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복합 광학 현미경 방법 카리브 암초 건물 산호의 폴립 조직 형태와 구조를 밝히기

doi: 10.3791/51824 Published: September 5, 2014

Summary

영상 기술의 통합 제품군은 카리브해 산호 Montastraea의 annularis와 M.에서 용종의 형태와 조직 구조를 결정하기 위해 적용되었습니다 faveolata. 형광, 직렬 블록 얼​​굴, 및이 광자 공 초점 레이저 주사 현미경 lobate 구조 용종 벽 및 예상 chromatophore 및 주산 셀러 밀도 및 분포를 확인했다.

Abstract

이미징 기술의 통합 스위트 카리브해 암초 건물 산호 Montastraea의 annularisM. 이루어지는 3 차원 (3D) 형태학 및 용종 조직의 세포 구조를 결정하기 위해 적용되어왔다 faveolata. 이러한 접근은 형광 현미경 (FM), 시리얼 블록 얼​​굴 영상 (SBFI), 및 2 광자 공 초점 레이저 주사 현미경 (TPLSM)를 포함한다. SBFI 물리적 절편 후 깊은 조직 이미징을 제공한다; 그것은 이상 2mm의 조직 깊이에 조직 표면의 질감과 3D 시각화에 대해 자세히 설명합니다. 조직 세포 구조의 보완 FM 및 TPLSM 수율은 매우 높은 해상도의 이미지. 결과가있다 : (1) 외부 개별 산호 폴립의 벽에 이전에보고되지 않은 lobate 조직 형태학을 확인 (2) 색소, 조류와 같은 dinoflagellate의 주산 셀러의 endosymbionts의 3 차원 분포와 조직 밀도의 제 1면지도를 만들었습니다. 스펙트럼 흡수 완두콩500 nm 내지 675 nm 인 KS는 각각 제안 M. annularis와 M. faveolata 엽록소와 색소의 유사한 유형을 포함. 그러나, M. annularis와 M. 조직 밀도와 이러한 주요 세포 구성 요소의 3 차원 분포의 유의 한 차이를 나타내지 faveolata. 이미징 방법에 초점을 맞춘이 연구는 SBFI이 탈회 산호 조직의 큰 mm 크기의 샘플의 분석에 매우 유용 있음을 나타냅니다. 무료 FM 및 TPLSM는 nondecalcified 산호 조직 샘플에서 세포의 분포와 밀도의 미묘한 서브 밀리미터 규모의 변화를 알 수있다. TPLSM 기법 수득한다 : (1) 최소 침습 샘플 준비, (2) 우수한 광 단면 처리 능력, (3) 최소의 광 흡수 및 산란, 여전히 깊은 티슈 이미징을 허용하면서.

Introduction

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지구 온난화 및 첨부 환경의 변화는 직접적으로 열대 해양 산호 1-4의 건강 및 유통에 영향을 미치는됩니다. 여러 영향 산호 표백 및 전염병 5-6의 출현을 포함하여 관찰되고있다. 그러나 이러한 환경 적 위협에 대한 미래 산호 응답의보다 정확한 예측은 조직 학적 "베이스 라인" "건강 해 보이는"산호에 대한 조직의 형태 및 세포 구성과 분포를 정의하는 설립하는 것이 필요합니다. 차례로, 산호가 다음 정량적으로 비교 될 수있다 "영향". "정상 응답이"또한 환경에 걸쳐 구배 계측 할 수 있도록 또한,이 기준선은, 다양한 환​​경 조건 하에서 외관상 건강한 산호 대해 확립되어야한다. 이 기준선을 설정 향한 초기 단계로서, 고해상도 3D 연구는 어떻게 외관상 건강한 산호 폴립 조직 수행되었다형태와 세포 조성물은 햇빛 조사량에서 수심의 증가 (WD) 및 첨부 감소에 응답합니다. 결과는 다음 산호 적응 기작보다 포괄적 이해를 설정할뿐만 아니라, 산호 공생 진화 통찰력과 광 수확의 향상을 얻기 위해 이용 될 수있다.

스토니 산호 (Scleractinia)는 공동으로 산호 7-10 holobiont이라 다른 미생물의 복잡한 조립, 호스트를 재생 식민지 해양 무척추 동물이다. 본 연구에서 수행 연구는 동시에 조직 색소의 증가 수심 분명히 건강한 호스트 산호의 공생 주산 셀러와 변경 사항을 추적하기 위해 최첨단 영상 기술의 제품군을 사용하고자한다. 이 산호 난방의 지표로 분명히 건강한 산호와 행위에 대해 수심 그라데이션을 통해 필요한 비교 조직 셀 "기준"을 설정합니다LTH 10. 산호 안료라는 색소가 흡수, 반영, 산란, 굴절, 회절, 또는 다른 사건 태양 복사 11을 방해하는 역할을합니다. 주산 셀러 - chromatophore endosymbiotic 관계는 산호 동물 (12)에 대해 전략적으로 유리한 빛 수확 최적화 및 골격 성장 전략의 공진화뿐만 아니라 영양 소성 (시프트 공급 전략 autotrophy가 heterotrophy까지 앞뒤로)를 사용할 수있다.

쿠라 카오 남부 카리브해 섬 국가 (네덜란드 령 앤 틸리 스의 이전 부분) 아루바 라 Blanquilla 열도 (그림 1A)를 동향 동서 내에서 약 65km 북쪽 베네수엘라있다. 쿠라 카오 70km 긴 남쪽 해안은 현대 지속적이고 중신 - 플라이오세 - 플라이 스토 홀로 세 고대의 언저리 산호초 기관 13, 14이 포함되어 있습니다. 큐라는 약 3 ° C 형을 변화에 연간 SST 평균nually, 27.5 ± 0.5 ºC의 연간 평균 온도, 9 월 초에 29 ° C의 최대 월 말에서 26 ° C의 최소에 이르기까지 (NOAA SST 데이터 것은 2000년부터 2010년까지 설정합니다). 이전에 잘 공부 되었기 때문에 큐라 (그림 1A)의 북서쪽 끝에 근처에 누워 야 Kalki에서 산호초 (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62"W)는, 샘플링에 선정되었다 이 위치에서 해양 생태계 신선한 nonpolluted 해수 7,15-19에서 목욕을합니다. . 두 밀접하게 관련 scleractinian 산호 종, M.의 annularisM faveolata,이 연구에서 실험과 분석을 위해 선택되었다 각 종 때문에 (1) 선반 휴식과에 대한 암초 기관에 전시 분명히 다른과 겹치지 않는 수심 분포 관련 탄산염 퇴적 퇴적 환경 (M.의 annularis 범위 = 0-10미터 WD, M.의 faveolata범위 = 10~20m WD 20,도 1B, 2A2B); (2) 카리브해 (21)에 걸쳐 공통의 산호초 프레임 워크 빌더입니다; (3) 잘 연구 된 생태 학적, 생리 학적, 진화 관계 (22)이있다.

본 연구를위한 필드를 샘플링은 해외 쿠라에 플라 야 Kalki의 표준 스쿠버 다이빙 기술을 사용하여 실시 하였다. 얕은 - 투 - 심해 해저 지형의 횡단면은 선반 휴식을 통해, 선반 가로 질러 그 설립하고, 깊은 물 이물 암초 환경으로 하였다. (1) 세 개인 M.의 ~ 1m 직경 산호 머리 : 분명히 건강한 산호 헤드는 다음을 포함하여이 수심 횡단면을 따라 샘플링 확인되었다 5m 수심 (WD)에 있었다 모두 annularis; M.의 (2) 개별 세 ~ 1m 직경 산호 머리 faveolata는 모두 12m WD에 있었다. 광합성 활성 복사 (PAR)는 33-36% P로 측정 하였다5m WD에서 AR과 10m WD에서 18-22%의 PAR. SST는 5m와 12m 모두의 수심에서 26 ° C를 때 샘플링 년 1 월에 실시했다. 이 여섯 산호 헤드의 각 (즉,. 육 반구형 산호 머리에 각각 약 45 ° N 위도) 동일한 공간 위치에 세중 샘플링했다. 각각의 샘플은 청소 아치 펀치 수집 2.5 cm 직경 산호 조직의 골격 코어 생검으로 구성되었다. 세 산호 조직의 골격 조직 검사가 산호 머리에서 각각 장갑을 낀 손으로 표준 SCUBA에서 샘플링되었다 (M. 9은 5m WD에서 식민지를 annularisM.에서 9 12m WD에서 faveolata). 즉시 깊이에서 수령시, 각 조직 검사 코어 시료를 멸균 50 ㎖의 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 넣고, 나사 정상은 밀봉하고, 표면에 돌아왔다. 해수 각 원심 관으로부터 경사 분리하고, 각 코어 생검 후, 침지 저장, 4 % 파라 포름 알데히드로 이송 하였다.

23-30와 동물 샘플의 여러 유형을 포함하여 생물학적 시료의 넓은 범위에서 수행되었다. 형광 또는 시야 기법 중 하나와 광학 / 광학 현미경을 이용 이러한 연구의 대부분. 그러나, 연구는 지난 31 년 사형 전자 시리얼 블록 얼굴 영상을 사용하여 초고 배율에서 수행되고있다. 본 연구에서, 변성 SBFI 프로토콜이 개발되었으며 처음 산호인가. M. 때문에 annularis와 M. faveolata 산호 폴립은 두께 1-2mm 아르, 루틴 광학 현미경 기술 중 어느 것도 산호 폴립 조직의 전체 두께를 관통 할 수 없을 것입니다. 따라서, 우리는 특히 산호 샘플을 위해 설계 SBFI 샘플 준비 프로토콜을 가지고있다. 또, 정의 실체 홀더를 설계했다x와 y 방향 모두에서 동력 이동된다. 이 장치는 오히려 현미경 앞의 정규 마이크로톰을 사용하는 섹션을 수집하는 것보다 샘플 블록 얼​​굴의 화상을 얻어. 우리는 또한 산호 조직의 전체 두께에 걸쳐 이미지에 동일한 산호 폴립을 다른 비선형 광학 두 광자 현미경 기술을 소개했다. 이것은 탈회 측면과 시료 전처리 (탈수) 및 프로세싱 프로토콜에 의해 유도 될 수있다 조직 형태학 및 볼륨 (수축)의 변화의 가능성에 의해 부과 SBFI 한계를 극복한다. 또한, 산호에서 배출 프로파일은 스펙트럼 색소와 광합성 주산 셀러 사이에 절정 배출과 변화를 확인하기로 결심 하였다. 이러한 결과는 사용 된 방법의 컨텍스트 및 수집 시간에 관한 개별 장점, 분석 시간, 및 STR을 손상시키지 않고 미세 구조적 세부 사항을 해결하는 능력으로 평가 하였다산호 조직의 uctural 무결성.

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Protocol

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참고 : 시약은 산호 샘플의 직렬 블록 얼​​굴 이미징을위한 준비를합니다

1 Preinfiltration 왁스

  1. 유리 비커에 스테아린 조각 3.6 g을 녹여. 핫 플레이트 (60 ~ 70 ° C에서) 잘 섞는다.
  2. 수단 IV의 400 mg의 추가 (왁스 배경 형광을 최소화하기 위해). 잘 섞어 빨간색 반투명​​ 솔루션이 달성 될 때까지 기다립니다.
  3. 96 ㎖의 뜨거운 용융 파라핀 (100 %)을 넣고 잘 섞는다.

1.2) 포함] 왁스

  1. 유리 비커에 스테아린 조각 7.2 g을 녹여 뜨거운 접시에 잘 혼합 (60 ~ 70 ° C).
  2. 수단 IV의 0.8 g을 추가합니다. 잘 섞어 빨간색 반투명​​ 솔루션이 달성 될 때까지 기다립니다.
  3. 파라핀 과립 (162g)를 추가 파라핀이 완전히 녹을 때까지 섞는다.
  4. 흰색 과립 Vybar의 30g를 추가하고 같은 비커에 완전히 녹아; 녹인 후, 혼합한다.
  5. 느슨하게 뚜껑 유리 병을 닫습니다. 60 ° C 대류 오븐에 유리 병을 배치EN은 액상 성분을 유지한다. 이 오븐의 모든 침입을 수행하십시오.
  6. 100 ㎖의 각의 두 유리 병에 200 ㎖의 빨간색 왁의 전체 볼륨을 분할합니다. 한 침투에 대한 나누어지는 최종 매립에 대한 기타를 사용합니다.

1.3) 직렬 블록 얼​​굴 이미징에 대한 임베딩 산호 조직

  1. 인산염 완충 생리 식염수에 (3 배 5 분) (파라 포름 알데히드 4-5 ° C에서 3-6개월) 산호 분야 (SI 비디오 1)에서 수집 및 저장 폴립을 씻고 준비가 이미지를 만들 때 석회. 24 시간 동안이나 용종의 CaCO3의 완전히없는만큼 때까지 ExCal 솔루션의 폴립을 석회. 샘플을 탈수 1X 크실렌 대체 한 후, 25, 50, 75, 및 100 % 에탄올 시리즈에서 단일 블록으로 여러 탈회 산호 폴립 부화.
  2. 100 % 자일 렌의 대체를 포함하는 예열 65 ° C의 오븐에서 처리 된 용종을 놓습니다. 창이에 의해 두 번 30 분 동안 품어신선한 용액에 겨. 폴립의 상부면 아래 및 상부 표면은 가능한 평탄한되는 방식으로 용종의 방향.
  3. 1, 1 : 1 및 1 : 2의 용액을 2 크실렌 대체물 및 50 ㎖의 팔콘 튜브에서 preinfiltration 왁스 (단계 1.1).
  4. 30 ~ 60 분마다 100 %의 preinfiltration 왁스의 3 배 인큐베이션 preinfiltration 왁스의 세 가지 농도를 증가, 산호 폴립을 품어.
  5. 주의 : 샘플의 두께에 따라, 단계 1.3.1-1.3.5 장기간에 따라 증가 될 수있다.
  6. 왁스를 포함하는 샘플을 이동 100 % preinfiltration 왁스의 3 배 배양 후에 (단계 1.2.6 참조).
  7. 30 분 후 삽입 왁스를 제거합니다. 신선한 삽입 왁스로 교체하고 65 ° C에서 4 시간의 최소 배양을 계속합니다.

1.4) 레드 왁스에 포함하기

  1. 블록 (흰색 왁스 배치와 상단에있는 스테인리스 스틸 트레이를 촬영하는의 샘를 들어)이 배치된다. 일단 왁스에 매립하기 때문에 필요한 샘플의 위치는 매립 붉은 왁스가 불투명으로 보이지 않게된다.
  2. 새로운 예열 된 스테인레스 스틸 삽입 금형 주위에 고 융점 왁스의 작은 방울을 넣고 식 힙니다. 단계 1.2.6에서 언급 한 바와 같이 제 2 용기에서 갓 녹은 내장 왁스의 작은 볼륨을 붓는다.
  3. 흰색 왁스 점 이상 빠르게 아래로 향하게 산호 폴립의 위치를​​ 다음 스테인리스 쟁반에 플라스틱 샘플 홀더를 배치하고 왁스는 플라스틱 금형의 표면까지 오도록 더 삽입 왁스를 붓는다.
  4. 65 ° C의 오븐에서 전체 설치를 타고 왁스가 완전히 경화 될 때까지 벤치 또는 차가운 표면에 냉각 할 수 있습니다.
  5. 이것은 하루 이틀에 6 시간 최대 걸릴 수 있습니다. 장기 저장을 위해 빛으로부터 보호 4 ° C에서 냉장고에 건조 된 블록을, 놓습니다.

1.5) 직렬 블록 얼​​굴 설정에서 단면

  1. TR블록 메신저 및 마이크로톰을 사용하여 1 μm의 섹션을 잘라. 그들은 분말처럼 될 것 같은 부분을 수집하지 마십시오. 우리는 단지 블록의 얼굴을 이미지화하는 것을 잊지 마십시오. 흰색 왁스가 사라지기 시작할 때 샘플이 나타납니다.
  2. 샘플보기 부분이 제거 될 때마다 블록이 포함 매끄러운면의 이미지를 캡처. 산호 폴립은 SI 비디오 2에서 사라질 때까지 계속합니다.
  3. 녹화 / 색소 / 산호 폴립의 자동 형광을 데리러 FITC 형광 필터를 사용하여 흑백 카메라로 이미지를 캡처합니다. 이미지 각 종에서 3-4 탈회 코어.

2 이미징 산호에서 두 개의 광자 형광 현미경

  1. 즉시 물에서 수확 각 컬렉션 (바다 해안)의 사이트에서 4 % 파라 포름 알데히드에 직경 인치에 대해 약 10 ~ 12 폴립을 포함, 산호 폴립 코어를 수정합니다.
  2. 영상까지 4 ° C에서 샘플을 보관하십시오. 세탁 코어는 일에 배치됩니다거꾸로 커버 유리 바닥 접시에 전자 같은 용액 (0.17 mm 두께).
  3. 10 배 (0.3 NA) 목표를 사용하여 780 nm의 여기, 이미지 두 개의 서로 다른 배율 (디지털 줌)에서 3-4 폴립에서 두 광자 레이저를 사용. 산호 폴립 형상과 높이도 촬상 대물의 작동 거리에 의해 제한되는 샘플 (보통 1~2밀리미터) 및 촬상 깊이 사이에서 변한다.
  4. 주위 5,000-10,000 이미지를 총, 10, 20 μm의 간격으로 z 축 통해 XY의 초점면 당 이미지와 50 ~ 100 이미지를 약 25 ~ 100 (5 × 5, 10 × 10 타일)를 수집하기 위해 타일 스캔 모드를 사용 / 산호 폴립.
  5. 네 용종 지역 이미지 셋은 코어와 산호 종을 나타냅니다. 참고 : 이미지 획득 시간은 2-5 시간 / 용종 지역마다 다릅니다.
  6. LSM 5는 3D 이미지 분석 및 렌더링 소프트웨어에서 3D 렌더링으로 시스템의 하드 디스크에 원시 데이터 형식으로 모든 이미지를 저장합니다.

3 차원 볼륨 렌더링과 VisualizatioSBFI의 n 및 두 개의 광자 형광 스펙트럼 데이터

  1. 프로그램 사각형 자르기 도구를 사용하여 하나의 용종에 포커스함으로써 파일 크기를 줄이고 컴파일 단일 TIFF 파일로 수집 소프트웨어 (8 비트 형식으로 파일을 저장하여도 파일 크기를 감소)하는 2D 데이터 자르기.
  2. Imaris 볼륨 알고리즘에 따라 모듈을 능가 프로그램에 SBFI 데이터의 조립 파일 (1.5.1 단계에서 수집) 또는 (2.1.4 단계에서 수집 된) 두 광자 광학 부분의 타일 여러 Z-스택을 엽니 다.
  3. 그림자 투영을 사용하여 3D 렌더링 SBFI 데이터를 전망이다. 복셀은 고체 표면 패턴 (SI 비디오 3)을 만들 역치 아르있는 isosurface 모드를 만듭니다.
  4. 산호의 3 차원 구조와 형태를 나타 내기 위해 XZ, XY에서 클리핑면 알고리즘을 사용하여 3D 돌기, 그리고 YZ 직교 모드를 시각화.
  5. Imaris 동일한 프로그램 키 프레임 애니메이션 모듈을 사용하여 돌기에 애니메이션 (SI 바이DEOS 3-7).
  6. 5 % 압축에서 비디오 파일을 생성하고 볼륨을 사용하여 AVI 형식의 동영상 클립을 생성 (SI 동영상 46), 3D 및있는 isosurface 양식 (SI 동영상 5, 7).

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Representative Results

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(본 연구를 위해 특별히 제조 된 그림 3) 사용자 정의 설계 SBFI 장치는 M.의 외부 표면의 질감과 형태의 첫번째 상세한 3D 디지털 고도지도 (DEM을)를 생산 annularis와 M. faveolature 산호 폴립 (그림 4SI 동영상 1-2). 이것은 각각의 동심 폴립 (도 4B, 4D 및 4E)의 중심으로부터 외측 방사 산호 조직되지 않았던 이전 누적 로브 이미지를 수득 하였다. 이 엽 (叶)은 반경 방향 바깥 쪽과 최하단의 고도 엽 (叶)이 결국 합성 및 폴립 사이 coenosarc 조직 합병과 조직 덮인 기본 및 보조 골격 격벽의 최상부 능선을 따라 적층되어있다. 산호 조직 샘플은 고온 침투와 삽입의 여러 단계를 통과하는 데에도 불구하고 3D 용종의 모양과 관련된 엽 (叶)은 잘 보존되었다. additio블랙 컬러는 각 샘플의 콘트라스트를 최대화하고 신호대 잡음비를 증가시키는 수단 도왔다 갖는 염료 N 성공적 불투명 배경 마스크. 3D 및 직교 평면 전체가 Z 축 (도 4b)을 따라 형광 성분의 분포를 보였다. 때로는 예측을 만들 때 명확성을 위해 제거 된 용종의 표면 세부를 가려 왁스 부스러기와 비행기가 있었다. 이 기술의 중요한 장점은 따라서, 여러 섹션을 가지고 나중에들을 정렬 할 필요가 없어, 어떤 두꺼운 샘플 내부의 세부 사항을 드러내이다. 최대 10mm 이상의 샘플 크기에서 최대 1 μm 인 AZ 해상도를 제공한다 (도 4a)를 수집 할 때 또한,이 기술의 화상이 이미 정렬되어 (마이크로톰에서 블록 홀더의 전체 구동 거리에 따라 ). 이것은 다른 자동 형광 (여러 개의 필터를 사용하여) 구성 요소뿐만 아니라 개별로를 구별 할 수있다주산 셀러는 높은 배율에서보기의 감소 필드가 허용 제공.

ApoTome 광학 절편 형광 현미경은 서브 밀리미터 해상도 산호 조직 세포 (주산 셀러와 색소) 및 표면 조직 구조의 분포를 한 것으로 밝혀졌습니다. 이 때문에, 6-13 μm의 직경 주산 셀러 쉽게 인식 및 조직 부피 당 세포 수에 대해 (도 5)로 정량화 될 수있다. 엽록소 형광 (녹색) 및 WGB 알렉사 647으로 표시 점액을 사용하여 듀얼 채널 이미지 수집이 (빨간색으로 표시), 용종의 주어진 위치 내에서 점액의 수준과 주산 셀러의 수를 정량화하는 것이 가장 일 (전공 및 부전공 용종의 격막)을 독립적으로 계산 될 수있다.

이러한 현미경 방식 외에, 우리는 또한 TPLSM 널리 두꺼운 생물학적 시료에 사용 비선형 기법을 적용 하였다. 에 이상 TPLSM의 주요 장점전자 - 광자 연속파 레이저는 점이다 : 여기 광 강도의 힘이 제곱되고 형광 물질이 제한에서 두 개의 연속 광자를 흡수하는 분자의 기회가 하나의 전자를 여기시키기 때문에 (1) 여기 초점 지점에만 발생 대물 필드의 깊이에 따라서 고유 confocality을 제공한다. 단일 광자 레이저와 달리, 샘플에 깊게 침투하면서 (2) 결과적으로 여기 광자의 손실이 없을 것이다. 또한, 대부분의 생체 조직 샘플은 또한 가시 광선을 흡수한다. 두 광자 여기가 (780 nm에서의 근적외선에서) 본질적으로 긴 때문에, 흡수도 실질적으로 최소화된다. 한편, 탄산 칼슘으로 이루어지는 산호 골격 거의 흡수 또는 이광자 광을 산란시킨다. 우리는 단지 산호 골격의 윤곽 표면에 개체의 분포를 결정하는 데 관심이 있기 때문에 마지막으로, 우리는이 양상 버전을 사용하여 깊이 영상을 발견산호 이미지에 적합 y를 입력합니다.

우리는 M.에서 사용 가능한 스펙트럼 서명을 특성화하기 위해 시도했다 annularis (그림 6-9). 여기에서 우리는 주산 셀러의 엽록소 형광이 약 675 nm의 (그림 6)를 중심으로하면서 780 nm의 두 광자 여기에서, chromatophore 자동 형광, 500 nm의 주위에 피크를 가지고 있음을 보여준다. 두 구성 요소 사이에 명확한 스펙트럼 거리가 동시에 증명이 방출 대역에서 두 검출기를 사용하여 이미징, 있기 때문에이 스펙트럼 데이터 (6-7 피규어)의 unmixing는 소프트웨어의 unmixing 알고리즘으로도 (그림 8) 가능하지만 대부분의 시간 절약 기술이 될 수 있습니다. 샘플은 바둑판과 조직의 전체 깊이 1~2mm 위에 묘화되는 경우에 특히 그러하다. 이 위치와 샘플 및 용종 당 수천 개의 이미지를 필요로 물리적 절편에 대한 필요성을 제거한다. 유통 오 F 자동 형광 색소는 시험이 산호 종 중 구별 (그림 9)입니다. 일 경우에, 우리는 산호 M. 아리스토 얕은 물에서 색소의 현저한 증가를 관찰 깊은 물 M.에 비해 annularis faveolata (그림 9와 SI 동영상 3, 4).

그림 1
섬의 먼 북서부 바람 불어가는 쪽 해안 플라 야 Kalki의 조사 지점의 위치를 보여 남부 카리브해의 쿠라 카오 그림 1 (A)지도. (B), 쿠라에 플라 야 Kalki에서 암초 - 신성하게 빛날 선반의 도식 단면, M.의 수심 분포를 보여주는 annularis와 M. faveolata. 세틸 / ftp_upload / 51,824 / 51824fig1highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림이
M.의 12m WD에서 현장 수중 현장 사진에서 그림 2 (A) 플라 야 Kalki, 큐라. (B)에서 faveolata는 M.의 개별 산호 폴립을 보여주는 (A)에서 이미지의 확대를 닫습니다 낮 조명 조건에서 faveolata (각 용종은 약 *으로 후퇴 표시되어 일부는 직경이 2mm이다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5 인치 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 51,824 / 51824fig3highres.jpg "너비 ="500 "/>
그림 3 직렬 블록 얼굴 영상 장비. (AB) 맞춤 설계된 현미경 홀더, 마이크로톰에 배치 시료의 블록 대향면 180에 Stereolumar 현미경을 보유하고있다. 각 부분을 분리 할 때, 블록 얼​​굴 화상이 목적으로 캡쳐하고 2D 데이터는 디지털로 보관 하였다. 샘플 블록이 소실 될 때까지 수행 하였다. 현미경은 X 및 전동 리드 스크류와 Z를 사용하여, Y 방향으로 이동되어, 조정은 샘플을 집중된다. 그것은 각각 1 μM 샘플 구획​​되는 경우, 블록 1 μM 전진되므로이 범위를 집중할 것을 유의해야 할 필요가 없습니다. XYMOT, 사용자 지정 XY 번역 동력 단계를 구축; FLS, 형광 광원; MT, 마이크로톰; MIC, 실체; CAM, Axiocam 흑백 카메라; BH, 블록 홀더; BF의 블록 얼​​굴샘플; FLL, 블록면에 형광 여기 스폿; OBJ, 현미경 목적; HIP, 휴먼 인터페이스 패널. 흑백 모드에서 1388 가로 X 세로 1040 픽셀의 차원에서 하나의 이미지는 XY 픽셀 1.25 μm의의 (단일) 해상도에서 수집 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
산호 M.의 그림 4 직렬 블록 얼굴 영상 annularis와 M. 플라 야 Kalki, 큐라.에서 수집 faveolata는 (A) 샘플 데이터는 Z에서 1 μm의 해상도에서 용종에서 얻은 각각의 2D 이미지의 약 800 이미지를 보여주는 갤러리를 설정합니다. 또 다른 산호 샘플에서 (B)는 단면이 2,00 통해 잘 갔다Z 0 μm의. 이미지가 Imaris 볼륨 시각화 알고리즘을 사용하여 그림자 투사에서 3D 볼륨에있는 모든 2D 조각의 여러 폴립 및 편집을 보이고있다. (B)에서의 시료의 XZ보기를 나타내는 (C) 직교 투영은, 하나는 2mm 이상 시료의 전체 깊이를 볼 수 있고, 화살표는 2D 슬라이스가 불량으로 인해 제거 된 흑색 라인을 나타낸다; 이 이미지는 M.에서입니다 annularis. SBFI 데이터의 3D 볼륨 (D),있는 isosurface 렌더링 (E) 및 시각화. (D) 측면과 중앙에서 단일 용종의 3D 볼륨 (그림자 투사)에 경도 섹션에서 용종의 형태를 보여주는 여러 산호 폴립. 어느 각도에서 단면 및 시각화 차원에서 가능하며 (SI 비디오 참조). 복셀은 3 차원 (D)에 퍼지 때문에 E.는 3D있는 isosurface 렌더링 표면은 산호 폴립의 표면과 그 상황의 윤곽을 보여줍니다인접 폴립 (SI 비디오 참조) 배열. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
산호 폴립의 그림 5 형광 현미경. (A) M.의 탈회 용종의 단면 faveolata (녹색으로 표시) 푸른 빛에서 엽록소 형광도 함께 주산 셀러와 붉은 조명 아래 몇 군데로 (빨간색으로 표시) 밀 배아 응집소으로 표시 점막 주머니를 전시. 이미지가 자동으로 채널이 바둑판과 스티치 계기 소프트웨어를 이용하여 정렬된다. (B) 확대 approxi (각 녹색 동그라미 개별 주산 셀러를 나타내는 (A)에 도시 된 박스의후면부로 6-8 녹색 직경 μm의) 표면의 점액 층 (적색), 두 채널의 병합. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
도 산호로부터 형광 항 이광자 스펙트럼 특성. LSM 710 시스템의 스펙트럼이 검출기를 사용하여, 전체 가시 광선 영역 (419-722 nm의)로부터의 형광 신호는 약 190 μM의 깊이에 걸쳐 주사 하였다. 이미지 Z 스택 대 x 축에 위치한 5 μm의 깊이 간격을 표시하고, y 축이 10 nm의 간격 (약 1154 이미지 보여 전체)에서 취득한 419-722 nm의 파장이다. 하나는 스펙트럼 성분이, 하나는 500 nm 내지 650 nm에서 초에 중심을 볼 수있다. 이광자 레이저 EXCI780 nm 인 테이션 파장이 방출 프로파일을 얻기 위해 사용되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
이 스펙트럼 성분의 특성도 7. (A) 배경 (블루)의 스펙트럼 프로파일, 색소 (녹색) 및 780 nm의 레이저의 광자 레이저 여기 파장에 의해 여기 엽록소 형광 (적색)에서 자기 형광. 스펙트럼이 겹쳐 여러 가지 빛깔의 스펙트럼 데이터의 오른쪽에 표시 및 의사 색깔의 방출 프로파일에 따라 산출했다. (B) 신호 스펙트럼과 (A)의 화상을 유도하기 10 nm의 간격으로 수집 된 개별 스펙트럼 쓰레기통. 참고 두 가지 구성 요소, 약 500 nm의 (chromatophore의 형광도) 및 675 nm의 (엽록소 형광)을 통해 기타를 중심으로 한. 것이 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8
도 7a 및도 7b에 동일 화상이, 스펙트럼 데이터가 소프트웨어를 사용하여 혼합되지 않은 제 및 해당 발광 피크 / 스펙트럼. M. 모두 annularis와 M. faveolata, 스펙트럼 성분뿐만 아니라, 자신의 방출 피크 매우 유사합니다. 큰 차이는, 그러나, 이들 스펙트럼 성분과 그 풍요의 위치에있다 (도 9 참조).ghres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9
M. 산호 폴립의 그림 9 개의 광자 형광 3D 이미지 annularis (AD)와 M. faveolata (EH). (AE)은 450-700 나노 미터에서 수집 된 광 신호와 함께, 두 개의 광자 레이저의 780 nm의 여기를 사용하여 구성 요소의 분리없이 스펙트럼 이미지화 하였다. (BF)을 동일한 자극 (780 나노 미터)를 회수하고 있지만,이 PMT 검출기는 두 개의 구성 요소로부터 데이터를 수집하는 동시에 사용한 예., 500-550 nm의 (녹색 chromatophore 자기 형광)과 다른 650- 하나 720 nm의 (빨강 - 엽록소 형광). (C와 G)의 깊이 코딩 된 이미지입니다(B와 F는), 빨간색은 가장 얕은이며 파란색은 2D에서 깊은 구성 요소이다. (DH)는 형광 산호의 표면에서만오고있다과 골격이 780 nm의 여기에서 어떤 형광이 없습니다 보여주는 각각을 통해 잘라 YZ 이미지 (B와 F)입니다. 이 산호 사이 chromatophore 내용에 상당한 차이가 있습니다. M. annularis 서식지 (0-10m WD)은 M.보다 얕고 faveolata 서식지 (10~20m의 WD). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10
그림 10 O를 연구 중 10 계층 적 공간 구조의 힘F 산호초 생태계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 S1
SBFI 데이터 또는 이미지 분석 소프트웨어를 사용 2Photon 현미경 하나에서 3D 렌더링 볼륨과있는 isosurface의 생성에 관련된 단계 (AI)를 나타내는 SI도 1 스크린 샷 (원료 표 참조). (A) 원료의 2D 슬라이스 하나의 평면을 도시 슬라이스 모드 데이터; (B) 모든 2D 조각의 3D 볼륨; (C)이자 (ROI) 선택의 영역으로있는 isosurface 생성 마법사; (D) 선택된 배경 공제와 알고리즘; (E)는 임계 값은 represen 픽셀 데리인가데이터 톤; (F) 표면의 중심 시드 점, (G) 볼륨 기반 필터 이물질과 잡음의 작은 부피를 제거하기 위해 적용된다; (H)있는 isosurface 렌더링 최종 3D; (I) 키 프레임 애니메이션 마법사는 SI의 동영상과 영화를 만들 수 있습니다. 최종 렌더링 된 이미지는 SI 동영상 3-7에서 모두 볼륨있는 isosurface 양식에 표시됩니다. 프로토콜은 3.1.3-3.1.5이 절차를 다루고 단계를 반복합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

소재 / 장비 회사 카탈로그 / 모델 번호 댓글 / 설명
산호 조직 해골 없음 없음 2.5 cm BIOP자연 서식지에서 한건데
아치 펀치 코어 링 장치 CS 오스본 및 회사 제 149 산호 생검 컬렉션
파라 포름 알데히드 전자 현미경 과학 RT 15700 16 % 사전 희석
Histoclear / Safeclear II 전자 현미경 과학 RT 64111-04 크실렌, 탈수 및 Deparafinization에 비 독성 대체
자일 렌과 에탄올 피셔 과학 피셔 과학 탈수
파라핀 왁스 리처드 알렌 과학 유형 H의 REF 8338 침투 솔루션
Vybar 촛불 메이커 없음 레드 왁스의 구성 요소
스테 아린 촛불 메이커 없음 레드 왁스의 구성 요소
수단 IV 피셔 화학 S667-25 레드 왁스 불투명 배경
밀 배아 응집소 (WGA) Life 기술 W32466 산호 점액 레이블을
연장 골드 Life 기술 P36095 안티 - 페이드 설치 미디어
불소 요리 세계 정밀 기기 FD-35-100 두 광자 이미징을위한
XY 모터, 드라이버 및 컨트롤러 린 공학 211-13-01R0, R325, R256-RO XY 병진 운동
핫 플레이트 코닝 DC-220 모든 왁스 녹는
대류 오븐 야마토 DX-600 침투 및 포함
조직 프로세서 라이카 ASP 300
마이크로톰 라이카 RM2055 처분 할 수있는 칼
스테레오 현미경 칼 자이스 Stereolumar V 12 1.5 배 (30mm WD) 목표
ApoTome와 형광 현미경 칼 자이스 Axiovert M 200, ApoTome I 시스템 용종의 얇은 부분을 이미징 : 주산 셀러를
Axiocam 카메라 칼 자이스 MRM 흑백 카메라 1388x1040 픽셀
를 AxioVision 소프트웨어 칼 자이스 버전 4.8 화상 취득 프로그램
두 광자 레이저 Spectraphysics 마이 타이 EHP, 펄스 레이저 (70 FS) DeepSee 모듈
레이저 스캐닝 현미경 칼 자이스 분광 검출기와 LSM 710 34채널 PMT 검출
선 (禅) 소프트웨어 칼 자이스 2010 이상 이광자 스펙트럼 화상 취득
Imaris 스위트 소프트웨어 비트 평면, 주식, 버전 7.0 이상 3D 볼륨, 이소 표면 렌더링, 시각화

표 1 주요 재료, 본 연구에 사용 된 장비, 현미경, 소프트웨어.

SI 비디오 1. 현장 수중 필드 비디오에서는 M.의 12m WD의 산호 서식지를 보여주는 플라 야 Kalki, 큐라 소에서 faveolata.

SI 비디오 2. 인터넷에 표시된 3D 렌더링 된 이미지의 개별 2D 직렬 블록 얼굴 이미지gure의 4E.

SI 비디오 3. 있는 isosurface 3D 렌더링 직렬 블록 얼굴 이미지는 산호 폴립의 지형을 보여주는 그림 4ESI 비디오 일에 발표했다.

SI 비디오 4. 산호 폴립 M.의 3D 볼륨 렌더링 된 원시 데이터를 두 광자 현미경 이미지 faveolata. 여자는 780 nm의 주산 셀러 (의사 색, 빨간색, 600 ~ 700 nm의)와 색소 (500-550 nm의 의사 색 녹색) 두 밴드 폭에서 동시에 캡처 방출이다.

SI 비디오 5. 3D 볼륨이있는 isosurface 스폿에 산호 폴립 M.의 두 광자 현미경 이미지를 렌더링faveolata. 여자는 780 nm의 주산 셀러 (의사 색, 빨간색, 600 ~ 700 nm의)와 색소 (500-550 nm의 의사 색 녹색) 두 밴드 폭에서 동시에 캡처 방출이다.

SI 비디오 6. 산호 폴립 M.의 3D 볼륨 렌더링 된 원시 데이터를 두 광자 현미경 이미지 annularis. 여자는 780 nm의 주산 셀러 (의사 색, 빨간색, 600 ~ 700 nm의)와 색소 (500-550 nm의 의사 색 녹색) 두 밴드 폭에서 동시에 캡처 방출이다.

SI 비디오 7. 산호 폴립 M.의 3D 볼륨 렌더링있는 isosurface 스폿 두 광자 현미경 이미지 annularis. 여기에서는 780 nm의 주산 셀러 두 밴드 폭 (PS에서 동시에 포착 발광이며eudo 색, 빨간색, 600 ~ 700 nm의)와 색소 (의사 색, 녹색, 500-550 nm의).

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Discussion

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산호초 연구는 해양 환경에서 작동을 동시에 물리적, 화학적 분석, 생물학적 현상을 포함하는, 고도의 학제 적 연구 노력이다. 복잡한 산호초 생태계의 연구는 따라서 최선의 상황에 맞는 프레임 워크 (그림 10) '10의 멱수'내에 완료됩니다. 이 그래픽 편집 산호 생태계 차원 공간의 넓은 범위 (10 -9 10 5m)를 다루고 있음을 보여줍니다. 또한,이 운동은 geobiological 필드를 결합하여 실험실 분석하는 데 필요한 다리 아르 1mm-1cm의 중간 길이 규모로 분석 것을 보여줍니다. 텐 프레임 워크의이 힘은 모델링, 물리적, 화학적 합성, 큐라 소 산호초 생태계를 제어 생물학적 매개 변수, 실험에 대한 상황 분석입니다.

본 연구는 완벽하게 통합 된 스위트 (을)를 적용하는 것이 첫 번째입니다FM F, SBFI과 CLSM 기법 증가 수심 외관상 건강한 산호의 반응을 추적한다. 이미지 전체 조직이나 두꺼운 생체 시료에 사용할 수있는 가벼운 현미경 도구 인해 흡수, 산란, 기타 현상 등을 포함하는 샘플 자체로 인한 광학 제약의 다양한 제한되어있다. 방금 지난 십 내 SBFI 주사 전자 현미경은 여러 생물학적 시료의 넓은 분야 SBFI 기반 이미징을 사용하여 초 고해상도 (31)뿐만 아니라, 광 현미경 이미징에 사용 하였다. 이것은 뇌에서 전체 심장 조직과, 땅, 광택했다 레이블 뼈를 포함하는 경우에도 샘플에 이르기까지의 분석을 포함하고, 각 섹션은 23-29을 만든 후 같은 시간에 몇 군데있다. 최근 형광 공 초점 현미경은 생체 시료 32 ~ 33에 윤곽, 모양, 단백질 및 안료의 분포를 나타 내기 위해 사용되었다. 그러나, 개별 산호 폴립의 헥타르의 3 차원 구조D 이전에 해결되지. 탄산 칼슘이 침투 의무가 샘플을 렌더링하고 정기적 마이크로톰을 사용하여 단면 전에 제거해야하기 때문에 산호 샘플 SBFI에 대한 전제 조건은, 탈회이다.

이광자 형광 현미경은 생물학적 조직의 분석을 위해 불가결 이것은 어디 인해 독특한 이광자 여기 현상이다. 이는 비선형 두 광자 여기에 탈회 단계가 효과적으로 제거되었다 본 연구에서 산호 조직의 확장 깊이 침투 33-34을 주도 (34)을 현상. 또한, 이광자 레이저 사전 보상 모듈은 별도로 침투 깊이를 개선 훨씬 짧은 펄스 폭을 제공. 시료 측에서 보낸 탄산 칼슘은 780 nm에서의 근적 외광을 흡수하지 않고, 침투 깊이는 목표의 작동 거리에 의해 일반적으로 제한된다. 또 다른 단점 오f를 탈회와 산호 골격의 제거는 샘플이 여러 탈수 및 수분 보충의 단계를 모두 물이없는 왁스에 삽입 한 후 훨씬 더 힘들어 조직 볼륨 추정치를 만드는 산호 조직의 구조적 무결성의 손실이다. 이것은 처리 전후 모두 산호 조직 부피를 결정하는 중요성을 강조한다.

산호의 형광 단백질의 공 초점 특성은 그레이트 배리어 리프 (Great Barrier Reef)의 산호에 완료되고 보호 스펙트럼 특성은 산호 서식지 (32)의 깊이와 상관 관계가있다. 그러나 본 연구에서 우리는 입 조직 제외 심해 산호 도처 색소의 실질적인 감소가 있다는 이광자 현미경을 사용하여 처음으로 설명한다. 또한, 색소에 대하여 주산 셀러의 분포의 뚜렷한 변화가 M. 깊이에 걸쳐 횡단 관찰되었다 annularis, 어디 있나전자 얕은 물 산호 조직이 완전히 색소으로 덮여있다. 고배율 촬상 (도 8C8D)에 의해 제공되는 분해능으로, 우리는 이제 정확하게 주산 셀러가 차지하는 면적과 체적을 계량 할 수 있으며, 자신의 조직 밀도 비는 다른 세포 성분에 대해 결정될 수있다. 이와 함께, 본 연구에서 SBFI의 통합 및 이광자 형광 스펙트럼 이미징은 산호 조직의 형태와 구조로 매우 중요 새로운 통찰력을 산출했다. 이 데이터는 개별 용종 단계에서 또는 전체 산호 머리에 식민지 폴립 사이의 상호 작용의 상황에 맞는 수준에서 중, 산호 조직의 개별 구성 요소를 계량화하는 데 도움이 될 것입니다. 지금 해수면 수심과 조도의 변화에​​ 산호 holobiont의 적응 응답을 허용하는 이러한 상황은 정량적으로 추적하고 예측한다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coral Tissue Skeleton 2.5 cm Biopsy from natural habitat
Arch Punch Coring Device C.S. Osborne and Company No. 149 For Coral biopsy collection
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences RT 15700 16% Pre-diluted
Histoclear/Safeclear II Electron Microscopy Sciences RT 64111-04 Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization
Xylene and Ethanol Fisher Scientific Dehydration
Paraffin Wax Richard Allen Scientific Type H REF 8338 Infiltration solution
Vybar The Candle Maker Component of Red Wax
Stearin The Candle Maker Component of Red Wax
Sudan IV Fisher Chemical S667-25 Red Wax-Opaque background
Wheat Germ Agglutinin (WGA) Life Technologies W32466 For labeling  Coral Mucus
Prolong Gold Life Technologies P36095 Anti-fade mounting media
Fluoro Dish World Precision Instruments FD-35-100 For two-photon imaging
XY Motor, Driver and Controller Lin Engineering 211-13-01R0, R325, R256-RO XY Translational Movement
Hot Plate Corning DC-220 Melting all wax
Convection Oven Yamato DX-600 Infiltration and Embedding
Tissue Processor Leica ASP 300 Dehydration, Infiltration
Microtome Leica RM2055 Disposable knifes
Stereo Microscope Carl Zeiss Stereolumar V 12 1.5x (30 mm WD) Objective
Fluorescence Microscope with ApoTome Carl Zeiss Axiovert M 200, ApoTome I System Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae
Axiocam camera Carl Zeiss MRm Monochrome camera 1388x1040 pixels
Axiovision Software Carl Zeiss Version 4.8 Image acquisition program
Two-Photon Laser Spectraphysics Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) With DeepSee module
Laser Scanning Microscope Carl Zeiss LSM 710 with Spectral Detector 34 channel PMT detection
Zen Software Carl Zeiss 2010 or above for two-photon and spectral image acquisition
Imaris Suite Software Bitplane, Inc., Version 7.0 or above 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization

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References

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복합 광학 현미경 방법 카리브 암초 건물 산호의 폴립 조직 형태와 구조를 밝히기
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Sivaguru, M., Fried, G. A., Miller, C. A. H., Fouke, B. W. Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals. J. Vis. Exp. (91), e51824, doi:10.3791/51824 (2014).More

Sivaguru, M., Fried, G. A., Miller, C. A. H., Fouke, B. W. Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals. J. Vis. Exp. (91), e51824, doi:10.3791/51824 (2014).

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