Introduction
Enfermedades musculoesqueléticas afectan a millones de personas en los Estados Unidos y del presente graves consecuencias para los sistemas de salud nacionales y locales 1. Estos trastornos se caracterizan por la pérdida de hueso y función de las articulaciones que requieren tratamiento extenso y largos períodos de recuperación. Comúnmente, un aumento relativo en el número y / o actividad de los osteoclastos, células especializadas para reabsorber el hueso, en la osteoporosis y la artritis se observa 2. En condiciones fisiológicas el número y la actividad de los osteoclastos está regulada por el activador del receptor del factor nuclear κ-B ligando (RANKL), que es producida por los osteoblastos. La osteoprotegerina (OPG), un receptor señuelo para RANKL también es producida por los osteoblastos 3 modelos animales in vivo que implican la sobreexpresión sistémica de sRANKL, o supresión de OPG son muy valiosa en la investigación de la osteoporosis.; Sin embargo, estos métodos requieren la generación de ratones transgénicos 4,5. Aquí, una nueva alternativamétodo de sobreexpresar sRANKL para el estudio de los trastornos musculoesqueléticos relacionados-se describe. Específicamente, minicircle (MC) la tecnología del ADN y los métodos de entrega hidrodinámicas se utilizaron para lograr la transferencia de genes de sRANKL in vivo e sobreexpresan ratón sRANKL sistémicamente 6.
Este método también es complementaria a otros modelos in vivo de la osteoporosis, tales como la modulación hormonal de los osteoclastos siguientes ovariectomía 7 y la intervención dietética con dieta baja en calcio 8. Estos modelos son muy útiles para estudiar diferentes aspectos de los trastornos musculoesqueléticos relacionados-sin embargo, requieren de procedimientos quirúrgicos y pueden durar hasta varios meses, a un costo significativo 9. Ovariectomizadas (OVX) modelo de roedores es un modelo animal experimental en que la extirpación de los ovarios conduce a la deficiencia de estrógenos imitando así la osteoporosis posmenopáusica humana 10. La osteoporosis post-menopáusica humana, una condición donde Defici estrógenoparencia conduce a un mayor riesgo de fracturas óseas y la osteoporosis afecta a aproximadamente ocho millones de mujeres en los Estados Unidos solamente. Aunque el modelo OVX es útil para la osteoporosis post-menopáusica que ofrece ventajas limitadas en el estudio de la osteoporosis en general. El estrógeno suprime la pérdida de hueso, mediante la inducción de osteoclastos y la inhibición de la apoptosis de los osteoblastos, por lo tanto, en su ausencia se observa un aumento de la actividad de los osteoclastos 10-12. Un desequilibrio en la relación RANKL-OPG que favorece la resorción ósea también se observa 13. Sin embargo, la deficiencia de estrógenos en vivo también se acompaña de disminución de los niveles de transformación del factor de crecimiento β (TGF β), aumento de la interleucina-7 (IL-7) y de TNF, IL-1 e IL-6 14,15. Como estas citoquinas han conocido funciones moduladoras de remodelación ósea independiente de la vía de RANKL, es imposible atribuir cualquier activación de los osteoclastos exclusivamente al eje RANKL-RANK. El modelo que se describe en este documento permite a los investigadores estudiar en vivo eje RANKL a RANK en la osteoclastogénesis y la pérdida ósea sin las citoquinas pro-inflamatorias en comparación con modelos de roedores OVX.
Además, las técnicas de la osteoclastogénesis in vitro son herramientas esenciales para el estudio de la activación de los osteoclastos para posibles tratamientos terapéuticos de las enfermedades musculoesqueléticas. Estudios anteriores también han demostrado que el cultivo de macrófagos derivados de médula ósea de ratón (BMMs) con macrófagos de ratón factor estimulante de colonias (M-CSF) y el ratón sRANKL puede conducir a la diferenciación de los osteoclastos 3,16,17. Aquí se describen los protocolos para generar células similares a osteoclastos multinucleadas de médula ósea de ratón, así como de células de sangre periférica humana (PBMC) in vitro 18. Los ensayos basados en células necesarios para definir un osteoclastos terminales diferenciadas y completamente funcional madura también se describen brevemente. Estas técnicas in vitro complementan la novela en el enfoque vivo y juntos sirven como pherramientas de investigación para estudiar owerful diferenciación de los osteoclastos y la activación. El uso de estos sistemas, los científicos son capaces de generar los osteoclastos in vivo e in vitro y definir los estímulos y señales requeridas para su proliferación y activación, así como probar la eficacia de los inhibidores farmacológicos y biológicos.
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Protocol
1. Entrega hidrodinámico de ADN MC sRANKL
- Entrega hidrodinámica a través del ratón de la cola de la vena
- Pesar el ratón antes de la inyección en la vena de la cola. Diluir sRANKL o proteína fluorescente verde (GFP) MC en solución de Ringer (pre-calentamiento a 37 ° C) en un volumen total de ~ 10% del peso corporal del ratón.
- Caliente el ratón en una jaula durante 10 min antes de la inyección con el fin de dilatar los vasos sanguíneos y hacer que las venas laterales (LVs) visibles. Monitorear el ratón con cuidado para evitar la deshidratación y la hipertermia.
- Tan pronto como los volúmenes lógicos están dilatados y visibles, transferir el ratón a la inmovilización e inserte el conector lo suficiente en el barril para restringir el movimiento. Monitorear el ratón para la actividad normal, como la respiración. Ajuste el tapón de inmovilización, si es necesario.
- Desinfectar el área de la inyección de 3/4 de la punta de la cola con un algodón con alcohol. Utilice una aguja de 27 a 30 para el ratón inyección en la vena de la cola. Sostenga la cola firmemente con una mano e inserte la aguja ena la vena de la cola. Aplique presión sobre la jeringa y completar la inyección dentro de 5-7 seg.
- Retire la aguja de la vena de la cola y aplique presión con un algodón sobre el lugar de la inyección para detener el sangrado. Monitorear el ratón durante 15-30 minutos, a continuación, transferir el ratón de nuevo a vivarium una vez que el ritmo de la respiración se reduce a su ritmo normal.
- Confirmación de la expresión y cuantificación de Ratón Serum TRACP5b Mensaje Gene Transfer sistémica Ratón sRANKL
- Caliente el ratón en una jaula durante 5-10 minutos con el fin de dilatar los vasos sanguíneos y hacer LV visible. Monitorear el ratón con cuidado para evitar la deshidratación y la hipertermia.
- Hacer una pequeña incisión con una cuchilla a la cola del ratón en un sitio de una cuarta parte de la punta de la cola.
- Recoge alrededor de 100 l de sangre en tubos de separación de suero.
- Incubar los tubos de separación de suero a temperatura ambiente durante 30 min.
- Centrifugar las muestras a 10.000 xg durante 5 min y recoger el suero. Store suero en -80 ° C para su posterior análisis.
- Realizar sRANKL ELISA y ensayo de TRACP5b suero de ratón en muestras de suero utilizando un kit comercial disponible.
2. In vitro generación de osteoclastos de Ratón BMMs
- Aislamiento y cultivo de BMMs
- El aislamiento de la tibia y los huesos de fémur: La eutanasia el ratón donante con CO 2, y desinfectar las piernas con etanol al 70%. Diseccionar desde el pubis hasta el hueso calcáneo, para quitar los huesos fémur y la tibia intacta.
- Quite la piel y el músculo cuidadosamente sin dañar el hueso. Coloque fémur procesado y hueso de la tibia en una placa de Petri que contiene tampón fosfato salino (PBS).
- La eliminación de la médula ósea: Corte la punta en un lado de los huesos del fémur y de la tibia y enjuagar la médula ósea en un tubo de 50 ml utilizando una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 25, cargado con α-MEM que contiene 1% de penicilina / estreptomicina (osteoclastos Cultura Medio / OCM).
- Cultura de los macrófagos
- Contar las células utilizando un hemocitómetro o un contador automático de células.
- Plate 1 x 10 6 células por pocillo en una placa de 6 pocillos o 3 x 10 5 células a cubreobjetos de vidrio (5 mm) o rodajas de dentina colocados en placas de 96 pocillos y se incuba a 37 ° C.
- Aspirar todos los medios que contienen las células no adherentes y se incuban las células a 37 ° C con OCM fresca (+) que contiene 25 ng / ml ratón M-CSF durante 48 horas.
- Aspirar todos los medios de comunicación y se incuban las células a 37 ° C con frescos OCM (+) un medio que contenía 25 ng / ml ratón M-CSF, y 30 ng / ml sRANKL ratón para iniciar la osteoclastogénesis. Reponer los medios de comunicación cada 3 días según sea necesario.
- Se cultivan las célulasdurante aproximadamente 6-8 días para formar células multinucleares gigantes capaces de resorción ósea. En cuanto aparezcan células multinucleadas, realice TRAP (fosfatasa ácida resistente al tartrato) tinción utilizando un kit comercial disponible, y cuando está completamente madura, realizar ensayos funcionales. Visualizar anillos de actina F en cubreobjetos utilizando mancha faloidina y la imagen de las células unidas a la dentina rebanadas por microscopía electrónica de barrido (SEM) como se ha descrito previamente 19.
3. Generación de osteoclastos in vitro de las PBMC humanas
- Aislamiento de PBMC humanas
- Añadir 10 ml de pre-calentado Histopaque-1077 en un tubo de 50 ml.
- Filtro de leucocitos vacío obtiene a partir del banco de sangre con PBS estéril en un tubo de 50 ml (proporción de 1:1 de sangre con PBS). Capa de la sangre diluida sobre la solución Histopaque muy lentamente, asegurándose de que la sangre no se mezcla con el histopaque.
- Centrifugar las muestras a 1000 xg durante 20 min a 18 ° C. Seguiring centrifugación, aislar cuidadosamente la capa de la capa leucocitaria blanca que contiene las células blancas de la sangre y transferir a un nuevo tubo de 50 ml.
- Diluir las células con PBS y se centrifuga de nuevo a 650 xg durante 5 minutos para recoger las células.
- Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en OCM (-) de los medios y contar las células utilizando un contador de células.
- Plating y cultivo de CMSP
- Resuspender las células en las OCM (+) los medios de comunicación y la placa de 8 x 10 6 células / ml por pocillo en una placa de 6 pocillos o 1 x 10 6 células / ml por pocillo en placas de 96 pocillos. Las células de la placa sobre cubreobjetos de vidrio (5 mm) según se requiera para obtener imágenes de inmunofluorescencia, así como en secciones de hueso adecuados para ensayos de resorción ósea como anteriormente descritos 20.
- Cambio de los medios de cultivo, la reposición de las células con M-CSF humano cada 2-3 días o según sea necesario. A continuación, proceder a la etapa de diferenciación en el día 5 por la adición de 30 ng / ml de sRANKL humana junto con 25 ml de M-CSF ng / humano en OCM (+) medios para iniciar osteoclastogeneses.
- Se cultivan las células durante aproximadamente 14 a 21 días para formar células multinucleares gigantes. Tan pronto como aparecen células multinucleadas, a continuación, estas células se pueden etiquetar para TRAP, y cuando está completamente madurado, ensayos funcionales pueden llevarse a cabo. Anillos de actina F se pueden visualizar en cubreobjetos utilizando tinción phalloidin. La morfología de las células puede examinarse en células unidas a la dentina rebanadas por SEM.
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Representative Results
Aquí, una técnica de transferencia de gen nuevo para la diferenciación de los osteoclastos in vivo y protocolos de cultivo de células para la diferenciación de células precursoras en los osteoclastos in vitro como un método para estudiar los efectos de las citoquinas en la osteoclastogénesis se describen. En la Figura 1, se muestran los resultados representativos de la transferencia de genes exitosa de GFP y ratón sRANKL MC en ratones. En la Figura 2, se muestran las imágenes representativos de médula ósea de ratón o de diferenciación celular culturas del curso de tiempo de PBMC humanos de las células precursoras de los osteoclastos a por microscopía de campo brillante. Figura 3, las imágenes representativas de tres métodos independientes para la caracterización de médula ósea de ratón osteoclastos derivados se muestran . La presencia de ratón sRANKL activa la expresión de TRAP (Figuras 3A y B) y la formación de anillos de actina F (Figuras 3C y D). Elec ScanningTron microscopía de barrido (SEM) revela que el ratón sRANKL induce la formación de células gigantes capaces de resorción ósea (Figuras 3E y F). Figura 4, los mismos métodos de caracterización en PBMC humanas derivan los osteoclastos se muestran.
Figura 1. SRANKL in vivo de transferencia genética conduce a un aumento de la osteoclastogénesis. Vista anterior de A, B) explantes de hígado de ratón y C, D) imágenes de cuerpo entero de 12-semanas de edad C57BL / 6 ratones machos inyectados con 5 g de GFP o sRANKL ADN MC. La flecha indica la expresión de GFP in vivo en la transferencia de genes de GFP ratón. Ratones de transferencia de gen RANKL sirven como ninguna fluorescencia de fondo. Las imágenes capturadas por el Maestro 2 Imager, un día después de transferencia genética (d rojo y verdefondo enote y GFP, respectivamente). mapa E) El plásmido de sRANKL constructo MC-ADN y F) Nivel sRANKL en el suero analizado en el 1, 5 y 11 días después de la GFP o la transferencia de genes sRANKL. G) Ratón nivel TRACP5b suero analizadas 11 días después de la transferencia del gen GFP o sRANKL. Las barras de escala indican 5 mm en A, B, y 10 mm en C, D.
Figura 2. Osteoclastogénesis in vitro, tanto en sistemas de cultivo de células humanas y de ratón. Microscopía de campo brillante de las células de ratón aisladas de la médula ósea y se cultivaron en presencia de 25 ng / ml de M-CSF de ratón y 30 ng / ml de sRANKL ratón que muestra una diferenciación evolución en el tiempo a los días A), 2 B) 5, y C) 8. La microscopía de campo claro de células humanas aisladasa partir de sangre periférica y se cultivaron en presencia de 25 ng / ml de M-CSF humano y 30 sRANKL humano ng / ml que muestra un curso de tiempo de la diferenciación en el día D), 4 E) 14, y F) 21. Las barras de escala indican 20 micras.
Figura 3. Generación y caracterización de los osteoclastos de ratón. Tinción TRAP (rosa) de células de ratón aisladas de la médula ósea y se cultivaron durante 6 días en presencia de A) 25 ng / ml de M-CSF de ratón o B) 25 ng / ml de ratón M -CSF y 30 ng / ml de sRANKL ratón. Faloidina (verde) y DAPI (azul) tinción de células de ratón aisladas de la médula ósea y se cultivaron durante 8 días en la presencia de c) 25 ng / ml de M-CSF de ratón o D) 25 ng / ml de M-CSF de ratón y 30 ng / ml de sRANKL ratón que muestra la formación de Faanillo ctin en las células multinucleadas. Fotomicrografías de SEM de células de ratón aisladas de la médula ósea y se cultivaron durante 8 días en la presencia de E) 25 ng / ml de M-CSF de ratón o F) 25 ng / ml de M-CSF de ratón y 30 ng / ml de sRANKL ratón que muestra la formación de zonas de resorción en el hueso, como se indica por las flechas. Las barras de escala indican 40 micras de AD, y 30 micras de E, F.
Figura 4. Generación y caracterización de los osteoclastos humanos. Tinción TRAP (rosa) de células humanas aisladas a partir de PBMC y se cultivaron durante 15 días en la presencia de a) 25 ng / M-CSF humano ml o B) 25 ng / ml de M-humana CSF y 30 sRANKL humano ng / ml. Faloidina (verde) y DAPI (azul) tinción de células humanas aisladas a partir de PBMC y se cultivaron durante 19 días en presencia de C) D) 25 ng / ml de M-CSF humano y 30 ng / ml de sRANKL humana que muestra la formación de anillos de F-actina en células multinucleadas. Fotomicrografías de SEM de células humanas aisladas a partir de PBMC y se cultivaron durante 18 días en la presencia de E) 25 ng / M-CSF humano ml o F) 25 ng / ml de M-CSF humano y 30 ng / ml de sRANKL humana que muestra la formación de la resorción áreas sobre el hueso, como se indica por las flechas. Las barras de escala indican 10 micras de A, B, 20 micras de C, D 15 micras de E, F.
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Discussion
Las afecciones musculoesqueléticas son las principales causas de morbilidad y discapacidad, y se componen de más de 150 enfermedades y síndromes; que afecta hoy a unos 90 millones de estadounidenses. Inflamación de las articulaciones y la destrucción ósea son las características predominantes de los trastornos musculoesqueléticos, como la artritis y la osteoporosis. La osteoporosis es una enfermedad que debilita la integridad ósea, a menudo conduce a las fracturas de los huesos. La artritis es una enfermedad crónica caracterizada por la inflamación de las articulaciones que se inflaman, tierno y el movimiento normal de dura la restricción y pueden conducir a la discapacidad debilitante. Aunque la patogénesis de las enfermedades musculoesqueléticas difiere en gran medida una de otra, la destrucción ósea es la característica común general. La destrucción ósea en enfermedades musculoesqueléticas es causada principalmente por un desequilibrio entre la resorción ósea y la formación ósea 21,22. Un enfoque terapéutico es para tratar de bloquear la capacidad de estas células para destruir el hueso
El modelo in vivo descrito aquí utiliza minicircles, que son pequeñas vectores episomales de ADN (~ 4kb) liberados de la columna vertebral bacteriana, que también sirven como portadores de transgenes 24. Minicircles expresan transgenes 10-1.000 veces superior a continuación, plásmidos bacterianos normales con una expresión estable durante hasta varios meses. El tamaño molecular más pequeño de minicircles contribuye a la tasa de transfección más eficaz y la expresión sustancial comparar con plásmidos bacterianos normales 24. Por lo tanto, minicircles son ampliamente aplicadas en los estudios de transferencia genética pre-clínicos 25,26. Entrega hidrodinámica es un método bien desarrollado sobre la base de la presión hidrodinámica en los capilares para entregar ADN plásmido en todo el cuerpo de un ratón. La entrega de genes hidrodinámica de los hepatocitos a través de inyección en la vena de la cola en ratones es bien establecida to expresar los transgenes por el plásmido de ADN 6. En estos estudios, la sobreexpresión de ratón sRANKL en el modelo in vivo de ratón en se logra por sRANKL MC y entrega hidrodinámico a través de inyecciones en la vena de la cola. Ratón sRANKL ELISA se puede utilizar para detectar los niveles séricos de RANKL en ratones. Elevación significativa de TRACP5b suero de ratón, un marcador de la resorción ósea 27, se observa en los ratones de transferencia de genes sRANKL. En particular, esta técnica no se limita a la sobreexpresión de sRANKL; También se puede aplicar más para sobreexpresar otras proteínas secretadas 28. La dificultad técnica principal en este procedimiento es la entrega hidrodinámico a través de la vena de la cola. Además de inyección regular vena de la cola, la entrega hidrodinámico requiere la entrega de minicircles en grandes volúmenes de solución fisiológica en los ratones dentro de 5-7 seg. Por lo tanto, las técnicas de manipulación e inyección constante son esenciales para el éxito con este procedimiento. Generación de ratones transgénicos sRANKL es otro enfoque para osteoc in vivolastogenesis. Sin embargo, un alto nivel de sRANKL puede conducir a la letalidad embrionaria 4 y la generación de ratones transgénicos también es caro y consume mucho tiempo.
En el modelo de roedores OVX, ambas citoquinas inflamatorias tales como TNF, IL-1 e IL-6 y los sRANKL no inflamatorias de citoquinas contribuyen a la osteoclastogénesis in vivo y la pérdida de hueso. sRANKL modelo de transferencia de gen conduce a la sobreexpresión de sólo el sRANKL no inflamatoria de citoquinas. Por lo tanto, el modelo de transferencia de genes sRANKL describe aquí ofrece a los investigadores una herramienta poderosa para examinar la contribución de los eje-RANKL a RANK en la remodelación ósea en ausencia de inflamación.
Un método de cultivo de osteoclastos in vitro, que implica co-cultivo de células de la médula ósea y los osteoblastos, se estableció a finales de 1980, antes del descubrimiento de RANKL a finales de 1990 de 29,30. Recombinante M-CSF y RANKL inducen la diferenciación de los osteoclastos in vitro de manera eficiente unND el método ha sido descrito previamente en otros estudios 3,31. M-CSF se sabe que estimula la expresión de RANK en los precursores de osteoclastos primeros 32 y para actuar como un factor de supervivencia para los precursores de osteoclastos y los osteoclastos maduros 33. RANKL es esencial para la diferenciación y activación de osteoclastos 3. Aquí, se describe el método de la osteoclastogénesis in vitro. Cultivo con éxito y diferenciación de las células precursoras de los osteoclastos requieren aislamiento de células estériles y técnicas de recubrimiento adecuados, así como la comprensión cuidadosa de cosecha de células cronometrado. Calculado chapado de las células es crucial, ya que la diferenciación de osteoclastos requiere la fusión de las células precursoras de los osteoclastos 34 y un número insuficiente de células precursoras de osteoclastos no facilitará la fusión y diferenciación de células precursoras en los osteoclastos. Del mismo modo, un número excesivo de células precursoras de osteoclastos, conduce a la formación de grumos y eventual muerte celular. La eliminación de la nocélulas adherentes 2 horas después de la siembra de las células puede ayudar a mantener un número celular óptimo. Por último, el momento de la cosecha de células es crucial, ya que los osteoclastos son células terminalmente diferenciadas de vida corta con una vida útil de aproximadamente 48 horas 35. Por lo tanto, las células deben ser cosechados dentro de 48 horas después de la primera observación de células multinucleadas. Estas células pueden entonces ser caracterizados por TRAP y tinción de actina F por inmunohistoquímica y actividad de resorción de hueso puede ser detectado por microscopía electrónica de barrido (SEM). Estos enfoques experimentales permiten definición clara de los osteoclastos en términos de su fenotipo y la función.
La in vivo e in vitro, técnicas aquí descritas facilitarán el desarrollo de inhibidores de osteoclastos actualmente en los estudios pre-clínicos, que lleva a estrategias terapéuticas eficaces para los millones de osteoporosis y pacientes con artritis en todo el mundo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
| Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
| Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
| Human RANK-Ligand - soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
| Mouse RANK-Ligand - soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
| Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
| Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
| MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |
References
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