra benmarg og dyrket i 6 dager i nærvær av A) 25 ng / ml mus M-CSF, eller B) 25 ng / ml mus M -CSF og 30 ng / ml mus sRANKL. Phalloidin (grønn) og DAPI (blå) fargingen av museceller isolert fra benmarg og dyrket i 8 dager i nærvær av C) 25 ng / ml mus M-CSF eller D) 25 ng / ml mus M-CSF, og 30 ng / ml mus sRANKL som viser dannelsen av Factin ring i multinucleated celler. SEM-mikrofotografier av museceller isolert fra benmarg og dyrket i 8 dager i nærvær av e) 25 ng / ml mus M-CSF, eller F) 25 ng / ml mus M-CSF, og 30 ng / ml mus sRANKL som viser dannelsen av resorpsjons områder på bein som indikert med pilene. Scale barer indikerer 40 mikrometer i AD, og 30 mikrometer i E, F.
Fig. 4. Produksjon og karakterisering av humane osteoklaster. TRAP farging (rosa) av humane celler isolert fra PBMC og dyrket i 15 dager i nærvær av A) 25 ng / ml human M-CSF, eller B) 25 ng / ml humant M- CSF, og 30 ng / ml human sRANKL. Phalloidin (grønn) og DAPI (blå) fargingen av humane celler isolert fra PBMC og dyrket i 19 dager i nærvær av c) D) 25 ng / ml human M-CSF, og 30 ng / ml human sRANKL som viser dannelsen av F-aktin ringene i flerkjernede celler. SEM-mikrofotografier av humane celler isolert fra PBMC, og dyrket i 18 dager i nærvær av e) 25 ng / ml human M-CSF, eller F) 25 ng / ml human M-CSF, og 30 ng / ml human sRANKL som viser dannelsen av resorpsjon områder på bein som indikert med pilene. Skala linjer indikerer 10 mikrometer i A, B, 20 mikrometer i C, D 15 mikrometer i E, F.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Muskel-forholdene er ledende årsakene til sykelighet og uførhet og består av over 150 sykdommer og syndromer; berører om lag 90 millioner amerikanere i dag. Leddbetennelse og bein ødeleggelse er dominerende trekk ved muskel-forhold, blant annet leddgikt og osteoporose. Osteoporose er en tilstand som svekker bein integritet, ofte fører til brudd i benet. Leddgikt er en kronisk, svekkende sykdom karakterisert ved betennelse i leddene som blir hovne, ømme og stive begrensende normal bevegelse og kan føre til uførhet. Selv om patogenesen av muskel-og skjelettsykdommer i stor grad skiller seg fra hverandre, er bein ødeleggelse overordnet felles trekk. Bein ødeleggelse i muskel-forhold er primært forårsaket av en ubalanse mellom benresorpsjon og beindannelse 21,22. En terapeutisk tilnærming er å forsøke å blokkere evnen til disse cellene for å ødelegge ben
In vivo-modellen beskrevet her bruker minicircles, som er små episomal DNA vektorer (~ 4KB) frigjort fra bakteriell ryggrad, som også fungerer som transgene bærere 24. Minicircles uttrykke transgener 10-1,000 ganger høyere enn normal bakterie plasmider med et stabilt uttrykk for opptil flere måneder. Den mindre molekylstørrelsen minicircles bidrar til mer effektiv transfeksjon rente og betydelig uttrykk i forhold til normal bakterie plasmider 24. Derfor er minicircles nå mye brukt i pre-kliniske genoverføring studier 25,26. Hydrodynamisk levering er en godt utviklet metode basert på hydrodynamisk trykk i kapillærene å levere plasmid DNA inn i hele kroppen av en mus. Hydrodynamisk genet levering til hepatocytter via haleveneinjeksjon i mus er veletablert to uttrykke transgen av plasmid DNA seks. I disse studiene er overekspresjon mus sRANKL i in vivo mus modell oppnås ved sRANKL MC og hydrodynamisk levering via halen vein injeksjoner. Mus sRANKL ELISA kan brukes til å detektere serumnivåer av RANKL i mus. Betydelig heving av museserum TRACP5b, en benresorpsjonsmarkør 27, er observert i sRANKL genoverføring mus. Spesielt, er denne teknikken ikke begrenset til overekspresjon av sRANKL; det kan også bli ytterligere anvendt for å overuttrykker andre utskilte proteiner 28. Den primære tekniske problemer i denne fremgangsmåten er den hydrodynamiske levering via halevenen. Bortsett fra vanlig halevenen injeksjon, hydrodynamisk levering krever levering av minicircles i store volumer av fysiologisk oppløsning i mus i løpet av 5-7 sek. Dermed jevn håndtering og injeksjonsteknikker er avgjørende for å lykkes med denne prosedyren. Genererer sRANKL transgene mus er en annen tilnærming til in vivo osteoclastogenesis. Imidlertid kan et høyt nivå av sRANKL føre til embryonisk letalitet 4 og generere transgene mus er også kostbart og tidkrevende.
I OVX gnagermodellen, både inflammatoriske cytokiner som TNF, IL-1 og IL-6-og ikke-inflammatoriske cytokin sRANKL bidrar til in vivo osteoclastogenesis og bentap. sRANKL genoverføring modell fører til overekspresjon av bare den ikke-inflammatorisk cytokin sRANKL. Derfor sRANKL genoverføring modellen som beskrives her har forskere et kraftig verktøy for å undersøke bidraget av RANKL-RANK-aksen i omforming av ben i fravær av inflammasjon.
En in vitro osteoklast kultur-metoden, som innebærer co-dyrking benmargceller og osteoblaster, ble etablert på slutten av 1980-tallet før oppdagelsen av RANKL i slutten av 1990 er 29,30. Rekombinant M-CSF og RANKL indusere osteoklast differensiering effektivt in vitro ennd metoden har tidligere blitt beskrevet i andre studier 3,31. M-CSF er kjent for å stimulere RANK uttrykk i tidlig osteoclast forløpere 32 og å fungere som en overlevelsesfaktor for osteoclast forløpere og modne osteoklaster 33. RANKL er avgjørende for osteoklast differensiering og aktivering tre. Her er fremgangsmåten for in vitro osteoclastogenesis beskrevet. Vellykket dyrking og differensiering av forløperceller til osteoklaster krever sterile celleisolasjon og riktig pletteringsteknikker, så vel som forsiktig forståelsen av tidsinnstilt celle innhøsting. Beregnet plating av cellene er avgjørende fordi osteoklast differensiering krever fusjon av osteoclast forløper celler 34 og en utilstrekkelig antall osteoclast forløper celler vil ikke legge til rette for fusjon og differensiering av forløper celler i osteoklaster. Tilsvarende, et overskytende antall osteoclast forløper celler, fører til å klumpe seg dannelsen og eventuell celledød. Fjerning av non-heftende celler 2 timer etter plating cellene kan hjelpe opprettholde en optimal celle nummer. Endelig er den tiden av celleinnhøstningsutstyr avgjørende som osteoklaster er terminalt differensiert kortvarige celler med en levetid på ca 48 hr 35. Således bør cellene høstes i løpet av 48 timer etter den første observasjon av flerkjernede celler. Disse cellene kan deretter bli preget av TRAP-og F-aktin farging ved immunhistokjemi og resorpsjon aktivitet kan påvises ved scanning-elektronmikroskopi (SEM) ben. Disse eksperimentelle tilnærminger mulig klar definisjon av osteoklaster i form av deres fenotype og funksjon.
Den in vivo og in vitro teknikker som er beskrevet her vil lette utviklingen av osteoclast hemmere for tiden i pre-kliniske studier, som fører til effektive terapeutiske strategier for de millioner av osteoporose og leddgikt pasienter over hele verden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
| Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
| Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
| Human RANK-Ligand - soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
| Mouse RANK-Ligand - soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
| Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
| Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
| MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |
References
- Yelin, E. Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline. The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).
- Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease. European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Mizuno, A., et al. Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis. Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).
- Bucay, N., et al. osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification. Gene., & development. 12, 1260-1268 (1998).
- Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).
- Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton. Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).
- Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats. Bone. 25, 687-695 (1999).
- Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).
- Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women. The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).
- Hughes, D. E., et al. Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta. Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).
- Kousteni, S., et al. Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity. Cell. 104, 719-730 (2001).
- Ominsky, M. S., et al. RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).
- Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice. The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).
- Weitzmann, M. N., Pacifici, R. Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale. The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).
- Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N.
- Asagiri, M., Takayanagi, H. The molecular understanding of osteoclast differentiation. Bone. 40, 251-264 (2007).
- Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).
- Adamopoulos, I. E., et al. Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption. The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).
- Adamopoulos, I. E., et al. Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors. Arthritis researc., & therapy. 12, (2010).
- Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection. J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).
- Sato, K., Takayanagi, H. Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology. Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).
- Das, S., Crockett, J. C. Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment. Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).
- Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. A robust system for production of minicircle DNA vectors. Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo. Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).
- Halleen, J. M., et al. Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).
- Adamopoulos, I. E., et al. IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass. J Immunol. 187, 951-959 (2011).
- Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J.
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).
- Fuller, K., et al. Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts. The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).
- Edwards, J. R., Mundy, G. R. Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models. Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).
- Weinstein, R. S., et al. Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids. The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).
