Imagerie in vivo de Dauer spécifique neuronale Rénovation en C. elegans

Summary

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant ‘dauer’ juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

Abstract

Les mécanismes qui contrôlent le stress induit par la plasticité phénotypique chez les animaux sont souvent complexes et difficiles à étudier in vivo. Un exemple classique de la plasticité induite par le stress est l'étape dauer de C. elegans. Dauers sont un stade de développement larvaire alternatif formé dans des conditions de faibles concentrations de produits alimentaires et de bactéries de fortes concentrations d'une phéromone de dauer. Dauers afficher vaste plasticité développementale et comportementale. Par exemple, un ensemble de quatre quadrants intérieure-labial (IL2Q) neurones subissent un remodelage réversibles lors de la formation de dauer. Utilisant l'entrée voies environnementales régulation dauer bien connu, une méthode précédemment établie pour la production de brut dauer phéromone de cultures de nématodes liquide à grande échelle est démontrée. Avec ce procédé, une concentration de 50 000 – 75 000 nématodes / ml de culture liquide est suffisante pour produire un brut très puissant dauer phéromone. La puissance de la phéromone brut est determined par un bio-essai dose-réponse. Enfin, les méthodes utilisées pour in vivo time-lapse imagerie des IL2Qs pendant la formation de dauer sont décrits.

Introduction

Plasticité phénotypique, y compris la plasticité développementale et comportementale, est important pour l'adaptation à des conditions environnementales défavorables et est considéré comme une force motrice dans l'évolution ^1. C. elegans est un organisme modèle fréquemment utilisé pour les études en matière de développement et de la neurobiologie. Dans des conditions idéales, C. elegans se développe à travers quatre stades larvaires avant d'entrer dans le stade de la reproduction des adultes. Cependant, dans des conditions de faible disponibilité de la nourriture et de fortes densités de population, C. elegans peut subir un commutateur de développement et entre dans une phase de longue durée et résistant au stress dauer ^2. Dauers présentent plusieurs différences morphologiques et comportementales des non-dauers qui interviennent probablement cette résistance au stress. Les signaux de l'environnement et des voies génétiques régulant l'entrée dauer ont été largement décrits ^{3, 4, 5, 6, 7.} Cependant, les mécanismes moléculaires contrôlant les changements phénotypiques individuelles qui se produisent; dformation dauer ors sont moins bien compris.

L'examen des phénotypes spécifiques Dauer nécessite la production d'animaux de Dauer. Ceci peut être réalisé de trois façons: 1) Choisir à partir d'une culture de faim de C. elegans, 2) Utilisation de formation dauer constitutive (daf-c) mutants, 3) l'induction de la formation de dauer par phéromone purifiée. Il est relativement simple à prendre dauers partir d'une plaque NGM standard avec un C. population elegans qui a épuisé son approvisionnement alimentaire bactérienne. Dans nos mains, une plaque NGM standard, initialement ensemencé avec 50 pi de OP50 Escherichia coli, a permis de croître pendant 3 jours, puis inoculés avec 3 – hermaphrodites 4 adultes maintenue à 25 ° C sera épuiser l'approvisionnement alimentaire dans la semaine et de produire plusieurs milliers de dauers dans 3 jours supplémentaires (en plus de nombreux non-dauers affamés). Cependant, ce procédé n'est pas satisfaisant pour les processus se produisant pendant l'examen mue en dAuer. Il est difficile de déterminer lequel de plusieurs milliers d'animaux sur une plaque affamés typique entrent dans dauer. En outre, l'utilisation d'une plaque de faim n'offre aucune possibilité de synchronisation. L'utilisation de mutants daf-c permet la synchronisation et la génération fiable de dauers. Cependant, il n'existe aucune garantie qu'une mutation daf-c particulier n'affectera pas les autres phénotypes spécifiques Dauer seul ou en combinaison avec d'autres mutations.

La présence d'une phéromone dauer a été impliqué par Cassada et Russell et a démontré plus tard par Golden et Riddle. La phéromone dauer a depuis été caractérisé chimiquement ^{2, 8, 9, 10.} L'phéromone purifiée est constitué d'un mélange complexe de ascarosides, qui sous différentes formes réguler les processus comportementaux et de développement ^{9, 11.} Utilisation d'un extrait de phéromone brut dauer permet induction fiable contrôlée de dauers synchronisés dans un fond de type sauvage. </p>

Le système nerveux et des cellules gliales associées subissent remodelage pendant dauer larve formation ^{12, 13, 14.} Certains de ces changements sont irréversibles, tels que la rénovation de cellules gliales au cours dauer ^{13, 14.} Cependant, d'autres événements de remodelage sont réversibles à un retour à favorable conditions environnementales. Par exemple, un ensemble de quatre neurones IL2Q neuronal subit un remodelage rapide et réversible lors de la formation de dauer comprenant: arborisation dendritique, un commutateur unique à partir de neurones à dendritique multidendritic remodelage axonal et ^12. Les présents procédés permettent l'imagerie in vivo fiable de la plasticité synaptique induite par le stress dans un organisme modèle. Les méthodes présentées pour la production et les essais de brut dauer phéromone sont décrits précédemment et compilées à partir de plusieurs sources ^{4, 8, 15, 16, 17, 18.}

Protocol

1. brut Dauer phéromone production Cultivez OP50 E. coli à partir d'une seule colonie O / N à 37 ° C sous agitation dans 100 ml de bouillon LB, à 200 tpm. NOTE: Cette culture O / N peut être fait à l'avance et conservé à 4 ° C. Cultivez N2 C. elegans à 15 au 20 juin cm boîtes de Pétri avec de la gélose NGM (voir la recette dans le tableau 1) ensemencé avec 50 ul de E. OP50 coli jusqu'à ce que les bactéries est presque épuisée 19…

Representative Results

La production de brut résultats dauer de phéromones dans un liquide jaune (figure 1) qui est à la fois chaleur et froid stable. Des aliquotes de phéromone brut sont stockés à -20 ° C indéfiniment sans perte évidente de l'activité. Après la production de phéromone, une seule étude dose-réponse est suffisante pour une estimation approximative de la puissance. Cependant, pour la plupart des expériences, il est nécessaire de répéter l'essai biologique 2 – 3 fois et prendre une moye…

Discussion

Un examen de la neuroplasticité spécifique dauer et d'autres changements morphologiques Dauer associée nécessite le contrôle et la formation fiable de dauers soit par mutation génétique (c.-à-mutants, daf-c) ou par l'exposition d'animaux de type sauvage à la phéromone. Bien que l'utilisation d'une mutation génétique pour induire dauers est commode, on peut confondre résultats. Par conséquent les données collectées à des mutations daf-c doit être confirmée par la s…

Materials

N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Upon request from Schroeder lab
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Upon request from Schroeder lab
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Various		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 mL H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 mL of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 mL of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 1 M MgSO4
S Media	Various		S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 mL. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 mL of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 mL, autoclaved), 2.5 mL of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 liter. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 mL of 1 M CaCl2, and 0.75 mL of 1 M MgSO4.
Dauer pheromone plates for dose-response assay	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 mL of 0.513 M NaCl and 5 µL of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 mL culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 mL.  Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µL 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µL 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.  Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).
Microsphere beads 0.1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	Various		Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving