Abstract
NG2 الخلايا معربا عن (polydendrocytes، خلايا دبقية قليلة التغصن السلائف) هي رابع السكان الخلايا الدبقية كبير في الجهاز العصبي المركزي. أثناء التطور الجنيني وبعد الولادة أنها تتكاثر بنشاط وتوليد الخلايا قليلة التغصن myelinating. وعادة تتم دراسة هذه الخلايا في الثقافات فصلها الأولية، cocultures الخلايا العصبية، وفي الأنسجة الثابتة. باستخدام خطوط الماوس المعدلة وراثيا المتوفرة حديثا شريحة نظم الاستزراع يمكن استخدامها لتحقيق انتشار والتمايز للخلايا دبقية قليلة التغصن النسب في المنطقتين المادة الرمادية والبيضاء في الدماغ الأمامي والمخيخ. يتم إعداد الثقافات شريحة من الفئران بعد الولادة المبكرة ويتم الاحتفاظ في الثقافة لمدة تصل إلى 1 في الشهر. هذه الشرائح ولا يمكن تصوير عدة مرات خلال الفترة الثقافة للتحقيق في سلوك الخلايا والتفاعلات. هذا الأسلوب يسمح التصور من انقسام الخلايا NG2 والخطوات المؤدية إلى دبقية قليلة التغصن التمايز مع تمكين تحليل مفصل للمنطقة تعتمدالأنف والحنجرة خلية دبقية قليلة التغصن NG2 وعدم التجانس الوظيفي. هذا هو أسلوب القوية التي يمكن استخدامها لتحقيق الإشارات الجوهرية وخارجي التأثير على هذه الخلايا مع مرور الوقت في بيئة الخلوية التي تشبه تلك الموجودة في الجسم الحي.
Introduction
وقد أثبتت الثقافات شريحة Organoytpic من الجهاز العصبي المركزي إلى أن تكون مفيدة للغاية لدراسة الخلايا العصبية وبيولوجيا الخلايا الدبقية في نظام semiintact 1-4. هذه الثقافات هي بسيطة نسبيا لاعتماد وتحتفظ العديد من الفوائد من مزارع الخلايا فصلها الأولية مثل التلاعب في البيئة خارج الخلية وسهولة الوصول للالمتكررة على المدى الطويل التصوير الخلية الحية والتسجيلات الكهربية 5-9. بالإضافة إلى ذلك، الحفاظ على الثقافات شريحة التهندس الخلوي الأنسجة 3 الأبعاد، والربط العصبية الإقليمي، ومعظم أنواع الخلايا الرئيسية موجودة في النظام. هذه الخصائص تجعل هذه الثقافات نظام فريد ومريحة للتحقيق في سلوك خلية واحدة وعلم وظائف الأعضاء مع التفاعلات الخلوية والبيئية.
خلايا NG2 هي مجموعة من الخلايا الدبقية في الجهاز العصبي المركزي الثدييات التي لا تزال تتكاثر وتوليد مyelinating قليلة التغصن أثناء التطور الجنيني وبعد الولادة 10. فقد تمت دراستها على نطاق واسع في مزارع الخلايا الأولية فصلها، والتطورات الأخيرة في خطوط الماوس المعدلة وراثيا مع التعبير NG2 خلية محددة من البروتينات الفلورية سهلت في رسم مصير الجسم الحي والتسجيلات الكهربية في الاستعدادات شريحة الحادة. حتى مع هذه الدراسات، لا يعرف الكثير عن ديناميات الزمنية من NG2 تكاثر الخلايا والتمايز دبقية قليلة التغصن. على الرغم من أن يستخدم على نطاق واسع الثقافة خلية فصلها عن المنشأة النسبي في التلاعب الدوائية والوراثية، فإنه ليست مناسبة للاستجواب الاختلافات الوظيفية لهذه الخلايا في مناطق الدماغ المختلفة لا سيما عندما يكون من المرغوب فيه للحفاظ على سياق المكروية الخلوية. الثقافات شريحة توفر بديل بسيط هو أن قابلة للتلاعب الدوائية واستخدمت لتحقيق دبقية قليلة التغصن تكون الميالين 11،12، والخليةاستجابة جزيئية بعد ليزوليسيتين (مجلس السلام الليبيري) أو الأجسام المضادة التي يسببها إزالة الميالين 13،14، وتحريض عودة الميالين عن طريق العلاج الدوائي 15.
وهناك طريقة للتحقيق وإجراء التصوير الحية والأنسجة الثابتة (أو postfixation) تحليل NG2 تكاثر الخلايا والتمايز دبقية قليلة التغصن في الثقافات شريحة عضوي النمط مأخوذة من كل من الدماغ الأمامي والمخيخ يوصف. هذا هو وسيلة قوية يمكن استخدامها لدراسة مصير خلية من خلايا NG2 واحدة بعد تقسيم 16 واكتشاف الاختلافات إقليمية وتعتمد على العمر في عامل نمو الخلايا NG2 يسببها انتشار 17. هذه التقنية بسيطة نسبيا يمكن الوصول إليها على نطاق واسع لمواصلة التحقيق خلية جوهري و / أو بيئية آليات تنظيم وظائف أعضاء هذه الخلايا الدبقية واستجابتها لنشاط الخلايا العصبية أو ضرر المايلين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: جميع الإجراءات الحيوانية تتبع المبادئ التوجيهية حيث تم اعتمادها من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة كونيتيكت.
ملاحظة: للحصول على هذه التجارب التأسيسية NG2cre 18 (JAX # 008533) ومحرض NG2creER 16 (JAX # 008538) الفئران المعدلة وراثيا منها إلى Z / EG 19 (JAX # 003920) أو gtRosa26: مراسل YFP 20 (JAX # 006148) خطوط استخدمت التوالي صورة لخلايا NG2 وذريتها. لصورة قليلة التغصن ناضجة، استخدمت PLPDsRed الفئران المعدلة وراثيا 21. من أجل البقاء ثابت، وشرائح يمكن عزل من الفئران تصل إلى 10 يوم بعد الولادة من كل من الدماغ الأمامي والمخيخ.
1. شريحة التحضير
- في الثقافة هود، ضع إدراج زراعة الأنسجة في ست لوحات جيدة وإضافة 1 مل شريحة متوسطة الثقافة (وصفة في قسم الكواشف). وضع لوحات في الحاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 على الأقل 2 ساعة قبل تشريح.
- تعقيم جميع الأدوات والمروحية الأنسجة مع الايثانول 70٪.
- فقاعة عازلة تشريح (وصفة في قسم الكواشف) مع 95٪ O 2، 5٪ CO 2 على الجليد لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل بدء تشريح.
- تخدير الجراء الماوس عن طريق وضعها على الجليد لمدة 5-10 دقيقة وفقا لبروتوكولات الحيوانية المعتمدة. تأكد عمق مناسب من التخدير عن طريق التأكد من الفئران لا تستجيب الى الذيل وأخمص القدمين معسر.
- قطع رأس الحيوانات باستخدام مقص حاد التالية بروتوكولات الحيوان. بسرعة إزالة الجمجمة على الدماغ الأمامي والمخيخ بجعل أول خفض سهمي تليها شق الجانبي، وذلك باستخدام أدوات معقمة. قطع الأعصاب القحفية من السطح البطني من الدماغ والمخيخ بعناية من قبل المتداول الأنسجة إلى الجانب.
- وضع الأنسجة في العقيمة 35 ملم صحن يحتوي عازلة تشريح المؤكسج الجليد الباردة.
- باستخدام شفرة حلاقة، قطع المخيخ والدماغ الأمامي. ثم اجراء خفض منتصف السهمي ترولاف الدماغ الأمامي والمخيخ، التي تفصل بين نصفي الكرة الأرضية.
- قطع 300 أقسام الاكليلية والسهمي ميكرون سميكة من الدماغ الأمامي والمخيخ مع المروحية الأنسجة اليدوية. ملاحظة: المروحية الأنسجة اليدوية تتيح معالجة سريعة من تشريح للثقافة الحضانة دون الحاجة لتضمين الاغاروز. ويمكن أيضا أن تستخدم vibratome كما هو موضح سابقا 9.
- نقل شرائح فصلها إلى فقاعات حديثا عازلة تشريح الباردة على الجليد.
- استخدام تشريح ملاعق صغيرة أو وزنها لفصل المقاطع الفردية ونقلها إلى preincubated ستة أطباق جيدا مع تدرج الثقافة.
- إزالة أي عازلة تشريح الزائد من سطح إدراج الثقافة باستخدام ماصة نقل القابل للتصرف أو P 200 طرف الماصة. يمكن وضعها مرتين إلى ثلاث الدماغ الأمامي أو ثلاث شرائح للدماغ على إدراج ثقافة واحدة.
ملاحظة: للحصول على نتائج متسقة مع الثقافات الدماغ المقدم، فإنه يعتبر مثاليا لاتخاذ شرائح التي تغطي الجزء الأمامي من ثلث الجسم الثفني(الشكل 1A) من أجل دراسة كل مناطق المادة الرمادية والبيضاء في نفس شريحة. كل حيوان عادة ما ينتج 6 شرائح الدماغ الأمامي و 6 شرائح المخيخ. - وضع لوحات جيدة ستة في الحاضنة واستبدال شريحة المتوسطة مع 1 مل من شريحة متوسطة بعد 1 يوم إعداد شريحة وبعد ذلك مرة كل يومين حتى شريحة التثبيت.
- اعتمادا على التجربة، استخدام شرائح بعد 5-7 أيام في الثقافة. فقط استخدام شرائح التي تصبح شفافة بعد الأيام القليلة الأولى وتجاهل تلك التي لديها مناطق مبهمة متفاوتة. ملاحظة: المناطق المعتمة داخل شرائح مرئية بالعين وتظهر كما أجمة من زنازين مظلمة تحت النقيض من المرحلة. بعد أن تم يتقن هذه التقنية، تحدث شرائح مبهمة الميتة نادرا، في أقل من 1-5٪ من شرائح.
2. الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الخلوي NG2 والتمايز دبقية قليلة التغصن
ملاحظة: لإجراء وقت التصوير انقضاء NG2 تكاثر الخلايا والتمايز نستخدم NG2cre: ZEG الفئران 16التي تعبر عن EGFP في الخلايا NG2 وذريتها (الشكل 1C-E). مراسل التعبير في هذا الخط هو قوي بما فيه الكفاية للحصول على صور حية لGFP + الخلايا في شرائح فورا بعد باجتزاء لفترة زمنية من أربعة أسابيع على الأقل. ويتم الحصول على أوضح الصور بعد فترة ترقق الأولية للشريحة، والذي يحدث خلال الأيام الأولى 3-5 في الثقافة.
- في كافة مراحل التجربة، والحفاظ على شرائح في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية وإزالة إلا لفترات قصيرة من الوقت (أقل من 15 دقيقة لكل شريحة)، والحفاظ على غطاء على لوحة جيدا ستة حين التصوير.
- باستخدام المجهر مضان مقلوب مجهزة الكاميرا الرقمية، والتقاط الصور عند نقطة أول مرة باستخدام الهدف 10X. ملاحظة: نقطة للمرة الأولى سوف تختلف من التجربة ويمكن أن يكون اليوم الذي أعدت شرائح أو أي نقطة زمنية بعد.
- التقاط الصور من مناطق متعددة في نقطة زمنية واحدة في كل من مناطق المادة الرمادية والبيضاء للشريحة. مذكرة عشرالمنطقة تصويرها بواسطة البريد المعالم محددة داخل شريحة وعن طريق تعيين موقع الصورة على التخطيطي التي يمكن استخدامها لجلسات التصوير لاحقة. ويمكن أن تشمل معالم مفيدة حواف شرائح و / أو التوجه مساحات المادة البيضاء. صورة 7:56 المواقع على كل شريحة في كل نقطة زمنية.
- التقاط صور لاحقة في الفترة الفاصلة من 4-6 ساعة إذا فحص انقسام الخلايا دبقية قليلة التغصن NG2 والتمايز، بشكل مثالي خلال 5-7 أيام.
- التقاط صورة نهائية لجميع المناطق وتحديد شرائح الفور. إضافة 1 مل من تثبيتي (4٪ PFA مع 0.1M-L يسين 0.01 M الصوديوم الفوقية بريودات) إلى الجزء السفلي من إدراج الثقافة، ثم يضاف 1 مل أخرى على أعلى من شرائح. والحرص على عدم بخ تثبيتي مباشرة على شريحة لأنها يمكن أن تنفصل عن الغشاء. إصلاح الأنسجة لمدة 30 دقيقة والمضي قدما المناعية باستخدام علامات مرحلة تنموية محددة كما هو موضح في القسم 4.
- شرائح غسل مع 0.2 M فوسفات الصوديوم عازلة 3 × 10 مفي. إذا لزم الأمر، وشرائح تخزينها في 4 درجة مئوية في 0.2 M فوسفات الصوديوم العازلة لمدة 1-3 أيام قبل المناعية ولكن أداء مثالي تلطيخ خلال 24 ساعة. المضي قدما المناعية كما هو موضح أدناه في القسم 4 لتحديد نسبة الخلايا التي متباينة في الخلايا قليلة التغصن (الشكل 2D-F).
3. مصير خارطة آله خلية NG2 عن طريق الفئران المعدلة وراثيا في محرض مراسل الثقافات شريحة
ملاحظة: لتتبع مصير خلايا NG2 من نقطة زمنية معينة في الثقافة، محرض NG2creER: يمكن استخدام YFP الفئران المعدلة وراثيا.
- لحث لجنة المساواة العرقية إعادة التركيب والتعبير مراسل بإضافة 100 نانومتر 4OHT الذائبة في الايثانول إلى مستنبت. ملاحظة: يجب أن تظهر خلايا إيجابية مراسل في غضون 1-2 أيام في كفاءة تحريض ~ 20-25٪ YFP + NG2 + / + NG2 الخلايا وعند هذه النقطة الوقت سوف تكون جميع الخلايا في مرحلة خلية NG2 (الشكل 2A-C)
- إصلاح وغسل شريحةق في نقاط زمنية مختلفة بعد مختلف التلاعب (وصفها في الأقسام 2.5 و 2.6).
4. شريحة المناعية
- قطع الأغشية مع شرائح المرفقة من إدراج باستخدام مشرط.
- نقل شرائح إلى الآبار الفردية لالمالحة 24 لوحة تحتوي على الآبار الفوسفات مخزنة (PBS) باستخدام مجموعة من ملاقط، مع الحرص على عدم تعطيل تشكيل شريحة عند التقاط الغشاء.
- نقل الشرائح الى 24 لوحة جيدا مع عرقلة الحل تحتوي على 5٪ مصل الماعز العادي (خ ع) و 0.1٪ تريتون-X100 في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة.
- احتضان الشرائح في الأجسام المضادة الأولية O / N في NGS 5٪ في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية. لتحديد الخلايا في مرحلة خلية NG2، استخدام الأجسام المضادة لNG2 وPDGFRα. لتحديد الخلايا قليلة التغصن متباينة، استخدام الأجسام المضادة للمستضد غدومي المرجلات القولونية (APC، استنساخ CC1).
- على شرائح غسل يوم الثاني في برنامج تلفزيوني X15 3 دقائق، ثم في احتضان antibo الثانوييموت في 5٪ NGS في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة على RT. تغسل شرائح في برنامج تلفزيوني 3 X15 دقيقة وجبل على الشرائح. جبل مع شرائح صعودا وغشاء تواجه الشريحة بحيث الغشاء لا يكون بين الهدف والأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وترد أمثلة على بيانات تمثيلية أدناه التي تم الحصول عليها باستخدام شريحة الثقافات من كل من الدماغ الأمامي والمخيخ من P8 NG2cre: ZEG، NG2creER: YFP وPLPDsRed خطوط الماوس المعدلة وراثيا. خلايا NG2 يمكن تصويرها خلال أيام في الدماغ الأمامي والمخيخ شرائح (الشكل 1B-D، فيديو 1) والنمط الظاهري من هذه الخلايا يمكن تحديد بعد تثبيت والمناعية والأجسام المضادة مع NG2 CC1 (الشكل 1E). بالإضافة إلى العيش والتصوير، ويمكن أيضا انتشار الخلايا يتم تقييمها باستخدام تلطيخ المناعى للعلامات انتشار الخلايا مثل Ki67 (الشكل 1F). تسمح هذه البيانات لتحليل مفصل لديناميات الزمنية من دبقية قليلة التغصن التمايز بعد انقسام الخلايا NG2 على أساس الخلايا الفردية. رسم مصير الخلايا NG2 يمكن القيام بها بعد تحريض إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية في شرائح مع 4OHT في NG2creER: YFP الفئران (الشكل 2). كانت YFP NG2 خلايا +، معربا عن مراسل FO اوند في الثقافات بعد يومين إضافة 4OHT إلى مستنبت (الشكل 2A). بعد ستة أيام 4OHT الاستقراء، ونسبة من YFP + الخلايا المتمايزة في CC1 + الخلايا قليلة التغصن (الشكل 2B). وتشير هذه البيانات جدوى أداء رسم الخرائط مصير خلايا NG2 في شرائح البيئة خارج الخلية حيث يمكن التلاعب بها لاختبار آثار كلاء الدوائية أو الشتائم المختلفة على مصير الخلايا NG2. تركيزات مختلفة من 4OHT يمكن استخدامها لتحقيق درجات مختلفة من لجنة المساواة العرقية إعادة التركيب. على سبيل المثال، والتعرض إلى 100 نانومتر 4OHT لمدة 2 أيام يسبب مراسل التعبير في حوالي 20-25٪ من كل الخلايا معربا عن NG2 بينما ينتج 1μM 4OHT في حوالي 60-70٪ كفاءة إعادة التركيب. أخيرا، المايلين واسعة النطاق موجود في هذه الثقافات و oligodendrocytes myelinating ولا يمكن تصوير في شرائح الحية والثابتة باستخدام PLPDsRed الفئران المعدلة وراثيا (الشكل 3، فيديو 2).
EP-together.within الصفحات = "دائما"> 
الرقم 1. شريحة طريقة الثقافة للتصوير على المدى الطويل من تكاثر الخلايا والتمايز NG2 (AB) تخطيطي يصور عزل الدماغ الأمامي وشرائح المخيخ (A) وزراعة اللاحقة والوقت الفاصل بين التصوير باستخدام إدراج ثقافة شريحة (B) (C ) تصوير توضح انقسام الخلايا NG2 واللاحق دبقية قليلة التغصن التمايز في NG2cre: ZEG الفئران المعدلة وراثيا (D) مثل الصور تم الحصول عليها من المناطق القشرية من NG2cre: الفئران ZEG تظهر GFP واحد + خلية (الأسهم) تقسيم مرتين على مدى فترة من 122 ساعة، والوقت يصور في أعلى الزاوية اليمنى وبعد ساعات من بدء تجربة التصوير. (E) مع تثبيت والمناعية المضادة والأجسام المضادة NG2 CC1 من نفس شريحة يكشف أن dividi المصورةأسفرت خلايا نانوغرام في ثلاثة NG2 + الخلايا (السهام). (F) صورة مثال يوضح اثنين Ki67 + NG2 + الخلايا في ثقافة شريحة القشرية. (G) صورة مثال يوضح NG2 + الخلايا (النصال) وعملياتها تتشابك مع NeuN + نوى الخلايا العصبية في القشرية ثقافة شريحة. أشرطة النطاق 25 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. الرقم التعريفي للYFP التعبير لتتبع مصير خلايا NG2 في الثقافات شريحة الدماغ الأمامي (AB) الصور التي اتخذت من المنطقة الجسم الثفني الثقافات شريحة الدماغ الأمامي من NG2creER: YFP الفئران تعامل مع 4OHT لمدة 24 ساعة ثم غادر في الثقافة ل2 أيام (A) أو 6 أيام (B) (A) أو CC1 وYFP (B) مما يدل على تمايز الخلايا NG2 إيجابية في الخلايا قليلة التغصن مراسل بينما في الثقافة 6 أيام بعد إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية (السهم). أشرطة النطاق 25 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. قليلة التغصن التصوير في الثقافات شريحة من PLPDsRed الفئران المعدلة وراثيا. (A) تخطيطي تصور العزلة، زراعة والتصوير من شرائح المخيخ PLPDsRed من الفئران المعدلة وراثيا. (B) صورة مأخوذة من شريحة المخيخ ثابتة بعد 5 أيام في المختبر تبين calbindin + ( السماوي) الخلايا العصبية العصبية مع العصبيالمايلين الأساسية البروتين + (ب ب) (الأخضر) محاور إسقاط المناطق في المادة البيضاء للشريحة. مقياس بار 25 ميكرون (C) وصور منخفضة التكبير تم الاستيلاء عليها من المنطقة نفسها كل يوم في الأوقات المشار إليها في ساعات في الثقافات شريحة المخيخ من الفئران PLPDsRed. مقياس بار 100 ميكرون. (D) صورة انخفاض التكبير مأخوذة من PLPDsRed ثقافة شريحة ثابتة تظهر MBP التعبير في مناطق المادة البيضاء حيث تتركز الخلايا DsRed +. بار 100 ميكرون واسع. (E) صورة عالية التكبير مأخوذة من PLPDsRed ثقافة شريحة ثابتة تظهر واحدة + DsRed الخلايا قليلة التغصن مع العمليات MBP +. مقياس بار 20 ميكرون. (F) تسلسل الوقت الفاصل مأخوذة من شريحة المخيخ PLPDsRed تظهر أجسام الخلايا مستقرة نسبيا خلال جلسة التصوير 48 ساعة، والوقت هو مبين في الجزء العلوي الأيمن في ساعة. مقياس بار 25 ميكرون. نداءحد ذاتها انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1. تصوير لايف انقسام الخلايا NG2 في ثقافة شريحة القشرية الوقت الممثل انقضاء المدة تسلسل تظهر انقسامات الخلية متعددة في ثقافة شريحة القشرية التي اتخذت من NG2cre: الماوس المعدلة وراثيا ZEG. فيديو عرض في 5 إطارات في الثانية، المونتاج من الصور هو مبين في الشكل 1. (انظر "Video_1.mov" تحت التنزيل)
فيديو 2. التصوير لايف من الخلايا قليلة التغصن في الثقافات شريحة المخيخ الوقت الممثل انقضاء المدة تسلسل تظهر التغييرات الصغيرة في التشكل دبقية قليلة التغصن (السهم) تصوير أكثر من 48 ساعة في شريحة المخيخ المأخوذة من الفئران المحورة جينيا PLPDsRed. فيديو عرض في 3 إطارات في الثانية، المونتاج من الصور هو مبين في الشكل 3. (انظر "Video_2.mov" تحت التنزيل)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تكون الميالين في الجهاز العصبي المركزي أمر ضروري للتواصل الفعال وبقاء الخلايا العصبية محور عصبي 22. خلايا NG2 تولد باستمرار قليلة التغصن myelinating في مرحلة البلوغ مع الحفاظ على السكان المقيمين في معظم مناطق الدماغ 16،23 - 25. وقد وصفت بعض الآليات الوراثية والجزيئية التي تنظم التفريق بين هذه الخلايا ولكن لا يزال هناك الكثير من يكتشفها. الثقافات شريحة عضوي النمط هي أداة مريحة للتحقيق في هذه الآليات نظرا لخصائصها الفريدة من الحفاظ على المناطق التشريحية، والتلاعب سهل من البيئة خارج الخلية، تكون الميالين قوي، وبحضور جميع أنواع الخلايا الرئيسية. هذه الخصائص تسهل التحقيق في التفاعلات المدى القصير والطويل بين الخلايا NG2، والخلايا قليلة التغصن محاور 11،26. بالإضافة إلى ذلك، زرع الخلايا من السهل نسبيا لأداء ويمكن استخدامها للتحقيق التي تعتمد على المنطقة دifferences في سلوك الخلية 17. وعلاوة على ذلك، والعلاجات الدوائية يمكن أن تضاف إلى مستنبت للتحقيق في الآليات الجزيئية التي تؤثر على تكاثر الخلايا NG2 و / أو التمايز في الحالات العادية 17،27،28 والثقافات عديمة الميلين 15،29. وأخيرا، فمن الممكن تقنيا استخدام شريحة الثقافات لأداء شاشات لتحليل إنتاجية عالية من المركبات التي توجه الخلايا لتتكاثر NG2 أو تمييز، وربما حتى بعد إهانة المزيل 30.
الأساليب الحالية للتحقيق في خلايا دبقية قليلة التغصن النسب وتفاعلهم مع المحاور في إطار ثقافة تسيطر تشمل شارك الثقافات مع فصلها عقدة الجذر الظهري (DRG) أو الخلايا العصبية الجنينية والخلايا القشرية NG2 31،32، التي ترتكز على الاستعدادات الأصلية تطويرها لتحقيق DRG خلية -Schwann التفاعلات 33. وقد استخدمت هذه الثقافات للتحقيق في الخصائص الأساسية للمحور عصبي ودبقية قليلة التغصنالتفاعلات الخلية بما في ذلك النسب التي تعتمد على نشاط الخلايا العصبية إشارات للحث على التمايز وإنتاج المايلين 32،34 - 36 بالإضافة إلى أسئلة أخرى مثل اعتماد قطر محور عصبي وكثافة الخلايا NG2 انتشار مسيطرة وظهور التمايز 37. في حين أن هذه النظم coculture مثالية لمعالجة مثل هذه الأسئلة، والارتباط المباشر والطلب إلى الوضع في الجسم الحي ليست واضحة دائما. كما ذكر سابقا، والثقافات شريحة عضوي النمط توفر حالة فريدة من الحفاظ على العديد من الوصلات العصبية المحلية وثلاثة التهندس الخلوي الأبعاد التي تضيع في الاستعدادات ثقافة مشتركة من الخلايا فصلها. وعلاوة على ذلك على عكس الثقافات شريحة عضوي النمط، وأنظمة ثقافة مشتركة من الخلايا فصل في كثير من الأحيان لا تشمل خلايا الدبقية الأخرى وجزيئات المصفوفة خارج الخلية التي أظهرت أن تلعب دورا رئيسيا في تطوير وصيانة وعلم وظائف الأعضاء من الخلايا NG2، قليلة التغصنوالمايلين. مع نمو كبير في مجموعة متنوعة من الأدوات المتاحة لوضع العلامات والتلاعب السكان الخلية متميزة مع النواقل الفيروسية والحيوانات المعدلة وراثيا، والتصوير طويل الأجل ورسم مصير في الثقافات شريحة عضوي النمط معين يجب أن تثبت أنها تقنية قوية للتحقيق في خلية NG2 انتشار، والتمايز ودبقية قليلة التغصن تكون الميالين.
وينبغي إجراء العديد من الخطوات الهامة للخروج عند تنفيذ هذه التجارب لضمان بقاء شريحة واستنساخ البيانات. أولا، من أجل توليد شرائح صحية، باجتزاء والعزلة من شرائح يجب أن يتم تنفيذ في أسرع وقت ممكن والجليد عازلة تشريح البارد. ثانيا، في حين الآلي اكتساب موقف صورة مع مرحلة الآلية على المجهر مضان يمكن أن تكون مفيدة، وهناك العديد من العوامل التي يمكن أن تعطل نقل الدقيق للمناطق تصوير ودليل المتكررة اكتساب ضروري للحصول على الصور موثوقة باستمرار على مر متعدأيام ه. وهذا أمر ضروري خاصة إذا كان يتم الاحتفاظ شرائح في حاضنة الثقافة خلية بين جلسات التصوير وليس في حاضنة مرحلة أعلى. ثالثا، خلال تثبيت شريحة، وتلطيخ، وتصاعد من المهم للغاية للتعامل مع شرائح بلطف لأن أي اضطراب في الأنسجة سيؤدي إلى عدم القدرة على انتقال المناطق والخلايا تصويرها مباشرة. لا توجد تعديلات محددة إلى الطرق التقليدية المستخدمة في ثقافة شريحة الاستعدادات التي تستخدم لدراسات الخلايا العصبية والخلايا النجمية.
هناك عدة قيود على طريقة ثقافة شريحة التي يجب مراعاتها. ومن المعروف أن الخلايا النجمية، والخلايا الدبقية الصغيرة NG2 للرد على الضرر العصبي المركزي مع زيادة انتشار في موقع الإصابة وتشكيل ندبة الدبقية. عملية إعداد النتائج في بعض شرائح إعادة تنظيم واستجابة الدبقية رد الفعل الأولي من هذه الخلايا. NG2 معدلات تكاثر الخلايا تعود إلى مستويات مماثلة لتلك الواردة في الجسم الحي للمطابقةيجب النظر في مراحل التنمية بعد عدة أيام في الثقافة إلا أن زيادة معدلات انتشار والنمط الظاهري رد الفعل الأولي من هذه الخلايا عند تفسير البيانات. وجود مصل الحصان في مستنبت قد يغير تكاثر الخلايا NG2 وينبغي النظر فيها عند تفسير نتائج أي تجربة. بالإضافة إلى ذلك، في حين وجود نشاط الخلايا العصبية عفوية، المدخلات الحسية واتصالات طويلة المدى بين الخلايا العصبية تعاني من نقص، مما قد يؤدي إلى نشاط الخلايا العصبية غيرت داخل شريحة. أخيرا، من دون استخدام المروج مدفوعة ناقلات فيروسية معينة أو الفئران المعدلة وراثيا، ونوع محدد خلية التلاعب الجينية داخل النظم ثقافة شريحة يمثل تحديا. في حين أن هذه القيود يجب أخذها في الاعتبار عند تصميم التجارب والثقافات شريحة هي نظام فريد والتي يمكن استخدامها لاكتساب المعرفة الجديدة في الأسئلة التي لا يمكن الإجابة مع الثقافات الخلية فصلها أو في الحيوان سليمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slice Culture Medium | |||
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11090 | 50% |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175 | 25% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | 25mM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 1mM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 1mg/L |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 0.4mM |
| Horse Serum | Hyclone | SH30074.03 | 25% |
| Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius | |||
| Dissection Buffer | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 124mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.004mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | 1.25mM |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M7506 | 4.004mM |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 2mM |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | 26mM |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | 10mM |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 2.0mM |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | 0.075mM |
| Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use | |||
| Other Reagents and Supplies | |||
| 4-hydroxy tamoxifen (4OHT) | Sigma-Aldrich | H7904 | 100nM |
| Paraformaldehyde (PFA) | EM Sciences | 19200 | 4% |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L-6027 | 0.1M |
| Sodium Metaperiodate | Sigma-Aldrich | S-1878 | 0.01M |
| Rabbit anti NG2 antibody | Chemicon (Millipore) | AB5320 | 1:500 |
| Mouse anti CC1 antibody | Calbiochem (Millipore) | OP80 | 1:200 |
| Mouse anti Ki67 antibody | Vision Biosystems | NCL-Ki67-MM1 | 1:300 |
| Mouse anti NeuN antibody | Chemicon (Millipore) | MAB377 | 1:500 |
| Species specific secondary antibodies | Jackson Immunoresearch | ||
| Normal Goat Serum (NGS) | 5% | ||
| Triton X-100 | 0.10% | ||
| Mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size | Fisher Scientific | PICM03050 | |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Ethanol | |||
| 95% O2 5% CO2 gas mix | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| Sterile six well plates | |||
| Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas | |||
| Manual or automatic tissue chopper | |||
| Razor blades | |||
| Disposable transfer pipettes | |||
| 35mm and 60mm sterile Petri dishes | |||
| Stereomicroscope | |||
| Inverted Phase Microscope | |||
| Laminar Flow Hood | |||
| Tissue Culture Incubator | |||
| Inverted Fluorescence Microcope | |||
References
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), (1991).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures for long-term live imaging. Nature Protocols. 1 (3), 1165-1171 (2006).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Neuroscience. 7 (2), (2004).
- Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures. Journal of Visualized Experiments JoVE. (61), (2012).
- Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of Visualized Experiments JoVE. (6), e235 (2007).
- Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 10 (1), 9-22 (2009).
- Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
- Bin, J. M., Leong, S. Y., Bull, S. -J., Antel, J. P., Kennedy, T. E. Oligodendrocyte precursor cell transplantation into organotypic cerebellar shiverer slices: a model to study myelination and myelin maintenance. PloS one. 7 (7), (2012).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78 (2), 157-166 (2004).
- Harrer, M. D., von Budingen, H. C., et al. Live imaging of remyelination after antibody-mediated demyelination in an ex model for immune mediated CNS damage. Experimental Neurology. 216 (2), 431-438 (2009).
- Fancy, S. P. J., Harrington, E. P., et al. Axin2 as regulatory and therapeutic target in newborn brain injury and remyelination. Nature Neuroscience. 14 (8), 1009-1016 (2011).
- Zhu, X., Hill, R. A., Dietrich, D., Komitova, M., Suzuki, R., Nishiyama, A. Age-dependent fate and lineage restriction of single NG2 cells. Development. 138 (4), 745-753 (2011).
- Hill, R. A., Patel, K. D., Medved, J., Reiss, A. M., Nishiyama, A. NG2 Cells in White Matter But Not Gray Matter Proliferate in Response to PDGF. Journal of Neuroscience. 33 (36), 14558-14566 (2013).
- Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
- Novak, A., Guo, C., Yang, W., Nagy, A., Lobe, C. G. Z/EG, a double reporter mouse line that expresses enhanced green fluorescent protein upon Cre-mediated excision. Genesis. 28 (3-4), 147-155 (2000).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
- Hirrlinger, P. G., Scheller, A., et al. Expression of reef coral fluorescent proteins in the central nervous system of transgenic mice. Molecular and Cellular Neuroscience. 30 (3), 291-303 (2005).
- Nave, K. -A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Rivers, L. E., Young, K. M., et al. PDGFRA/NG2 glia generate myelinating oligodendrocytes and piriform projection neurons in adult mice. Nature Neuroscience. 11 (12), 1392-1401 (2008).
- Dimou, L., Simon, C., Kirchhoff, F., Takebayashi, H., Gotz, M. Progeny of Olig2-expressing progenitors in the gray and white matter of the adult mouse cerebral cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (41), 10434-10442 (2008).
- Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration. Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).
- Ioannidou, K., Anderson, K. I., Strachan, D., Edgar, J. M., Barnett, S. C. Time-lapse imaging of the dynamics of CNS glial-axonal interactions in vitro and ex vivo. PloS one. 7 (1), e30775 (2012).
- Ghoumari, A. M., Baulieu, E. E., Schumacher, M. Progesterone increases oligodendroglial cell proliferation in rat cerebellar slice cultures. Neuroscience. 135 (1), 47-58 (2005).
- Azim, K., Butt, A. M. GSK3β negatively regulates oligodendrocyte differentiation and myelination in vivo. Glia. 59 (4), 540-553 (2011).
- Hussain, R., El-Etr, M., et al. Progesterone and nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. 152 (10), 3820-3831 (2011).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Lubetzki, C., Demerens, C., et al. Even in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (14), 6820-6824 (1993).
- Demerens, C., Stankoff, B., et al. Induction of myelination in the central nervous system by electrical activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (18), 9887-9892 (1996).
- Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
- Stevens, B., Tanner, S., Fields, R. D. Control of myelination by specific patterns of neural impulses. The Journal of Neuroscience. 18 (22), 9303-9311 (1998).
- Stevens, B., Porta, S., Haak, L. L., Gallo, V., Fields, R. D. Adenosine: a neuron-glial transmitter promoting myelination in the CNS in response to action potentials. Neuron. 36 (5), 855-868 (2002).
- Wake, H., Lee, P. R., Fields, R. D. Control of local protein synthesis and initial events in myelination by action potentials. Science. 333 (6049), New York, N.Y 1647-1651 (2011).
- Rosenberg, S. S., Kelland, E. E., Tokar, E., De la Torre, A. R., Chan, J. R. The geometric and spatial constraints of the microenvironment induce oligodendrocyte differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14662-14667 (2008).
