Introduction
La transplantation de la cornée est un des types les plus communs et succès de la transplantation réalisée chez l'homme. Les raisons pour lesquelles cette intervention chirurgicale est pratiquée sont le résultat de blessures, de maladies infectieuses 1, ou d'autres formes de la maladie de la cornée non-infectieuse 2. Les chiffres de l'Association of America Banque d'yeux indiquent que plus de 46 000 ont été réalisées en 2011 (voir le site Web à l'adresse: restoresight.org/eye_banks/eye_banks.html). Une indication de son succès est que les taux de défaillance d'un an pour greffes de cornée allogéniques vont de 10 à 15% et à 5 ans, le succès est au-delà de 70% 3-8. Comme de nombreuses études ont démontré le succès des allogreffes de la cornée est directement lié au fait que l'oeil est un site immunologiquement privilégié. Les facteurs responsables de l'état des cornées comme un site de privilège immunitaire comprennent l'absence de ces deux vaisseaux sanguins et lymphatiques dans la cornée, une absence relative de cellules présentatrices d'antigènes, facteurs produite par la cornée qui Suppress funtions immunitaires effectrices 9-15, faible expression de antigènes du CMH 16, et l'expression de FasL 17-20.
Cependant, en dépit de ces facteurs prédisposants ces greffes de succès, ils ne subissent rejet 3-7. Par conséquent, la compréhension de ces mécanismes qui interviennent dans ce rejet et de tester différentes thérapies pour prévenir le rejet est d'une importance critique. À cette fin, nous décrivons ici un modèle murin de greffe de la cornée qui a été en usage depuis plus de 20 ans pour étudier la greffe de cornée dans un environnement expérimental contrôlé. Comme les réponses de transplantation impliquent de nombreux facteurs différents qui travaillent de concert, qui sera ultime de déterminer si le tissu transplanté échoue ou réussisse, il est impossible de comprendre l'importance de ces facteurs dans un modèle in vitro. Par conséquent, les études sur des animaux intacts sont nécessaires pour déterminer quels facteurs sont importants à succès ou failure du tissu transplanté.
Alors que d'autres espèces d'animaux ont été utilisés pour étudier la greffe de cornée, le modèle murin a plusieurs avantages par rapport à l'utilisation d'autres espèces. Le premier est l'existence de nombreuses souches de souris qui expriment certains transgènes ou ont été gène ciblées à l'absence d'expression de facteurs immunologiques spécifiques dont la fonction dans la transplantation peut être mieux étudié. En outre, il ya beaucoup de réactifs (deux facteurs recombinantes et d'anticorps qui neutralisent facteurs) qui sont spécifiques pour les souris et qui ne existent pour de nombreuses autres espèces d'animaux. En raison de l'existence de ces facteurs, ce modèle a été largement utilisée pour identifier les facteurs impliqués dans la cornée allogreffe réponses aiguës 15, 17,18,20 -29. En outre, un grand nombre de facteurs impliqués dans la transplantation de la cornée sont également connus pour être fonctionnels dans la transplantation d'autres tissus.
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Protocol
REMARQUE: Tous les animaux utilisés dans cette procédure sont traités conformément à l'Association pour la recherche en vision et déclaration d'ophtalmologie pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research ainsi que les lignes directrices établies par le comité de surveillance de l'animal à l'Université de Saint Louis.
NOTE: Tous les instruments et solutions chirurgicales sont stérilisés avant la chirurgie pour limiter l'infection microbienne de l'œil. Il convient de noter que, bien que les animaux font l'expérience de la douleur de cette procédure, nous ne comptons pas les analgésiques. La raison en est que tous les analgésiques sont anti-inflammatoires et puisque les réponses de transplantation de la cornée d'une inflammation, l'utilisation de médicaments anti-inflammatoires pourrait compromettre notre capacité à déterminer les facteurs qui sont impliqués dans l'échec de la greffe de cornée.
1. Anesthésie
- Placez la souris donateurs et bénéficiaires sous anesthésie générale par injections IP de kétamine (86.98 mg / kg) et de xylazine (13,04 mg / kg).
- Gardez la souris receveuse sous anesthésie tout au long de la procédure qui prend généralement 30 minutes à une heure. Par conséquent, surveiller en permanence la souris pour des signes de reprise de conscience.
- Appliquer puralube pommade à l'œil qui ne sera pas subir une intervention chirurgicale après que l'animal est anesthésié pour prévenir la sécheresse.
2. La greffe de cornée
- Obtention du bouton cornéen du donneur.
- Une fois que l'animal est anesthésié complètement, réaliser une mydriase adéquate par administration d'un couple de gouttes pour les yeux de 1% de tropicamide et 2,5% de chlorhydrate de phényléphrine.
- Placez la tête de l'animal donneur horizontalement sur une planche placée sur un support mobile robuste. Fixer la tête avec une bande de ruban à travers le goulot de sorte que l'oeil est dans une position horizontale tout au long de la totalité de l'opération.
- L'utilisation d'un trépan de 2 mm de diamètre, dont la pointe a été teint avec du bleu de méthyle, surtapisser le site de la greffe de cornée centrale.
- Avec une lame tranchante, pénétrer la cornée et injecter Healon dans la chambre antérieure de l'approfondir pour réduire le risque de dommages à l'endothélium des bailleurs de fonds et l'objectif sous-jacent.
- Exciser le greffon du donneur avec Vannas ciseaux et placer dans un plat contenant une solution saline équilibrée de Hanks jusqu'à utilisation.
- Après la greffe du donneur a été enlevé, euthanasier la souris donneuse par inhalation de CO 2.
- Préparation du lit de greffe.
- Répétez les mêmes étapes comme décrit dans 2.1.1 à 2.1.2 pour le destinataire.
- L'utilisation d'un diamètre de 1,5 mm trépan, décrire le site de la greffe de destinataire.
- Avec une lame tranchante, pénétrer la cornée et injecter Healon dans la chambre antérieure de l'approfondir pour réduire le risque de dommages à l'objectif sous-jacent.
- Retirez le bouton central de la cornée exposée du destinataire à l'aide Vannas ciseaux et jetez-le.
- Suturer lagreffe
- Placer la cornée du donneur au cours de la greffe lit dans la cornée du receveur. Assurez-vous que Healon adéquate est sous la cornée du donneur à protéger les cellules du donneur endothéliales des dommages causés par un contact direct avec l'objectif.
- Utilisation super fine microforceps à pointe, placer la première bouchée de 11-0 suture en nylon sur le côté des bailleurs de fonds, à travers le donateur avec 90% de profondeur de pleine épaisseur au côté du destinataire, puis attacher.
- Une fois que la cornée est ancré en place, effectuer des sutures interrompues midcardinal tels que la cornée a 8 à 10 points de suture au total et la cornée du donneur est bien aligné avec et fixé au destinataire lit de greffe de cornée.
- L'approfondissement de la chambre antérieure
- Approfondir la chambre antérieure par injection HBSS ou bulle d'air dans la chambre antérieure et vérifier doucement l'intégrité de la greffe de cornée pour une fuite avec une éponge de cellulose.
NOTE: Si la chambre antérieure ne peut être réformé alors il ya une forte probabilité de cataract qui fera les évaluations futures de la cornée transplantée très difficile et aussi potentiellement conduire à des bailleurs de fonds de la cornée dysfonctionnement endothélial et l'échec ainsi greffe.
- Approfondir la chambre antérieure par injection HBSS ou bulle d'air dans la chambre antérieure et vérifier doucement l'intégrité de la greffe de cornée pour une fuite avec une éponge de cellulose.
- L'évaluation finale
- Observer l'oeil pour déterminer que la pupille est ronde et la profondeur de la chambre antérieure est normal.
NOTE: Si l'élève est pas rond, cela indique que pendant la suture de l'iris a été endommagé et donc la greffe est considéré comme un échec technique. - Appliquer une pommade antibiotique pour les yeux. En option: Fermez la paupière avec une suture de soie 7-0.
- Observez souris jusqu'à ce qu'ils soient complètement éveillé et ensuite individuellement les loger pour un minimum de deux jours après la chirurgie.
- Observer l'oeil pour déterminer que la pupille est ronde et la profondeur de la chambre antérieure est normal.
3. Suture Removal
- Dans les cas où le couvercle suture est utilisé, anesthésier les souris comme décrit ci-dessus et retirer le couvercle de la suture à 48 h.
- Anesthésier les souris au jour 7 post-opératoire. Retirez le Sutures fixation de la greffe de cornée. Une fois les sutures sont enlevées et l'animal a pleinement éveillé, retourner dans sa cage.
4. l'évaluation clinique
- Examiner l'œil pour les indications de complications liées aux procédures qui comprennent, la cataracte (opacification du cristallin), hyphéma (sang dans la chambre antérieure), une chambre antérieure qui ne sont pas de la bonne profondeur, ou l'opacité importante de la cornée. Pensez à ceux qui démontrent ces complications comme «compromis» et les euthanasier par inhalation de CO 2.
- Effectuer tous les examens sur des souris non anesthésiées. Maintenez la souris avec retenue d'une part ainsi de la souris pour que l'autre main peut proptose l'œil afin de permettre une meilleure vue de l'œil. Une fois que les observations sont terminées, revenir à l'animal de sa cage.
- Vous avez déjà un observateur familier avec les groupes de traitement évaluer cornées transplantées des signes de greffe de cornée 2 à 3 fois par semaineles épisodes de rejet ou échec de la greffe de la cornée. Utilisez soit le microscope chirurgical ou un biomicroscope lampe à fente horizontale pour ces observations.
- Évaluer chaque cornée pour l'opacité en utilisant une échelle de 0 à 5. L'échelle est définie comme suit:
- Attribuez une note de 0 à ces cornées qui ne présentent aucun signe d'opacité.
- Attribuer une note de 1 à ces cornées présentant une opacité superficielle minime.
- Attribuer un score de 2 à cornées qui affichent opacité légère et profonde, mais l'élève sous-jacente et de l'iris sont encore discernable.
- Attribuer un score de 3 à cornée afficher stromale opacité dans laquelle les iris ne peuvent être vus en détail à l'exception des marges d'élèves.
- Attribuer un score de 4 à cornée afficher dense opacité stromale et si aucune des structures sous-jacentes peuvent être consultés.
- Attribuer un score de 5 à cornée afficher opacité complète et intensive œdème du stroma, avec pupille et l'iris totalement obscurci.
- Évaluer également tous cornée pour le degré d'infiltration des vaisseaux sanguins (néovascularisation) en utilisant une échelle de notation de 1 à 8. Pour ce faire, voir la cornée en tant que 4 quadrants égaux et déterminer la quantité de vaisseaux sanguins dans chacun de ces quadrants avec une marquer cette gamme de volonté de 0 (pas de navires) à 2 pour vascularisation extensive de ce quadrant. Ajouter les scores individuels de chaque quadrant de calculer le score final de la néovascularisation.
- Classer cornées comme aiguë rejetées si elles ont un score de 3 pour deux observations consécutives de temps les points jusqu'à 5 semaines.
- Classer les souris dont les cornées étaient claires à 5 semaines, mais développer une opacification parfois> 45 jours après la greffe, avec un score de 3 à deux points de temps consécutifs, comme ayant le rejet d'allogreffe de cornée tard terme subi. Utiliser les courbes de survie de Kaplan-Meier pour analyser la survie du greffon.
- Évaluer chaque cornée pour l'opacité en utilisant une échelle de 0 à 5. L'échelle est définie comme suit:
5. La manipulation du modèle
en-left: 40px; ">- Pour préparer des cellules individuelles, premier euthanasier la souris donneuse. Ensuite, retirez la rate.
- Placer la rate dans un tamis cellulaire et perturber avec un piston de seringue d'une seringue de 3 ml.
- Laver les cellules et remettre en suspension dans 10 ml de solution saline équilibrée de Hanks.
- Retirer 10 pl de suspension cellulaire et ajouter 10 ul de 0,4% de bleu trypan et mélanger. Ajoutez à cela hémocytomètre et compter les cellules dans la grille centrale. Le nombre de cellules dans le tube est le nombre de cellules x 10 4 x 2 (facteur de dilution dans le bleu trypan) x 10 (volume dans le tube).
- Anesthésier les souris comme décrit précédemment.
- Pratiquer des injections à l'aide d'un microscope à dissection. Pour chaque injection intracamérulaire, utiliser 10 6 cellules de la rate dans un volume de 0,005 ml et 0,25 ml d'un microlitre seringue munie d'une aiguille G 33.
NOTE: D'autres manipulationsdu modèle peut être réalisé par le traitement des animaux avec des réactifs qui agissent comme des antagonistes ou agonistes de déterminer le rôle qu'un facteur particulier peut jouer après une chirurgie de la cornée allogreffe orthotopique.
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Representative Results
Le modèle murin de greffe de la cornée a été utilisé pour plus de 20 ans à caractériser avec succès des mécanismes à la fois de l'allogreffe de cornée rejet 19-23 et la cornée allogreffe acceptation 13, 15,16,18, 24-27. Ce modèle a été utilisé pour établir l'importance de l'expression de FasL dans la cornée allogreffe acceptation, par le fait que les animaux qui manquent de FasL sont pas en mesure d'accepter les allogreffes de cornée 15. Il a également été utilisée pour démontrer que le facteur vasculaire récepteur 1 morpholino traitement de croissance de l'endothélium de la cornée augmente de manière significative la survie du greffon 28. Dans un rapport très récent de ce modèle a été utilisé pour tester si le prétraitement des souris avant la prise de greffe de la cornée avec des corticostéroïdes lieu tout bénéfice thérapeutique 29. Les auteurs ont montré que cette pré-traitement a amélioré le taux de greffons de cornée 29 de survie. Ces rapports montrent clairement que le principal avantage de ce modèle est queon peut étudier dans un animal vivant ces choses que l'on croit être important pour la réussite de greffes de cornée chez l'homme.
Des études antérieures de ce laboratoire ont indiqué que l'un des principaux mécanismes responsables de rejet d'allogreffe de cornée est la mise en place de systémique hypersensibilité de type retardé (DTH) à allo-spécifiques exprimées par l'allogreffe de la cornée 19, 20. Depuis, nous avons utilisé ce modèle pour vérifier si l'établissement de la tolérance systémique allo allo SRD à manifestée par le donneur d'allogreffe de cornée améliore la survie de ces greffes. Comme le montre la Figure 1, des souris BALB / c rendues tolérantes à / 10 (B10) des alloantigènes C57BL n'a pas amélioré la cornée allogreffe acceptation telle que mesurée par le temps moyen de survie pour les allogreffes de cornée. Ainsi, le temps moyen de survie des cornées a été rejetée même si la souris ont été rendues tolérantes ou non. Nous avons également effectué des études similaires à partir des réponses de greffe de peau comme un moyende tester l'efficacité de systémique tolérisation SRD. Ces études ont démontré que lorsque la tolérance SRD a été créé chez la souris BALB / c vers B10 allo, greffes de peau portant certains (B10.D2 et C.B10-H-2 b) ou tous B10 allo ne pas afficher tout augmenté le temps moyen de survie ( la figure 2). Nous avons conclu de ces études que les souris BALB / c qui avaient établi des réponses DTH spécifiques de l'antigène ne tirent aucun bénéfice mesurable de cette tolérance soit pour les allogreffes de cornée ou de la peau. Ces données indiquent également que l'information générée étude d'un modèle murin de greffe de cornée sera, à certains moments, être directement applicable à d'autres formes de transplantation de tissu solide.
Figure souris / c 1. BALB ont été injectées dans la chambre antérieure avec 10 6 cellules de rate provenant de / 10 souris (B10) C57BL. (p> 0,05).
Figure 2. L'injection de cellules de la rate dans la chambre antérieure n'a pas d'incidence survie des greffes de peau allogéniques. Des souris BALB / c ont été injectées dans la chambre antérieure avec 10 6 cellules de la rate de souris C57BL / 10 souris. Après une semaine, les souris ont été greffées séparément avec la peau de souris C57BL / 10, n = 10, B10.D2, n = 7, C.B10-H-2 b, n = 7 par rapport à des souris etles souris qui ne sont pas injectés et greffées à des souris C57BL / 10 peau, n = 10. Les résultats sont exprimés comme le temps de survie moyenne + SEM.
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Discussion
Le modèle murin de greffe de cornée décrite ici permet à l'enquêteur d'étudier le rejet d'allogreffe de cornée humaine dans un modèle qui permet de prédire quels sont les facteurs associés à la fois meilleur rejet 15,17,18,20, 26-30 et 21-25 acceptation de la cornée allogreffes. Contrairement à la transplantation de la cornée humaine, dans laquelle les patients reçoivent soit un traitement de stéroïde topique ou systémique pour traiter ou prévenir une ou l'autre de rejet 31, ce modèle est généralement utilisé pour déterminer les facteurs qui sont pertinents pour le rejet d'allogreffe, en l'absence d'un tel traitement. En plus d'un modèle pour le rejet d'allogreffe de cornée aiguë, qui survient généralement dans les 30 à 40 jours suivant la transplantation, nous présentons également un modèle de fin de mandat de ce rejet qui survient 45 jours post-greffe chez la souris et imite de nombreuses caractéristiques de la fin -terme et le rejet chronique 32,33 qui jusqu'à présent n'a pas été modélisé dans les animaux.
Til les atouts du modèle ne sont que l'on peut disséquer différents mécanismes qui sont responsables pour le taux relativement élevé de la cornée allogreffe acceptation ainsi que de déterminer quels mécanismes sont les plus responsables de l'échec de l'allogreffe de la cornée. Ce modèle permet également de tester différentes stratégies thérapeutiques chez un animal qui possède un système immunitaire qui est très similaire au système immunitaire humain. A cet effet, l'existence d'un grand nombre de réactifs qui réagissent avec des facteurs de souris ainsi que des souris transgéniques et de gènes-cible, permettre à l'évaluation de ce que de nombreux autres facteurs que ce ne serait le cas avec d'autres espèces. Cette capacité à évaluer de nombreux facteurs différents qui sont importants pour le succès et l'échec des allogreffes de cornée est un important positive en faveur de l'utilisation de ce modèle murin par rapport à d'autres modèles animaux dans lesquels la chirurgie est plus facile à réaliser en raison de l'augmentation de la taille des yeux de ces espèces.
Bien qu'il existe plusieurs faiblesses de ce modèle,nous croyons que les forces les emportent de loin. L'un des plus important, qui a été fait allusion ci-dessus, est l'expertise technique impliqué dans l'exécution de la greffe de cornée chez la souris. En raison de la petite taille de l'oeil de souris, ce qui nécessite une personne qui est apte à la microchirurgie, à la fois dans l'exécution de la transplantation, ainsi que l'enlèvement de sutures. Par conséquent, la pratique répétée est nécessaire pour maîtriser et maintenir leur compétence à cette technique. Le second point faible est que, bien que les souris sont très semblables à l'homme, ils ne sont pas les mêmes. Ces animaux présentent une plus grande tendance à la néovascularisation, de faire cornées humaines. En outre, ce modèle ne sera pas imiter les interventions chirurgicales destinées à traiter la dysfonction des cellules endothéliales comme la dystrophie de Fuch 2. Avant de greffes de pleine épaisseur de l'année dernière, comme ceux utilisés dans le protocole décrit étaient employés. À l'heure actuelle, la transplantation endothéliales impliquant seulement la partie de l'endothélium de la cornée ont été employées
Pour la fin de rejet terme (> 45 jours) deux facteurs uniques à cette version du modèle se démarquer. La première faiblesse de cette forme de modèle étant que les souris doit être maintenue pour un minimum de deux à trois mois pour étudier le rejet en fin de terme. Et d'autre part, les cornées doivent d'abord survivre réactions de rejet aigu potentiels. Ces rejets aigus se produisent dans 50 à 70% des receveurs 17, 20 -24. Ainsi, pour étudier le rejet en fin de mandat d'un se greffer des souris dont les greffes seront rejetées aiguë et ne survivra pas jusqu'à 45 jours post-greffe. Afin d'atténuer ce que nous avons constaté que le taux de rejet chez les souris mâles est inférieure à celle observée chez les femelles (manuscrit en préparation) et donc à étudier le rejet de fin de terme, il est conseillé que seules les souris mâlesêtre utilisés. Nous avons également tenté de prolonger la survie des allogreffes de cornée avec un traitement aux stéroïdes, mais cela n'a pas été d'être (observations personnelles) particulièrement utiles et donc ne recommande pas que le traitement stéroïde être utilisé. En dépit de ces complications et la mise en garde que probablement environ la moitié ou un peu plus de ceux greffés avec des cornées allogéniques resteront clair qu'après 45 jours, ceci est encore un modèle très utile pour étudier les facteurs qui sont pertinents pour le rejet en fin de terme.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Surgical Microscope | Zeiss | Rebuilt | |
| 1 ml Syringe | BD | 305122 | |
| 3 ml Syringe | BD | 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309602 | |
| Vannus Scissors | Stortz | E-3387 | |
| 11-0 Sutures | Alcon | 717939M | |
| Trephine 2.0 mm | Katena | K 2-7520 | |
| Trephine 1.5 mm | Katena | K 2-7510 | |
| Tricaine Hydrochloride 0.5% | Alcon | NDC 0065-0741-12 | |
| Healon | Abbott | Healon OVD | |
| Forceps | FST | 11251-20 | |
| 7-0 Sutures | Alcon | 8065 | |
| 2.5% Phenylephrine HCl | Alcon | NDC 61314-342-02 | |
| 1% Tropicamide | Bausch & Lomb | NDC-24208-585-59 | |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 7654-01 | |
| 33 gauge needle | Hamilton | 90033 | |
| Cell Strainer (100 μm nylon) | BD Falcon | 352360 | |
| Hemocytometer | Cardinal Health | B3175 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 |
References
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