Introduction
O transplante de córnea é um dos tipos comuns e mais bem sucedidas do transplante realizados em seres humanos. As razões pelas quais esta cirurgia é realizada são resultado de uma lesão, uma doença infecciosa, ou outras formas de doença não infecciosa de córnea 2. Números da Associação Eye Bank of America indicam que mais de 46 mil foram realizados em 2011 (veja o site em: restoresight.org/eye_banks/eye_banks.html). Uma indicação do seu sucesso é que as taxas de falha de um ano por córneas alogênicos variam de 10 a 15% e em 5 anos o sucesso é superior a 70% 3-8. Como vários estudos têm demonstrado, o sucesso de aloenxertos da córnea está directamente relacionada com o facto de o olho é um local imunologicamente privilegiado. Os factores responsáveis para o status de córneas como um sítio imunologicamente privilegiado incluem a falta de ambos os vasos sanguíneos e linfáticos na córnea, uma ausência relativa de células apresentadoras de antigénios, factores produzidos pela córnea que suppress Funtions efetoras imunes 9-15, baixa expressão de antigénios MHC 16, e a expressão de FasL 17-20.
No entanto, apesar destes fatores predisponentes desses enxertos para o sucesso, eles passam por rejeição 3-7. Consequentemente, a compreensão desses mecanismos que mediam essa rejeição, assim como testar várias terapias para prevenir a rejeição é de fundamental importância. Para esse fim, nós descrevemos aqui um modelo murino de transplante de córnea, que tem sido usado por mais de 20 anos para estudar o transplante de córnea em um ambiente experimental controlado. Como as respostas de transplante envolve muitos fatores diferentes que trabalham em conjunto que irá final determinam se o tecido transplantado falhar ou for bem-sucedido, não é possível compreender a importância desses fatores em qualquer modelo in vitro. Consequentemente, estudos utilizando animais intactos são necessários para determinar quais fatores são importantes para o sucesso ou failure de tecido transplantado.
Enquanto outras espécies de animais têm sido utilizados para estudar o transplante de córnea, o modelo murino tem diversas vantagens quando comparado com a utilização de outras espécies. A primeira é a existência de muitas cepas de camundongos que expressam certos transgenes ou foram gene-alvo que falta expressão de fatores imunológicos específicos, cuja função no transplante podem ser melhor estudados. Além disso, existem muitos factores de ambos os reagentes (recombinantes e anticorpos que neutralizam factores) que são específicos para os ratos, e que não existem para muitas outras espécies de animais. Por causa da existência desses fatores, este modelo tem sido amplamente utilizado para identificar os fatores relevantes envolvidos em respostas de córnea aguda de aloenxerto 15, 17,18,20 -29. Além disso, muitos dos factores envolvidos no transplante de córnea são também conhecidos para serem funcionais no transplante de outros tecidos.
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Protocol
NOTA: Todos os animais utilizados neste procedimento são tratados de acordo com a Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia declaração para o Uso de Animais em Oftálmica e Vision Research, bem como as diretrizes estabelecidas pelo animal comitê de supervisão em Saint Louis University.
Nota: Todos os instrumentos cirúrgicos e soluções são esterilizadas antes da cirurgia para limitar a infecção microbiana do olho. Deve notar-se que, enquanto os animais experimentam alguma dor com este procedimento, não empregamos analgésicos. A razão para isto é porque todos são analgésicos e anti-inflamatórios vez que as respostas de transplante de córnea envolvem a inflamação, a utilização de drogas anti-inflamatórias iria comprometer a nossa capacidade para determinar quais os factores que estão envolvidos na falha de enxerto da córnea.
1. Anestesia
- Coloque ratos doadores e receptores sob anestesia geral por meio de injeções IP de cetamina (86.98 mg / kg) e xilazina (13,04 mg / kg).
- Mantenha o mouse destinatário sob anestesia durante todo o processo, que normalmente leva 30 minutos a uma hora. Consequentemente, monitorar constantemente o mouse para detectar quaisquer sinais de recuperar a consciência.
- Aplicar puralube pomada para o olho que não vai passar por cirurgia depois que o animal é anestesiado para prevenir o ressecamento.
2. Alongamento de córnea
- Obtenção do botão da córnea do doador.
- Uma vez que o animal é completamente anestesiados, atingir midríase por administração adequada de um par de gotas oculares de tropicamida a 1% e 2,5% de cloridrato de fenilefrina.
- Posicione a cabeça do animal doador horizontalmente em uma placa colocada em um suporte móvel resistente. Fixar a cabeça com uma tira de fita adesiva em volta do pescoço para assegurar que o olho está em uma posição horizontal ao longo de toda a operação.
- Usando um trephine 2 mm de diâmetro, cuja ponta foi tingida com azul de metileno, para foraforrar o local do enxerto da córnea central.
- Com uma lâmina afiada, penetrar na córnea e injectar Healon dentro da câmara anterior para a aprofundar a reduzir a possibilidade de danos no endotélio dador e lente subjacente.
- Extirpar o enxerto doador com Vannas tesoura e coloque em um prato contendo solução salina equilibrada de Hanks até o uso.
- Após o enxerto de doadores tem sido removido, eutanásia do camundongo doador através de inalação de CO2.
- Preparando o leito do enxerto.
- Repita os mesmos passos como descrito em 2.1.1 através 2.1.2 para o destinatário.
- Usando uma trefina de diâmetro 1,5 mm, delinear local do enxerto destinatário.
- Com uma lâmina afiada, penetrar na córnea e injectar Healon dentro da câmara anterior para a aprofundar a reduzir a possibilidade de danos para a lente subjacente.
- Remova o botão central da córnea delineado a partir do destinatário usando Vannas tesoura e descarte.
- Suturar oenxerto
- Coloque a córnea do doador sobre o enxerto cama na córnea do destinatário. Certifique-se de que Healon adequado está sob a córnea do doador para proteger as células endoteliais do doador de dano pelo contato direto com a lente.
- Usando micropinças derrubadas super fino, coloque a primeira mordida de nylon 11-0 sutura no lado do doador, por meio do doador com 90% de profundidade de espessura total para o lado do destinatário, em seguida, amarrar.
- Uma vez que a córnea está ancorada no lugar, realizar suturas interrompidas midcardinal de tal forma que a córnea tem de 8 a 10 pontos totais e da córnea do doador está firmemente alinhados com e anexados ao leito do enxerto corneano destinatário.
- O aprofundamento da câmara anterior
- Aprofundar a câmara anterior através da injecção de HBSS ou bolha de ar para dentro da câmara anterior e verificar cuidadosamente a integridade do enxerto da córnea para detecção de fugas com uma esponja de celulose.
NOTA: Se a câmara anterior não pode ser reformado, então há uma alta probabilidade de cataract que fará com que as futuras avaliações da córnea transplantada muito difícil e também irá levar à disfunção endotélio corneano doador e falha assim enxerto.
- Aprofundar a câmara anterior através da injecção de HBSS ou bolha de ar para dentro da câmara anterior e verificar cuidadosamente a integridade do enxerto da córnea para detecção de fugas com uma esponja de celulose.
- Avaliação final
- Observar o olho para determinar que a pupila é redonda e a profundidade da câmara anterior é normal.
NOTA: Se o aluno não é redondo, isso indica que, durante a sutura da íris foi danificado e, assim, o enxerto é considerada uma falha técnica. - Aplicar pomada antibiótica ao olho. Opcional: Feche a tampa do olho com uma sutura de seda 7-0.
- Observe ratos até que estejam totalmente acordado e depois individualmente abrigá-los por um período mínimo de dois dias após a cirurgia.
- Observar o olho para determinar que a pupila é redonda e a profundidade da câmara anterior é normal.
Remoção 3. Sutura
- Naqueles casos em que a tampa de sutura é usado, anestesiar os ratos, tal como descrito acima e remover o fio de sutura na tampa 48 h.
- Anestesie camundongos no dia 7 pós-operatório. Remover o sutures fixar o enxerto da córnea. Uma vez que as suturas são removidas eo animal está totalmente desperto, coloque-o na gaiola.
4. Avaliação Clínica
- Examinar o olho para indicações de complicações processuais que incluem, catarata (opacificação do cristalino), hifema (sangue na câmara anterior), uma câmara anterior, que não é da profundidade adequada, ou opacidade significativa da córnea. Considere aqueles que demonstram estas complicações como "comprometida" e sacrificá-los por inalação de CO2.
- Realizar todos os exames em ratos não anestesiados. Segure o mouse com restringindo um lado, portanto, o mouse para que o outro lado pode proptose do olho para permitir uma melhor visão do olho. Uma vez que as observações são concluídas, devolver o animal para sua gaiola.
- Já um observador familiarizado com os grupos de tratamento avaliam córneas transplantadas 2-3 vezes por semana para os sinais de transplante de córneaepisódios de rejeição ou falência do transplante. Use o microscópio cirúrgico ou um biomicroscópio de lâmpada de fenda horizontal para estas observações.
- Avaliar cada córnea para a opacidade utilizando uma escala de 0 a 5. A escala é definida como se segue:
- Atribuir uma pontuação de 0 a essas córneas que não têm sinais de opacidade.
- Atribuir uma pontuação de 1 a essas córneas que mostram opacidade superficial mínima.
- Atribuir uma pontuação de 2 a córneas que exibem opacidade leve e profundo, mas o aluno subjacente e íris são ainda perceptíveis.
- Atribuir uma pontuação de 3 a córnea que são apresentados opacidade do estroma da íris, em que não pode ser visto em pormenor, com a excepção de as margens da pupila.
- Atribuir uma pontuação de 4 a córnea que exibir densa opacidade estromal e se há estruturas subjacentes podem ser vistos.
- Atribuir uma pontuação de 5 a córnea que exibir completa opacidade e edema estromal intensivo, com a pupila e íris totalmente obscurecido.
- Também avaliar cada córnea para o grau de infiltração de vasos sanguíneos (neovascularização), utilizando uma escala de classificação de 1 a 8. Para realizar isto, ver a córnea como consistindo em quatro quadrantes iguais e determinar a quantidade de vasos sanguíneos em cada um destes quadrantes, com um marcar essa gama vontade de 0 (sem vasos) a 2 de extensa vascularização do que quadrante. Adicione as pontuações individuais de cada quadrante para calcular a pontuação final neovascularização.
- Classifique córneas como agudamente rejeitados se eles têm uma pontuação de 3 para duas observações consecutivas para o tempo aponta até 5 semanas.
- Classifique camundongos cuja córneas foram claros em 5 semanas, mas desenvolver opacificação às vezes> 45 dias após o enxerto, com uma pontuação de 3 para dois momentos consecutivos, como tendo sofrido rejeições de fim de prazo. Use curvas de sobrevida de Kaplan-Meier para analisar a sobrevida do enxerto.
- Avaliar cada córnea para a opacidade utilizando uma escala de 0 a 5. A escala é definida como se segue:
5. A manipulação do Modelo
em-left: 40px; ">- Para preparar células individuais, primeira eutanásia do rato doador. Em seguida, remover o baço.
- Inserir o baço em um filtro de células e rompê-la com um êmbolo da seringa a partir de uma seringa de 3 ml.
- Lavar as células e ressuspender em 10 ml de Solução Salina Equilibrada de Hanks.
- Retirar 10 jul de suspensão de células e adicionar 10 ul de 0,4% de azul tripano e misturar. Acrescentar que a hemocitômetro e contar as células na grade central. O número de células na câmara de ar é a contagem de células de 10 x 4 x 2 (factor de diluição em azul tripano) x 10 (volume no tubo).
- Anestesiar ratos, tal como descrito anteriormente.
- Realizar injecções usando um microscópio de dissecação. Para cada injecção intracameral, usar 10 6 células do baço em um volume de 0.005 ml e uma seringa de microlitro 0,25 ml, equipado com uma agulha 33 G.
NOTA: Outras manipulaçõesdo modelo pode ser realizada pelo tratamento dos animais com os reagentes que actuam como antagonistas ou agonistas para determinar o papel que um factor particular pode desempenhar após a cirurgia do enxerto corneano ortotópico.
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Representative Results
O modelo murino de transplante de córnea tem sido usado por mais de 20 anos com sucesso para caracterizar os mecanismos de rejeição do enxerto corneano tanto 19-23 e aceitação da córnea do enxerto 13, 15,16,18, 24-27. Este modelo foi utilizado para determinar a importância da expressão de FasL na aceitação do enxerto corneano, em que os animais que não possuem FasL não foram capazes de aceitar enxertos da córnea 15. Também tem sido usado para demonstrar que factor de crescimento endotelial vascular receptor 1 do tratamento morfolino aumenta significativamente a sobrevivência do enxerto da córnea 28. Em um relatório recente, este modelo foi usado para testar se o pré-tratamento de camundongos antes de enxerto corneano com corticosteróides realizada qualquer benefício terapêutico 29. Os autores mostraram que tal pré-tratamento fez melhorar a taxa de sobrevivência de enxertos de córnea 29. Esses relatos demonstram claramente que a principal vantagem deste modelo é quepode-se estudar em um animal vivo daquelas coisas que se acredita ser importante para o sucesso de transplantes de córnea em humanos.
Estudos anteriores deste laboratório relataram que um dos principais mecanismos responsáveis pela rejeição do enxerto corneano é o estabelecimento de sistemática de hipersensibilidade tardia (DTH) para Aloantígenos específicos expressos pelo enxerto corneano 19, 20. Temos desde utilizado este modelo para testar se estabelecimento de tolerância DTH aloantígeno sistêmica para Aloantígenos expressas pelo doador do enxerto corneano melhora a sobrevida desses enxertos. Como mostrado na Figura 1, os ratinhos BALB / c tornados tolerantes a C57BL / 10 (B10) aloantigénios não melhorar a aceitação do enxerto da córnea, conforme medido pelo tempo médio de sobrevivência para estes enxertos de córnea. Assim, o tempo médio de sobrevivência para córneas rejeitadas foi o mesmo, quer os ratos foram tolerantes ou não. Também foram realizados estudos semelhantes utilizando respostas de enxerto de pele como um meiode testar a eficácia de tolerização DTH sistêmica. Estes estudos demonstraram que quando a tolerância DTH foi criada em camundongos BALB / c para a B10 Aloantígenos, enxertos de pele tendo alguns (B10.D2 e C.B10-H-2 b) ou todos B10 Aloantígenos não mostrar qualquer aumento da sobrevida média ( Figura 2). Concluímos a partir desses estudos que os camundongos BALB / c que tinha estabelecido respostas de DTH antígeno-específicas não retirou qualquer benefício mensurável de tal tolerância tanto para enxertos de córnea ou pele. Estes dados também indicam que a informação gerada estudar um modelo murino de transplante de córnea terá, por vezes, ser directamente aplicável a outras formas de transplante de tecidos sólidos.
Figura 1. Ratinhos BALB / c foram injectados na câmara anterior com 6 a 10 células de baço de ratinhos C57BL / 10 (B10) ratinhos. (p> 0,05).
Figura 2. A injecção de células de baço para a câmara anterior não tem impacto sobre a sobrevivência de enxertos de pele alogénicas. Camundongos BALB / c foram injectados na câmara anterior com 6 a 10 células de baço de ratinhos C57BL / 10. Após uma semana, estes ratinhos foram enxertados em separado com a pele de ratinhos C57BL / 10, n = 10, B10.D2, n = 7, C.B10-H-2 b, n = 7 e em comparação com ratinhosos ratos que foram injectados e não enxertados com C57BL / 10 de pele, n = 10. Os resultados são expressos como o tempo médio de sobrevivência + SEM.
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Discussion
O modelo murino de transplante de córnea aqui descrito permite ao investigador para estudar rejeições humano em um modelo que é preditiva de quais fatores são mais associada tanto rejeição 15,17,18,20, 26-30 e 21-25 aceitação de córnea aloenxertos. Ao contrário do transplante de córnea humana, no qual os pacientes recebem tratamento com esteróides ou tópica ou sistêmica, quer tratar ou prevenir a rejeição de 31, este modelo é normalmente usado para determinar os fatores que são relevantes para a rejeição de enxertos, na ausência de tal terapia. Além de um modelo para a rejeição do enxerto corneano aguda, que normalmente ocorre dentro de 30 a 40 dias após o transplante, nós também apresentamos um modelo atrasado prazo de tal rejeição que ocorre 45 dias pós-enxerto em camundongos e imita muitas das características da tarde -termo e crônica rejeição 32,33 que, até agora, não foram modelados em animais.
Tele os pontos fortes do modelo são que se pode dissecar vários mecanismos que são responsáveis pela elevada taxa de aceitação do enxerto corneano, bem como determinar quais mecanismos são mais responsáveis pelo fracasso do enxerto corneano. Este modelo também permite testar várias estratégias terapêuticas em um animal que possua um sistema imunitário que é muito similar ao sistema imunitário humano. Para esse efeito, a existência de muitos reagentes que reagem com os factores de murino, bem como ratinhos transgénicos e direccionada para o gene, permitem a avaliação de tantos factores mais do que seria o caso com outras espécies. Esta capacidade de avaliar muitos fatores diferentes que são importantes tanto para o sucesso eo fracasso de enxertos de córnea é uma significativa positiva em favor da utilização deste modelo murino contra outros modelos animais em que a cirurgia é mais fácil de realizar devido ao aumento do tamanho dos olhos estas espécies.
Embora existam vários pontos fracos deste modelo,acreditamos que os pontos fortes superam-los. Uma das mais significativas, o que foi mencionado acima, é o conhecimento técnico envolvido na realização de transplante de córnea em ratinhos. Devido ao pequeno tamanho do olho murino, isto requer a alguém que é perito na microcirurgia, tanto na realização do transplante, bem como a remoção de suturas. Consequentemente, a prática repetida é necessária para dominar e manter a proficiência nesta técnica. O segundo ponto fraco é que, enquanto os ratos são muito semelhantes aos humanos, eles não são a mesma. Estes animais mostram uma maior tendência para a neovascularização, que fazem córneas humanas. Além disso, este modelo não vai imitar os procedimentos cirúrgicos feitos para tratar a disfunção endotelial como distrofia de Fuch 2. Antes do transplante de espessura total do ano recente, como os usados no protocolo descrito foram empregados. Atualmente, os transplantes endoteliais que envolvem apenas a parte endotelial da córnea têm sido empregadas
Para rejeição tardia prazo (> 45 dias) dois fatores exclusivos para esta versão do modelo se destaca. A primeira fraqueza com esta forma de modelo, sendo que a ratos deve ser mantida por um período mínimo de dois a três meses, a fim de estudar rejeição tardia prazo. E em segundo lugar, as córneas deve primeiro sobreviver possíveis reações de rejeição aguda. Tais rejeições agudas ocorrem em 50 a 70% dos receptores 17, 20 -24. Assim, para estudar rejeição tardia prazo um vai enxertar camundongos cujos transplantes será rejeitada de forma aguda e não vai sobreviver até 45 dias pós-enxerto. A fim de atenuar este verificou-se que a taxa de rejeição em ratos macho é menor do que a observada para ratinhos fêmea (manuscrito em preparação) e, assim, estudar a rejeição final de prazo, é aconselhável que apenas os ratinhos do sexo masculinoser utilizado. Também tentou prolongar a sobrevida do enxerto corneano com o tratamento com esteróides, mas isso não vir a ser (observações pessoais) particularmente úteis e, portanto, não é recomendável que o tratamento com esteróides ser usado. Apesar destas complicações e a ressalva de que provavelmente cerca de metade ou um pouco mais dos que em vós implantada com córneas alogênicos permanecerá afastado até que após 45 dias, este ainda é um modelo muito útil para estudar os fatores que são relevantes para a rejeição final de prazo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Surgical Microscope | Zeiss | Rebuilt | |
| 1 ml Syringe | BD | 305122 | |
| 3 ml Syringe | BD | 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309602 | |
| Vannus Scissors | Stortz | E-3387 | |
| 11-0 Sutures | Alcon | 717939M | |
| Trephine 2.0 mm | Katena | K 2-7520 | |
| Trephine 1.5 mm | Katena | K 2-7510 | |
| Tricaine Hydrochloride 0.5% | Alcon | NDC 0065-0741-12 | |
| Healon | Abbott | Healon OVD | |
| Forceps | FST | 11251-20 | |
| 7-0 Sutures | Alcon | 8065 | |
| 2.5% Phenylephrine HCl | Alcon | NDC 61314-342-02 | |
| 1% Tropicamide | Bausch & Lomb | NDC-24208-585-59 | |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 7654-01 | |
| 33 gauge needle | Hamilton | 90033 | |
| Cell Strainer (100 μm nylon) | BD Falcon | 352360 | |
| Hemocytometer | Cardinal Health | B3175 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 |
References
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