Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Multimodal שיטות מיקרוסקופית אופטיות לחשוף רקמות מורפולוגיה ומבנה פוליפ בקריביים אלמוגי בניית ריף

doi: 10.3791/51824 Published: September 5, 2014

Summary

חבילה משולבת של טכניקות הדמיה יושמה כדי לקבוע מורפולוגיה פוליפ ומבנה רקמה בannularis Montastraea אלמוגי האיים הקריביים ומ ' faveolata. הקרינה, פנים בלוק סדרתי, ומיקרוסקופ סריקת לייזר confocal שני פוטונים זיהו מבנה lobate, קירות פוליפ, וchromatophore מוערך וצפיפויות zooxanthellae והפצות.

Abstract

חבילה משולבת של טכניקות הדמיה יושמה כדי לקבוע את המורפולוגיה תלת ממדים (3D) ומבנה תאי של רקמות פוליפ המרכיב את annularis Montastraea אלמוגי בניין שונית קריביים ומ ' faveolata. גישות אלה כוללות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (FM), פנים בלוק סידורי הדמיה (SBFI), ושני הפוטונים במיקרוסקופ לייזר confocal סריקה (TPLSM). SBFI מספק הדמיה רקמות עמוקה לאחר חתך פיזי; זה מפרט את מרקם רקמת פני השטח והדמיית 3D למעמקי רקמות של יותר מ 2 מ"מ. תמונות FM המשלים ותשואת TPLSM רזולוציה גבוהה במיוחד של מבנה תאי של רקמה. תוצאות: (1) זיהו מורפולוגיות רקמת lobate לא פורסם בעבר על הקיר החיצוני של פוליפים אלמוגים בודדים ו( 2) יצר את מפות השטח הראשונות של צפיפות הפצת 3D ורקמות של chromatophores וendosymbionts zooxanthellae dinoflagellate כמו אצות. אפונה קליטת ספקטרליks של 500 ננומטר ו675 ננומטר, בהתאמה, מצביע על כך שמ ' annularis ומ ' faveolata מכיל סוגים דומים של כלורופיל וchromatophores. עם זאת, מ ' annularis ומ ' faveolata להציג הבדלים משמעותיים בצפיפות הרקמה והפצת 3D של מרכיבים התאיים מפתח אלה. מחקר זה מתמקד בשיטות הדמיה מצביע על כך שSBFI הוא מאוד שימושי עבור ניתוח של דגימות מ"מ בקנה מידה גדולות של רקמות אלמוגי decalcified. FM טיפוח וTPLSM לחשוף עדינים שינויים בקנה מידה submillimeter בהפצה וצפיפות תאיות בדגימות רקמת אלמוגי nondecalcified. טכניקת TPLSM מקנה: (1) הכנה פולשנית מדגם, (2) יכולת חתך אופטית מעולה, ו (3) קליטת אור מינימאלית ופיזור, בזמן שעדיין מאפשר הדמיה רקמות עמוקה.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

התחממות כדור הארץ ושינוי סביבתי נלווה באופן ישיר משפיעים על הבריאות והפצה של אלמוגים ימיים הטרופיים 1-4. השפעות מרובות נתונים למעקב, כולל הלבנת אלמוגים ואת הופעתה של מחלות זיהומיות 5-6. עם זאת, חיזוי מדויק יותר של תגובת אלמוגים בעתיד לאיומים הסביבתיים האלה ידרוש מ" קו בסיס "היסטולוגית יוקם, המגדיר את מורפולוגיה רקמות והרכב תא והפצה לאלמוגים" בריאים לכאורה ". בתורו, "השפיע" אלמוגים אז יכולים להיות בהשוואה כמותית. יתר על כן, נקודת התחלה זו יש לקבוע לאלמוגים בריאים לכאורה תחת מגוון רחב של תנאים סביבתיים, כך ש" תגובה בריאה "יכולה להיות גם תעיד על פני מילויים סביבתיים. כצעד ראשון להקמת קו בסיס זה, מחקר 3D ברזולוציה גבוהה כבר התחייב לאופן שככל הנראה רקמת פוליפ אלמוגים בריאיםמורפולוגיה והרכב סלולארי מגיבים לעליות בעומק מים (WD) וירידות המלוות בקרינת אור שמש. תוצאות לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להקים הבנת מכניסטית מקיפה יותר של הסתגלות אלמוגים, כמו גם כדי לקבל תובנה האבולוציה אלמוגים-הסימביונט והשיפור של קצירת אור.

אלמוגי אבן (Scleractinia) הם בעלי חיים חסרי חוליות ימיות קולוניאליים שישחקו לארח מכלול מורכב של מיקרואורגניזמים אחרים, המכונה באופן קולקטיבי האלמוגים holobiont 7-10. המחקר שנעשה במחקר הנוכחי מבקש להשתמש חבילה של טכנולוגיות הדמיה החדשנית כדי לעקוב אחר שינויים בו זמנית עם עומק הגדלת מים בפיגמנטים הרקמה וzooxanthellae הסימביוטי של אלמוגי מארח בריאים לכאורה. זה יקימו "קו הבסיס" תא רקמה השוואתית הנדרש על פני שיפוע מדידת עומק לאלמוגים בריאים לכאורה ולפעול כמדדים של חימום אלמוגיםLTH 10. פיגמנטים אלמוגים, chromatophores נקרא, לפעול לקליטה, משקפים, פיזור, לשבור, diffract, או להתערב בדרך אחרת עם קרינת שמש תקרית 11. יחסי endosymbiotic zooxanthellae-chromatophore אפשרו האבולוציה המשותפת של אופטימיזציה אור קציר יתרון אסטרטגי ואסטרטגיות צמיחת שלד, כמו גם גמישות טרופית (אסטרטגיות ציד הסטה קדימה ואחורה מautotrophy לheterotrophy) לבעלי חי האלמוגים 12.

האומה דרום האיים הקריביים האי קוראסאו (לשעבר חלק מהאנטילים ההולנדיים) שוכנת כ 65 קילומטר צפוני ונצואלה בתוך ממזרח למערב במגמת ארכיפלג (איור 1 א) ארובה-La Blanquilla. החוף הדרומי הארוך 70 קילומטר קוראסאו מכיל מערכת שונית אלמוגים רצופה מודרנית והמיוקן-הפליוקן-הפלייסטוקן-ההולוקן fringing העתיק 13,14. אומר SST השנתי על קוראסאו משתנה כ 3 ° Cnually, הנע בין מינימום של 26 מעלות צלזיוס בסוף ינואר למקסימום של 29 ° C בתחילת ספטמבר, עם טמפרטורה שנתית ממוצעת של 27.5 ± 0.5 ºC (NOAA SST נתונים סטים, 2000-2010). שונית האלמוגים בPlaya Kalki (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), שוכבת ליד הקצה הצפון מערבי של קוראסאו (איור 1 א), נבחרה לדגימה כי זה כבר בעבר גם נלמד ו המערכת האקולוגית ימית במיקום זה היא טובל במי ים 7,15-19 nonpolluted טריים. . שני מינים קרובים scleractinian אלמוגים, annularis מ 'וM faveolata, נבחרו לניסויים וניתוח במחקר זה, כי כל מין: (1) חלוקת מדידת עומק מוצגים שונה וnonoverlapping מובהקות על מערכת השונית ביחס להפסקה והמדף סביבות הצטברות משקע פחמה קשורות (טווח annularis מ = 0-10 מ 'WD; faveolata מ'טווח = 10-20 מ 'WD 20; 1B דמויות, 2A, 2B ו); (2) הוא בונה מסגרת שונית אלמוגים נפוצים בכל הים הקריבי 21; ו (3) חקר היטב אקולוגי, פיסיולוגי, ויחסים האבולוציוניים 22.

דגימת שדה למחקר הנוכחי נערכה תוך שימוש בטכניקות צלילה סטנדרטית מהחוף של Playa Kalki בקוראסאו. חתך מדידת עומק מים רדוד לעמוק נקבע כי חצו בריצה את המדף, על הפסקת המדף, ולתוך סביבות שונית קדמי מים עמוקות. כנראה ראשי אלמוגים בריאים לאחר מכן זיהו לדגימה לאורך חתך מדידת עומק זה, ובכלל זה: (1) שלוש בודד ~ 1 מ 'ראשי אלמוגים בקוטר של מ' annularis, שכולן היו בשעה 5 מ 'עומק מים (WD); ו (2) שלושה בודדים ~ 1 מ 'ראשי אלמוגים בקוטר של מ' faveolata, שכולן היו ב12 מ WD. קרינה פעילה Photosynthetically (PAR) נמדדה כ33-36% P AR ב 5 מ 'WD וPAR% 18-22 ב10 מ WD. דגימה התבצעה בחודש ינואר כאשר SST היה 26 ° C במעמקי המים של שני מ '5 מ' ו12. כל אחד מששת ראשי האלמוגים אלה ידגם בשלושה עותקים בעמדות מרחבי מקבילים (כלומר., 45 כ ° קו רוחב N בכל אחד מששת ראשי האלמוגים חצי כדור). כל דגימה בודדת מורכבת מביופסית 2.5 סנטימטר קוטר אלמוגי רקמות שלד ליבה שנאסף עם אגרוף קשת ניקה. שלוש ביופסיות רקמות שלד אלמוגי נדגמו בצלילה רגילה עם ידיים בכפפות מכל אחד מראשי האלמוגים (9 מ 'מannularis מושבות ב5 מ WD ו -9 ממ faveolata ב12 מ WD). מייד עם אוסף בעומק, כל דגימת ליבת הביופסיה הוצבה בצינור צנטריפוגות פוליפרופילן 50 מ"ל סטרילי, בורג העליון אטום, וחזר אל פני השטח. מי הים היה יצק מכל צינור צנטריפוגות וכל ביופסיה ליבה הייתה שקוע אז, מאוחסנת, ומועברת בparaformaldehyde 4%.

"Jove_content"> ההדמיה SBFI כבר בעבר בוצע על מגוון רחב של דגימות ביולוגיות, כוללים מוח כולו ורקמות אנושיות כולו לב, עוברי עכבר ללא פגע, עוברי דגי זברה, וסוגים רבים של דגימות של בעלי חיים עם עצמות שלמות 23-30. רוב המחקרים הללו מנוצלים אופטי מיקרוסקופ אור / עם או הקרינה או טכניקות שדה בהירות. עם זאת, מחקרים שנערכו בהגדלה גבוהה במיוחד תוך שימוש באלקטרונים סורק בלוק סדרתי פנים הדמיה ביום 31 בעבר. במחקר הנוכחי, פרוטוקול SBFI שונה פותח ולמוחל על אלמוגים בפעם הראשונה. כי מ ' annularis ומ ' פוליפים אלמוגי faveolata הם 1-2 מ"מ עובי, אף אחד משיטות מיקרוסקופיה אור השגרה יהיה מסוגל לחדור את כל העובי של רקמת פוליפ האלמוגים. לכן, יש לנו פרוטוקול הכנת מדגם SBFI שתוכנן במיוחד עבור דגימות אלמוגים. בנוסף, יש לנו מנהג שנועד בעל סטראו, אשר ממונע לנוע בשני כיווני x ו y. מנגנון זה לוקח תמונות של הפנים הבלוק של המדגם ולא איסוף החלקים באמצעות microtome רגיל מול מיקרוסקופ. אנחנו גם הצגנו טכניקה נוספת אופטית קוי שני פוטונים מיקרוסקופיות לתמונה אותה הפוליפים אלמוגים בכל העובי של רקמות האלמוגים. זה מתגבר על המגבלות שהוטלו על ידי SBFI במונחים של decalcification ואפשרות לשינויים במורפולוגיה רקמות ונפח (התכווצות) שעלול להיגרם על ידי הכנת מדגם (התייבשות) ופרוטוקולי עיבוד. יתר על כן, פרופילי הפליטה מהאלמוגים היו ספקטרלי החליטו לזהות את פליטת השיא והווריאציות שלהם בין chromatophores וzooxanthellae הפוטוסינתזה. תוצאות אלו הוערכו בהקשר של השיטה והיתרונות האישיים שלהם בנוגע לזמן רכישה, זמן ניתוח, ואת היכולת לפתור פרטים מבניים בסדר מבלי להתפשר על strשלמות uctural של רקמת האלמוגים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הערה: ריאגנטים להיות מוכנים לבלוק סידורי פנים הדמיה של דוגמאות אלמוג

.1 Preinfiltration שעווה

  1. ממסים 3.6 גרם של פתיתי שעוות בכוס זכוכית. מערבבים היטב על צלחת חמה (60-70 ° C).
  2. הוספת 400 מ"ג של סודאן IV (כדי למזער את הקרינה רקע שעווה). מערבבים היטב ולהמתין עד לפתרון שקוף אדום מושגת.
  3. הוספת פרפין 96 מ"ל החם המותך (100%) ומערבבים היטב.

1.2) הטבעת שעווה

  1. ממסים 7.2 גרם של פתיתי שעוות בכוס זכוכית ומערבבים היטב על צלחת חמה (60-70 ° C).
  2. הוספת 0.8 גרם של סודאן IV. מערבבים היטב ולהמתין עד לפתרון שקוף אדום מושגת.
  3. הוספת גרגירי פרפין (162 ז) ומערבבים עד שנמס לחלוטין פרפין.
  4. הוסף 30 גרם של Vybar גרגרים הלבן ולהמס לחלוטין באותה הכוס; פעם אחת נמס, לערבב.
  5. באופן רופף לסגור את בקבוק הזכוכית עם מכסה. מניחים את בקבוק הזכוכית בov הסעת C ° 60en לשמור את החומרים במצב צבירה נוזלי. לבצע את כל החדירות בתנור זה.
  6. לפצל את הנפח הכולל של השעווה האדומה 200 מ"ל בשני בקבוקי זכוכית של 100 מ"ל כל אחד. השתמש aliquot אחד לחדירה והשנייה להטבעה סופית.

1.3) רקמות אלמוגים הטבעה לסידורית בלוק פנים הדמיה

  1. שטוף את הפוליפים אלמוגים שנאספו בשטח (SI וידאו 1) ומאוחסנים (3-6 חודשים ב4-5 C ° בparaformaldehyde) שבנאגר מלוח פוספט (3x 5 דקות) וdecalcify כאשר מוכן להיות צילם. Decalcify הפוליפים בפתרון ExCal ל24 שעות או עד שהפוליפים הם לגמרי נטולי CaCO 3. דגירה כמה פוליפים אלמוגי decalcified כגוש אחד בסדרת אתנול 25, 50, 75, ו100%, ואחריו 1x תחליף קסילן לייבש את הדגימות.
  2. הנח את הפוליפים מעובד בתנור שחומם מראש C ° 65 מכיל 100% תחליף קסילן. דגירה של 30 דקות פעמיים על ידי צ'אנגיng לפתרון טרי. כוון את הפוליפים בצורה כזאת, שהחלק העליון של הפוליפים יפנה כלפי מטה ופני השטח העליונים הוא שטוח ככל האפשר.
  3. הפוך את הפתרונות של 2: 1, 1: 1, ו1: 2 קסילן תחליף ושעוות preinfiltration (שלב 1.1) ב50 צינורות מ"ל פלקון.
  4. דגירה פוליפים אלמוגים עם שלושת ריכוזים אלה הולכים וגדל של שעוות preinfiltration, ואחריו 3x דגירה ב100% שעוות preinfiltration ל30-60 דקות בכל פעם.
  5. הערה: בהתאם לעובי של הדגימות, צעדים 1.3.1-1.3.5 יכולים להיות מוגברים עם תקופות זמן ארוכות יותר.
  6. הזז את הדגימות להטבעת שעווה (ראה שלב 1.2.6) לאחר הדגירה 3x ב100% שעוות preinfiltration.
  7. הסר את שעוות ההטבעה לאחר 30 דקות. החלף עם שעוות הטבעה טריות ולהמשיך דגירה למינימום של 4 שעות על 65 מעלות צלזיוס.

1.4) Embedding באדום שעווה

  1. לצלם את הבלוק (מגש הנירוסטה שבו השעווה הלבנה ממוקמת ועל גבי אשר סםple ממוקם). זה נחוץ משום מוטבע פעם אחת בשעווה, את מיקומו של המדגם יהיה בלתי נראה כמו השעווה האדומה ההטבעה היא אטומה.
  2. הנח טיפות קטנות של שעוות נקודת התכה גבוהה סביב העובש שחומם מראש החדש הנירוסטה ההטבעה ולאפשר לו להתקרר. יוצקים נפח קטן של טרי נמסה שעוות הטבעה מיכל שני כאמור בצעד 1.2.6.
  3. מקם את פוליפ האלמוגים פונה כלפי מטה במהירות על נקודת השעווה הלבנה, ואז למקם את בעל מדגם פלסטיק על מגש הנירוסטה ושופך שעוות הטבעה יותר, כך שהשעווה עולה אל פני השטח של תבנית הפלסטיק.
  4. קח את כל ההתקנה מתוך 65 ° C תנור ולאפשר לו להתקרר על ספסל או משטח קריר עד השעווה מתקשה לחלוטין.
  5. פעולה זו עשויה להימשך 6 שעות עד יום או ימים. מניחים את הגוש המיובש במקרר ב 4 מעלות צלזיוס, המוגן מפני אור, לאחסון לטווח ארוך.

1.5) חתך בהגדרת בלוק הפנים הסידורי

  1. Trim לחסום ולחתוך סעיפי 1 מיקרומטר באמצעות microtome. אל תאספו את החלקים כפי שהם תהיו כמו אבקה. זכור, אנחנו הדמיה רק ​​הפנים הבלוק. המדגם מופיע כאשר השעווה הלבנה מתחילה להיעלם.
  2. צלם תמונות של הפנים בלוק החלקים המכיל את המדגם בכל פעם שסעיף יוסר. המשך עד שפוליפ האלמוגים נעלם כמו בSI וידאו 2.
  3. רשומות / ללכוד את התמונות עם מצלמה בצבע אחד באמצעות מסנן ניאון FITC להרים אוטומטי הקרינה של chromatophores / פוליפ האלמוגים. תמונת 3-4 ליבות decalcified מכל מין.

2 אלמוגי הדמיה תחת שני הפוטונים מיקרוסקופ פלואורסצנטי

  1. תקן את ליבות פוליפ אלמוגים, כל אחד המכיל סביב 10-12 פוליפים על סנטימטר בקוטר, בparaformaldehyde 4% באתר של אוסף (חוף ים) ברגע שהם נקצרים מתחת למים.
  2. שמור דגימות על 4 מעלות צלזיוס עד הדמיה. ליבות שטפו ממוקמות בהאותו פתרון דואר במהופך בצלחת תחתית מכסה זכוכית (0.17 מ"מ עובי).
  3. שימוש בליזר שני פוטונים ב780 עירור ננומטר, תמונת 3-4 פוליפים בשתי הגדלה שונה (זום דיגיטלי) באמצעות מטרת 10X (0.3 NA). צורת פוליפ האלמוגים והגובה משתנים בין דגימות (בדרך כלל 1-2 מ"מ) ועומק ההדמיה גם הוא מוגבלת על ידי מרחק העבודה של מטרת ההדמיה.
  4. השתמש במצב סריקת האריח לאסוף כ 25-100 (5 X 5 או 10 x 10 אריחים) תמונות למישור מוקד בXY ו50-100 תמונות דרך ציר z במרווח 10 או 20 מיקרומטר, בהיקף של סביב 5,000-10,000 תמונות / פוליפ אלמוגים.
  5. תמונה תלת לארבעה תחומי פוליפ לייצג מיני ליבה ואלמוגים. הערה: זמן רכישת תמונה משתנה בין האזור / פוליפ 2-5 שעות.
  6. אחסן את כל התמונות בפורמט נתונים גולמיים בדיסק הקשיח של המערכת כLSM .5 לדקלם 3D בניתוח תמונת 3D ותוכנת עיבוד.

Rendering נפח 3 3D וVisualization של SBFI ושני פוטונים ספקטרלי הקרינה נתונים

  1. חתוך את נתוני 2D כדי להקטין את גודל הקובץ על ידי ההתמקדות בפוליפ בודד באמצעות כלי חיתוך מרובעים בתכנית ולעבד כקובץ TIFF יחיד (להקטין את גודל הקובץ גם על ידי שמירת הקובץ בפורמט 8 סיביות) בתוכנת הרכישה.
  2. פתח את הקבצים שנאספו מנתוני SBFI (שנאספו בשלב 1.5.1) או z-ערימות מרובות רעפים סעיפים שני פוטונים אופטיים (שנאספו בשלב 2.1.4) בתכנית Imaris לעלות מודול תחת אלגוריתם נפח.
  3. פרויקט נתונים SBFI שניתנו ב3D באמצעות הקרנת צל. צור מצב שבו isosurface voxels הם thresholded כדי ליצור דפוס משטח מוצק (SI וידאו 3).
  4. דמיינו את תחזיות 3D באמצעות אלגוריתם מטוס גזיר בxy, xz, ומצבים מאונך YZ לחשוף מבנה 3D ובצורה של אלמוגים.
  5. הנפיש את התחזיות באמצעות מודול אנימציה מסגרת מפתח באותה תכנית Imaris (SI ViDeos 3-7).
  6. ליצור קבצי וידאו ב5 דחיסת% וליצור סרט וידאו בפורמט AVI באמצעות נפח (וידאו SI 4 ו -6), שיטות 3D וIsosurface (וידאו SI 5 ו -7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מנגנון מותאם אישית שנועד SBFI (מיוצר במיוחד עבור המחקר הנוכחי; איור 3) המיוצר על המפות מפורטות הראשונות 3D הדיגיטליות הגובה (Dems) של המרקם החיצוני פני השטח והמורפולוגיה של מ ' annularis ומ ' פוליפים faveolature אלמוגים (איור 4 ווידאו SI 1-2). זה הניב תמונות של לא תוארו בעבר אונות מוערמות של רקמת אלמוגים מעגליות מקרינה כלפי חוץ ממרכזו של כל (4B דמויות, 4D, ו4E) פוליפ. אונות אלו נערמות לאורך הרכס העליון של septa שלד הראשוני והמשני מכוסה רקמה, עם אונות הגובה רדיאלית החיצוני ביותר וlowermost סופו של דבר הסינתזה ומיזוג עם רקמות coenosarc בין פוליפים. צורת פוליפ 3D והאונות הקשורות השתמרו היטב למרות דגימת רקמת האלמוגים שעברה כמה שלבים של חדירה בטמפרטורה גבוהה והטבעה. Addition של צבע סודאן רעול פנים בהצלחה הרקע כאטום, עם הצבע השחור שעזר למקסם את הניגוד של כל דגימה ולהגדיל את יחס אות לרעש. 3D ונוף מטוס מאונך הראו ההפצה של רכיבי ניאון לאורך ציר z (איור 4). היו מטוסים עם פתיתי שעווה שלעתים מוסתרות על פירוט משטח פוליפ, אשר הוסרו לבהירות בעת יצירת תחזיות. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא בחשיפת פרטים פנימיים של כל מדגם עבה, ובכך מבטל את הצורך לקחת מקטעים מרובים וליישר אותם במועד מאוחר יותר. יתר על כן, את התמונות בטכניקה זו כבר מיושרות כאשר נאספו (איור 4 א), המספק רזולוציה az של עד 1 מיקרומטר מגודל מדגם של עד 10 מ"מ או יותר (תלוי במרחק הנסיעה הכולל של בעל הבלוק בmicrotome ). אפשר להפלות רכיבים שונים לרכב ניאון (באמצעות מסננים מרובים), כמו גם פרטzooxanthellae בהגדלה גבוהה יותר, ובלבד שהשדה מופחת מבט מקובל.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי חתך אופטי ApoTome חשף את חלוקת תאי אלמוגי רקמות (zooxanthellae וchromatophores) ומבנה רקמות פני השטח ברזולוציה submillimeter. לפיכך, zooxanthellae קוטר 6-13 מיקרומטר ניתן לזהות בקלות ולכמת ביחס למספר תאים לכל נפח רקמה (איור 5). רכישת תמונת ערוץ הכפולה באמצעות הקרינה כלורופיל (ירוק) והריר שכותרתו עם WGB Alexa 647 (מוצגת באדום), עבד הטוב ביותר לכמת את הרמה של ריר ומספר zooxanthellae בתוך מיקום נתון של פוליפ (ראשי ומשניות septa של פוליפ יכול להיות מחושב באופן עצמאי).

בנוסף לגישות מיקרוסקופ אלה, יש לנו גם להחיל TPLSM, טכניקה קוי בשימוש נרחב עבור דגימות ביולוגיות עבות. יתרונותיו העיקריים של TPLSM על עלדואר פוטון לייזרי גל הרציף הם כי: (1) עירור מתרחש רק בנקודת המוקד, כי כוחה של עוצמת אור העירור הופך בריבוע ואת הסיכוי של מולקולה לקלוט שני פוטונים ברציפות כדי לעורר אלקטרון אחד מfluorophore מוגבל לעומק השדה של המטרה, ובכך לספק confocality טבוע. ו (2) כתוצאה מכך לא יהיה אובדן של פוטון עירור תוך חודר עמוק יותר לתוך המדגם, בניגוד ללייזרי פוטון יחידים. בנוסף, רוב דגימות רקמה ביולוגיות גם לספוג אור הנראה. מאז שני הפוטונים העירור הוא ארוך מטבעו (באינפרא האדום הקרוב ב780 ננומטר), הקליטה היא גם למזער באופן משמעותי. מצד השני, שלד האלמוגים המורכב של סידן פחמתי בקושי סופג או מפזר את אור שני הפוטונים. לבסוף, מאז שהיינו מעוניינים בקביעת חלוקת האובייקטים רק על פני השטח קווי המתאר של שלד האלמוגים, מצאנו הדמיה עמוקה יותר באמצעות שיטה זו very המתאים להדמית אלמוגים.

יש לנו ניסיון לאפיין את החתימה ספקטראלית זמינה במ ' annularis (איורים 6-9). כאן אנו מראים כי תחת עירור שני הפוטונים ננומטר 780, יש אוטומטי הקרינה chromatophore שיא סביב 500 ננומטר, ואילו הקרינה כלורופיל מzooxanthellae מרוכזת בכ 675 ננומטר (איור 6). בעוד unmixing של נתונים ספקטרליים זו (איורים 6-7) אפשר גם עם אלגוריתם unmixing בתוכנה (איור 8), שכן יש מרחק רפאים ברור בין שני המרכיבים, מצלם אותם בו זמנית באמצעות שני גלאים בשתי להקות פליטה הוכיחו להיות הכי טכניקת חיסכון בזמן. הדבר נכון במיוחד כאשר מדגם רעפים וצלם מעל עומק 1-2 מ"מ שלם של רקמה. זו מבטלת את הצורך בחתך פיזי, שדורש כמה אלף תמונות למיקום ומדגם ופוליפ. O ההפצה chromatophores אוטומטי ניאון f הוא גם נפרד (איור 9) בין שני מיני אלמוגים שנבדקו. במקרה אחד, שצפינו גידול משמעותי של chromatophores במים הרדודים יותר מגורים מ 'אלמוגים annularis בהשוואה למים עמוקים יותר מ faveolata (איור 9 וSI וידאו 3 ו -4).

איור 1
איור 1 (א) מפה של קוראסאו בים הקריבי הדרומי, המראה את מיקומו של אתר המחקר בPlaya Kalki על החוף מתחת לרוח הרבה הצפון מערבי של האי. חתך סכמטי של מדף השונית עם המסגרת בPlaya Kalki בקוראסאו (ב '), המציג את הפצות עומק מים של מ' annularis ומ ' faveolata. Iles / ftp_upload / 51,824 51824fig1highres.jpg "target =" / _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2 (א) בתצלום שדה מתחת למים באתר ב12 מ WD של מ ' faveolata בPlaya Kalki, קוראסאו. (B) סגור את ההגדלה של התמונה ב() מראה את הפוליפים אלמוגים הבודדים של מ ' faveolata בתנאי תאורה בשעות היום (כל פוליפ הוא כ -2 מ"מ קוטר, שחלקם חזר בו, כונה על ידי *). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

5in "src =" / קבצים / ftp_upload / 51,824 / "width =" 51824fig3highres.jpg 500 "/>
איור 3 מכשור ההדמיה בלוק פנים סדרתי. בעל מיקרוסקופ מעוצב בהתאמה אישית (A, B), מחזיק מיקרוסקופ Stereolumar ב180 ° מול פני הבלוק של המדגם ממוקם בmicrotome. כאשר כל קטע הוסר, תמונת פני בלוק נתפסה עם המטרה ונתוני 2D אוחסנו באופן דיגיטלי. הדבר נעשה עד המדגם נעלם בבלוק. מיקרוסקופ מועבר בx וכיוון y באמצעות בורג הובלה ממונע וz, התאמה נעשית להתמקד המדגם. חשוב לציין כי כאשר כל דגימה 1 מיקרומטר מחולקת, מהלכי הבלוק 1 מיקרומטר קדימה, כך למקד מחדש של ההיקף אין צורך. XYMOT, מותאם אישית שנבנו שלב ממונע translational xy; FLS, מקור אור פלואורסצנטי; MT, Microtome; MIC, סטראו; CAM, מצלמה בצבע אחד AxioCam; BH, בעל בלוק; BF, פנים בלוק שלהמדגם; FLL, נקודת אור עירור פלורסנט על הפנים לחסום; OBJ, אובייקטיבי מיקרוסקופ; HIP, פנל ממשק אדם. תמונה אחת בממד של 1,388 x 1,040 פיקסלים האנכיים אופקיים במצב מונוכרום נאספה בפיקסל XY רזולוציה (יחידה) של 1.25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4 בלוק סידורי פנים הדמיה של האלמוגים מ ' annularis ומ ' faveolata נאסף מPlaya Kalki, קוראסאו. נתונים לדוגמה () להגדיר גלריה המציגה סביב 800 תמונות של תמונות 2D בודדות המתקבלות מפוליפ ברזולוציה 1 מיקרומטר בz. (ב) במקרה אחר מדגם אלמוגים, חתך הלך גם מעל 2,000 מיקרומטר בz. התמונה מראה פוליפים ואוסף רבים של כל פרוסות 2D לנפח 3D תחת היטל צל באמצעות האלגוריתם להדמיה נפח Imaris. הקרנה (C) אורתוגונלית מראה תצוגת xz של המדגם ב( ב '), ניתן לראות את כל העומק של המדגם מעל 2 מ"מ והחצים מצביעים על הקווים השחורים שבו פרוסות 2D הוסרו בשל איכות ירודה; תמונה זו היא ממ ' annularis. 3D נפח (ד '), Isosurface טיוח (E) ויזואליזציה של נתונים SBFI. (ד) פוליפים אלמוגים מרובים המציגים את מורפולוגיה פוליפ בסעיף אורך בצד ו3D הנפח (הקרנת צל) של פוליפ בודד באמצע. חתך והדמיה בכל זווית אפשרי ב3D (ראה וידאו SI). א מאז voxels מטושטשים ב3D (ד '), המשטח 3D Isosurface שניתנו מציג את קווי המתאר של פני השטח פוליפ אלמוגים והקונטקסטואליים שלהםהסדר עם פוליפים סמוכים (ראה וידאו SI). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
מיקרוסקופיה איור 5 פלואורסצנטי של פוליפים אלמוגים. () חתך של פוליפ decalcified של מ ' faveolata מציג zooxanthellae עם autofluorescence כלורופיל תחת אור הכחול (המוצג בירוק) וכיסים ריריים שכותרתו עם agglutinin נבט חיטה (מוצג באדום) כצלם תחת אור אדום. התמונה לאריחים באופן אוטומטי בשני ערוצים ותפרו ומיושר באמצעות תוכנת המכשיר. (ב) הגדלה של התיבה מוצגת ב(), מראה zooxanthellae הבודד (כל עיגולים ירוקים, approxiשל הדבר 6-8 מיקרומטר בקוטר בירוק) ושכבת ריר משטח (אדום), ואת המיזוג של שני הערוצים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6 אפיון ספקטרלי שני פוטונים של הקרינה מאלמוגים. שימוש בגלאי הרפאים של מערכת LSM 710, אותות הקרינה מהספקטרום השלם הגלוי (419-722 ננומטר) נסרקו על עומק של כ 190 מיקרומטר. התמונה מראה את מרווח העומק ב5 מיקרומטר בציר x לערימת z וציר Y הוא אורך גל 419-722 ננומטר נרכש במרווח 10 ננומטר (סך הכל סביב 1,154 תמונות הראו). אפשר לראות את שני מרכיבי רפאים, אחד מרוכזת ב500 ננומטר והשני ב650 ננומטר. Exci לייזר שני פוטוניםאורך גל tation של 780 ננומטר שימש כדי להשיג את פרופילי הפליטה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
אפיון דמות .7 של שני מרכיבי הרפאים. () פרופיל הרפאים של רקע (כחול), autofluorescence מchromatophores (ירוקה) וקרינת כלורופיל (אדום) התלהבה מגל עירור לייזר שני פוטונים של 780 לייזר ננומטר. הספקטרום נגזר מוצג בצד ימין של נתונים ספקטרליים ססגוניות מעולף ופסאודו בצבע בהתאם לפרופיל הפליטה. (ב) פחי הרפאים הבודדים שבי האותות נאספים ב10 מרווח ננומטר להפיק את הספקטרום ואת התמונה ב(). הערה כי שני רכיבים נפרדים, אחד במרכז על כ 500 ננומטר (autofluorescence chromatophore) והשני על 675 ננומטר (הקרינה כלורופיל). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 8
איור 8 אותו התמונות ב7A דמויות ו7B, נתונים ספקטרליים צרופות באמצעות התוכנה ופסגות פליטה המתאימה / הספקטרום שלהם. בשני מ ' annularis ומ ' faveolata, הרכיבים ספקטרליים דומים מאוד, כמו גם פסגות הפליטה שלהם. ההבדל המשמעותי, עם זאת, בשל המיקום של רכיבי הרפאים האלה והשפע שלהם (ראה איור 9)."Target =" ghres.jpg _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 9
איור 9 תמונות 3D הקרינה שני פוטונים של פוליפים אלמוגים ממ ' annularis (AD) ומ ' faveolata (EH). (וה) הם צילמו ללא הפרדה הספקטרלית של רכיבים באמצעות 780 עירור ננומטר של לייזר שני פוטונים, עם האות האופטי שנאסף 450-700 ננומטר. (B ו F) נאספו באותו העירור (780 ננומטר), אבל שני גלאי PMT שמשו בו זמנית כדי לאסוף את הנתונים משני מרכיבים כלומר., אחד 500-550 ננומטר (autofluorescence הירוק chromatophore) ו650- האחרים 720 ננומטר (הקרינה אדום כלורופיל). (C ו G) הם תמונות עומק מקודדת של(B ו F), אדום הוא רדוד וכחול הוא הרכיבים העמוקים ביותר ב2D. (D וH) הם תמונות YZ של חתך דרך (B ו F) בהתאמה, מראים את הקרינה מגיעה רק מפני שטח של האלמוגים והשלד אין הקרינה ב780 עירור ננומטר. שים לב להיבדל משמעותי בתוכן chromatophore בין שני האלמוגים. מ ' בית הגידול annularis (0-10 מ 'WD) הוא רדוד יותר מ בית גידול faveolata (10-20 WD מ '). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 10
איור 10. סמכויות עשרה מבנה המרחבי היררכי של מחקרי of מערכות אקולוגיות שונית אלמוגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור S1
SI איור יריות .1 מסך המציגות את השלבים (AI) מעורבים ביצירה של 3D נפח וisosurface טיוח משני נתונים SBFI או מיקרוסקופיה 2Photon באמצעות תוכנת ניתוח תמונה (ראו לוח חומרים). () פרוסות 2D של הגלם נתונים במצב פרוס מראים מטוס אחד; 3D נפח של כל פרוסות 2D (ב); אשף יצירת isosurface עם אזור של עניין (ROI) נבחר (ג); אלגוריתם עם רקע חיסור שנבחר (ד); (ה) ערך סף מיושם להרים את פיקסלים שrepresent נתונים; (F) נקודות זרע מרכז המשטח; (G) מסנן מבוסס נפח מוחל לחסל נפח קטן יותר של פסולת ורעש; 3D הסופי שניתנו isosurface (H); אשף אנימציה מסגרת מפתח (I) כדי ליצור את הסרטים כמו בסרטי וידאו SI. התמונות שניתנו הסופיות מוצגות בשני אופנים הנפח וisosurface בוידאו SI 3-7. פרוטוקול צעדים 3.1.3-3.1.5 מכסים נהלים אלה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

חומר / ציוד חברה קטלוג / מספר דגם תגובות / תיאור
רקמות אלמוגי שלד אף אחד אף אחד 2.5 סנטימטר ביופסיהסאי מבית הגידול טבעי
קשת פאנץ coring התקן CS אוסבורן וחברה מס '149 לאוסף ביופסיה אלמוג
Paraformaldehyde מדעים מיקרוסקופית אלקטרונים RT 15700 16% טרום בדילול מלא
Histoclear / Safeclear השני מדעים מיקרוסקופית אלקטרונים RT 64,111-04 חלופי שאינו רעילה לקסילן, התייבשות וDeparafinization
קסילן ואתנול פישר סיינטיפיק פישר סיינטיפיק התייבשות
פרפין ריצ'רד אלן מדעי סוג REF H 8338 פתרון הסתננות
Vybar להכנת הנרות אף אחד רכיב של רד שעווה
שעוות להכנת הנרות אף אחד רכיב של רד שעווה
סודאן IV פישר כימי S667-25 רקע אדום שעווה-אטום
נבט החיטה agglutinin (WGA) חיים טכנולוגיים W32466 לתיוג אלמוג ריר
להאריך זהב חיים טכנולוגיים P36095 תקשורת הרכבה אנטי לדעוך
צלחת fluoro עולם מכשירי Precision FD-35-100 הדמיה שני פוטונים
XY מוטורי, נהג ובקר לין הנדסה 211-13-01R0, R325, R256-RO XY Translational תנועה
צלחת חמה קורנינג DC-220 התכה כל השעווה
הסעת תנור יאמאטו DX-600 הסתננות והטבעה
מעבד רקמה לייקה ASP 300
Microtome לייקה RM2055 סכינים חד פעמי
מיקרוסקופ סטריאו Carl Zeiss Stereolumar 12 V 1.5x מטרה (30 מ"מ WD)
מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם ApoTome Carl Zeiss Axiovert M 200, מערכתי ApoTome הדמיה סעיף דק של פוליפ: zooxanthellae
מצלמה AxioCam Carl Zeiss MRM פיקסלים 1388x1040 מצלמה מונוכרום
תוכנת AxioVision Carl Zeiss גרסה 4.8 תכנית רכישת תמונה
שני פוטוני לייזר Spectraphysics Maitai EHP, לייזר פעמו (70 FS) עם מודול DeepSee
סריקת הלייזר מיקרוסקופ Carl Zeiss LSM 710 עם ספקטרלי גלאי 34זיהוי PMT ערוץ
זן תוכנה Carl Zeiss 2010 או מעל עבור שני פוטונים ורכישת תמונת רפאים
Imaris חבילת תוכנה Bitplane, Inc, גרסה 7.0 או מעל נפח 3D, Rendering Iso-משטח, ויזואליזציה

.1 חומרי שולחן מפתח, ציוד, מיקרוסקופים, ותוכנה המשמש במחקר זה.

SI וידאו 1. בסרטון שדה מתחת למים באתר המציג את בית הגידול האלמוגים ב12 מ WD של מ ' faveolata בPlaya Kalki, קוראסאו.

SI וידאו 2. תמונות פנים בלוק סדרתי הפרט 2D של התמונה שניתנו 3D מוצגת בFi4E תרשים.

SI וידאו 3. Isosurface שניתנו 3D תמונת פני בלוק סידורי מוצגת באיור 4E וSI וידאו 1 מראה את הטופוגרפיה של פוליפ האלמוגים.

SI וידאו 4. תמונת 3D נפח שניתנו נתונים שני פוטונים גלם מיקרוסקופיה של פוליפ האלמוגים מ ' faveolata. העירור הוא 780 ננומטר והפליטה שנתפסה בו זמנית בשתי מידות רוחב פס לzooxanthellae (פסאודו בצבע אדום, 600-700 ננומטר) וchromatophores (פסאודו בצבע ירוק, 500-550 ננומטר).

SI וידאו 5. 3D נפח שניתנו בIsosurface-כתמי תמונה מיקרוסקופית שני פוטונים של פוליפ האלמוגים מ 'faveolata. העירור הוא 780 ננומטר והפליטה שנתפסה בו זמנית בשתי מידות רוחב פס לzooxanthellae (פסאודו בצבע אדום, 600-700 ננומטר) וchromatophores (פסאודו בצבע ירוק, 500-550 ננומטר).

SI וידאו 6. תמונת 3D נפח שניתנו נתונים שני פוטונים גלם מיקרוסקופיה של פוליפ האלמוגים מ ' annularis. העירור הוא 780 ננומטר והפליטה שנתפסה בו זמנית בשתי מידות רוחב פס לzooxanthellae (פסאודו בצבע אדום, 600-700 ננומטר) וchromatophores (פסאודו בצבע ירוק, 500-550 ננומטר).

SI וידאו 7. תמונה מיקרוסקופית שני פוטונים Isosurface-כתמי 3D נפח מוצגים של פוליפ האלמוגים מ ' annularis. העירור הוא 780 ננומטר והפליטה שנתפסה בו זמנית בשתי מידות רוחב פס לzooxanthellae (pseudo בצבע אדום, 600-700 ננומטר) וchromatophores (פסאודו בצבע ירוק, 500-550 ננומטר).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מחקר שונית אלמוגים הוא מאמץ מחקר בינתחומי מאוד, הכולל ניתוח של פיזי, כימי בו זמנית, ותופעות ביולוגיות הפועלים בסביבה הימית. המחקר של מערכות אקולוגיות שונית אלמוגים מורכבות לכן הטוב ביותר יושלם בתוך מעצמות של עשרה 'מסגרת ההקשרים (איור 10). אוסף גרפי זו ממחיש כי המערכת האקולוגית האלמוגים מכסה מגוון רחב של ממדים מרחביים (10 -9 ל10 5 מ '). יתר על כן, התרגיל הזה ממחיש שgeobiological מנתח באורך קנה מידת ביניים של 1 סנטימטר מ"מ-1 הוא הגשר הדרוש כדי לשלב שדה ומעבדה מנתחת. סמכויות זו של עשר מסגרת היא ההקשר לניסויים, ניתוחים, דוגמנות, וסינתזה של הפיזי, כימי, וביולוגיים פרמטרים השולטים על מערכות אקולוגיות שונית אלמוגי קוראסאו.

המחקר הנוכחי הוא הראשון ליישם את o החבילה המשולבת באופן מלאf FM, SBFI וטכניקות CLSM כדי לעקוב אחר התגובה של אלמוגים בריאים לכאורה לעומק מים גובר. כלים מיקרוסקופ אור זמינים לכל רקמת תמונה או דגימות ביולוגיות עבות היו מוגבלים בשל מגוון רחב של אילוצים אופטיים שמציבים הדגימות עצמם, הכוללים קליטה, פיזור, ותופעות אחרות. רק בתוך העשור האחרון, במיקרוסקופ אלקטרונים הסורק SBFI שימש ברזולוציות גבוהות במיוחד ביום 31 ב, כמו גם הדמיה מיקרוסקופית אור באמצעות ההדמיה SBFI רחבה בתחום המבוסס על כמה דגימות ביולוגיות. זה כולל ניתוחים של כל דבר מהמוח לרקמות לב שלמות ואפילו דגימות המכילות עצמות שהיו קרקע, מלוטשת, שכותרתו, וצלם באותו הזמן אחרי כל קטע נעשה 23-29. לאחרונה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי וconfocal שימש כדי לחשוף את קווי המתאר, צורה, והפצה של חלבונים ופיגמנטים בדגימות ביולוגיות 32-33. עם זאת, מבנה 3D של חה פוליפים אלמוגים בודדיםד לא נפתר בעבר. תנאי מוקדם לSBFI עם דגימות אלמוגים הוא decalcification, כסידן פחמה יש להסיר לפני טיוח הדגימות נוחות לחדירה והחתך באמצעות microtome רגיל.

זה המקום שבי מיקרוסקופ פלואורסצנטי שני פוטונים הופך הכרחי עבור הניתוח של רקמות ביולוגיות בשל תופעות שני הפוטונים הייחודיים שלה עירור. זה הוביל ל33-34 חדירת עומק המורחב של רקמות אלמוגים במחקר הנוכחי, שבו צעד decalcification חוסל ביעילות בשל עירור שני פוטונים קוי תופעות מ34. בנוסף, מודול precompensation עם לייזר שני הפוטונים סיפק רוחב פולס קצר בהרבה, ששפר את עומק חדירה בנוסף. בצד המדגם, שכן סידן פחמה לא לספוג אור אינפרא אדום הקרוב ב780 ננומטר, חדיר לעומק מוגבל בדרך כלל על ידי מרחק העבודה של המטרה. עם זאת, חסרון נוסף odecalcification f והסרת של שלד אלמוגים הוא האובדן של שלמות המבנית של רקמת האלמוג, מה שהופך את הערכות נפח רקמה קשה עוד יותר לאחר המדגם עבר שלבי התייבשות והחזרת נוזלים מרובים והטבעה בשעווה ללא מים. זה מדגיש את החשיבות של קביעת כרכי רקמת אלמוגים לפני ואחרי העיבוד.

אפיון confocal של חלבוני ניאון של אלמוגים הושלם לאלמוגי שונית המחסום גדול והתכונות ספקטרליות מגן כבר מתואם עם עומק של בית הגידול אלמוגי 32. עם זאת, במחקר הנוכחי אנו מראים בפעם הראשונה באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים שיש הפחתה משמעותית של chromatophores בכל מקום באלמוגי מים עמוקים אלא ברקמות פה. בנוסף, השינויים המובהקים בחלוקת zooxanthellae ביחס לchromatophores נצפו על פני חתכי עומק בתוך: מ ' annularis, wherדואר רקמות אלמוגים במים הרדודים מכוסות לחלוטין עם chromatophores. עם הרזולוציה הניתנת על ידי ההדמיה להגדלה החזקה (8C דמויות ו8D), אנחנו יכולים עכשיו בדיוק לכמת את השטח ונפח תפוס על ידי zooxanthellae, ויחסי צפיפות רקמתם ניתן לקבוע ביחס למרכיבים תאיים אחרים. יחדיו, השילוב של SBFI וההדמיה רפאים הקרינה שני פוטונים במחקר הנוכחי הניבו תובנות חדשות חשובות וחיוני למורפולוגיה והמבנה של רקמות אלמוגים. נתונים אלה יעזרו לי לכמת את הרכיבים הבודדים של רקמת אלמוג, גם ברמת הפרט או פוליפ ברמה הקונטקסטואלית של משחק גומלין בין פוליפים הקולוניאליים על ראש אלמוגים כולו. הקשר זה עכשיו לאפשר התגובה המסתגלת של holobiont אלמוגים לשינויים בעומק מים פני הים וirradiance להיות במעקב כמותי וניבא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coral Tissue Skeleton 2.5 cm Biopsy from natural habitat
Arch Punch Coring Device C.S. Osborne and Company No. 149 For Coral biopsy collection
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences RT 15700 16% Pre-diluted
Histoclear/Safeclear II Electron Microscopy Sciences RT 64111-04 Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization
Xylene and Ethanol Fisher Scientific Dehydration
Paraffin Wax Richard Allen Scientific Type H REF 8338 Infiltration solution
Vybar The Candle Maker Component of Red Wax
Stearin The Candle Maker Component of Red Wax
Sudan IV Fisher Chemical S667-25 Red Wax-Opaque background
Wheat Germ Agglutinin (WGA) Life Technologies W32466 For labeling  Coral Mucus
Prolong Gold Life Technologies P36095 Anti-fade mounting media
Fluoro Dish World Precision Instruments FD-35-100 For two-photon imaging
XY Motor, Driver and Controller Lin Engineering 211-13-01R0, R325, R256-RO XY Translational Movement
Hot Plate Corning DC-220 Melting all wax
Convection Oven Yamato DX-600 Infiltration and Embedding
Tissue Processor Leica ASP 300 Dehydration, Infiltration
Microtome Leica RM2055 Disposable knifes
Stereo Microscope Carl Zeiss Stereolumar V 12 1.5x (30 mm WD) Objective
Fluorescence Microscope with ApoTome Carl Zeiss Axiovert M 200, ApoTome I System Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae
Axiocam camera Carl Zeiss MRm Monochrome camera 1388x1040 pixels
Axiovision Software Carl Zeiss Version 4.8 Image acquisition program
Two-Photon Laser Spectraphysics Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) With DeepSee module
Laser Scanning Microscope Carl Zeiss LSM 710 with Spectral Detector 34 channel PMT detection
Zen Software Carl Zeiss 2010 or above for two-photon and spectral image acquisition
Imaris Suite Software Bitplane, Inc., Version 7.0 or above 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Stocker, T. F., Qin, D., Plattner, G. -K., Tignor, M., Allen, S. K., Boschung, J., Nauels, A., Xia, Y., Bex, V., Midgley, P. M. Cambridge University Press. 1535 (2013).
  2. Buddemeir, R. W., Kleypas, J. A., Aronson, R. B. Coral Reefs & Global Climate Change: Potential Contributions of Climate Change to Stresses on Coral Reef Ecosystems). 46, Pew Center on Global Climate Change. (2004).
  3. Wilkinson, C. Status of coral reefs of the world. Australian Institute of Marine Science. Townsville. 1-2 (2004).
  4. Lough, J. M. Climate records from corals. WIREs Clim. Chang. 1, 318-331 (2010).
  5. Harvell, C. D., et al. Tropical Archaea: diversity associated with the surface microlayer of corals. Mar. Ecol. Prog. Ser. 273, 81-88 (2004).
  6. Coral Health and Disease. Rosenberg, E., Loya, Y. Springer. (2004).
  7. Rohwer, F., Breitbart, M., Jara, J., Azam, F., Knowlton, N. Diversity of bacteria associated with the Caribbean coral Montastrea franksi. Coral Reefs. 20, 85-91 (2001).
  8. Frias-Lopez, J., Zerkle, A. L., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Partitioning of bacterial communities between seawater and healthy, black band diseased, and dead coral surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2214-2228 (2002).
  9. Stanley, G. D. Jr The evolution of modern corals and their early history. Earth Sci. Rev. 60, 195-225 (2003).
  10. Piggot, A. M., Fouke, B. W., Sivaguru, M., Sanford, R., Gaskins, H. R. Change in zooxanthellae and mucocyte tissue density as an adaptive response to environmental stress by the coral Montastraea annularis. Mar. Biol. 156, 2379-2389 (2009).
  11. Stanley, G. D. Jr Photosymbiosis and the evolution of modern coral reefs. Evolution. 1, 3 (2006).
  12. Gordon, B. R., Leggat, W. Symbiodinium—Invertebrate Symbioses and the Role of Metabolomics. Mar. Drugs. 8, 2546-2568 (2010).
  13. Schlichter, D., Weber, W., Fricke, H. W. A chromatophore system in the hermatypic, deep-water coral Leptoseris fragilis (Anthozoa: Hexacorallia). Marine Biology. 89, 143-147 (1994).
  14. Fouke, B. W., Meyers, W. J., Hanson, G. N., Beets, C. J. Chronostratigraphy and dolomitization of the Seroe Domi Formation, Curacao, Netherlands Antilles. Facies. 35, 293-320 (1996).
  15. Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Jin, Q., Fouke, B. W. Cyanobacteria associated with coral black band disease in Caribbean and Indo-Pacific reefs. Appl. Environ. Microbiol. 69, 2409-2413 (2003).
  16. Frias-Lopez, J., Klaus, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. The bacterial community associated with black band disease in corals. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5055-5062 (2004).
  17. Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Identification of differential gene expression in bacteria associated with coral black band disease using RNA-arbitrarily primed PCR. Appl. Environ. Microbiol. 70, 3687-3694 (2004).
  18. Klaus, J. S., Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Heikoop, J. M., Fouke, B. W. Bacterial communities inhabiting the healthy tissues of two Caribbean reef corals: interspecific and spatial variation. Coral Reefs. 24, 129-137 (2005).
  19. Klaus, J., Janse, I., Sandford, R., Fouke, B. W. Coral microbial communities, zooxanthellae, and mucus along gradients of seawater depth and coastal pollution. Environ. Microbiol. 9, 1291-1305 (2007).
  20. van Duyl, F. C. Atlas of the living reefs of Curacao and Bonaire (Netherlands Antilles). Diss. Vrije Universiteit. Amsterdam. (1985).
  21. Carricart-Ganivet, J. P. Sea surface temperature and the growth of the West Atlantic reef building coral Montastraea annularis. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 302, 249-260 (2004).
  22. Barnes, D. J., Lough, J. M. Coral skeletons: Storage and recovery of environmental information. Global Chang. Biol. 2, 569-582 (1996).
  23. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 6, 069591 (2012).
  24. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 573-578 (2011).
  25. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb. Protoc. 6, 069575 (2012).
  26. Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Res. C: Embryo Today: Rev. 72, 213-223 (2004).
  27. Slyfield, C. R., et al. Three-dimensional surface texture visualization of bone tissue through epifluorescence-based serial block face imaging. J. Microsc. 236, 52-59 (2009).
  28. Weninger, W., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat. Genet. 30, 59-65 (2001).
  29. Weninger, W., Mohun, T. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Reporter Genes. Humana Press. 35-46 (2007).
  30. Gerneke, D. A., et al. Surface imaging microscopy using an ultramiller for large volume 3D reconstruction of wax-and resin-embedded tissues. Microsc. Res. Tech. 70, 886-894 (2007).
  31. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
  32. Salih, A., Larkum, A., Cox, G., Kühl, M., Hoegh-Guldberg, O. Fluorescent pigments in corals are photoprotective. Nature. 408, 850-853 (2000).
  33. Sivaguru, M., Mander, L., Fried, G., Punyasena, S. W. Capturing the surface texture and shape of pollen: A comparison of microscopy techniques. PloS one. 7, (6), (2012).
  34. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
Multimodal שיטות מיקרוסקופית אופטיות לחשוף רקמות מורפולוגיה ומבנה פוליפ בקריביים אלמוגי בניית ריף
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sivaguru, M., Fried, G. A., Miller, C. A. H., Fouke, B. W. Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals. J. Vis. Exp. (91), e51824, doi:10.3791/51824 (2014).More

Sivaguru, M., Fried, G. A., Miller, C. A. H., Fouke, B. W. Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals. J. Vis. Exp. (91), e51824, doi:10.3791/51824 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter