Abstract
NG2 uttryckande celler (polydendrocytes, oligodendrocyt bildande celler) är den fjärde stora gliacellsmarkörer befolkningen i det centrala nervsystemet. Under embryonal och postnatal utveckling de aktivt föröka sig och skapa myeliniserande oligodendrocyter. Dessa celler har ofta studerats i primära dissocierade kulturer, neuron samodlingar, och fast vävnad. Använda nyligen tillgängliga transgena muslinjer segmentera kultursystem kan användas för att undersöka tillväxt och differentiering av oligodendrocythärkomst celler i både grå och vit substans regioner i framhjärnan och cerebellum. Slice kulturer framställs från tidig postnatal möss och hålls i kultur i upp till 1 månad. Dessa skivor kan avbildas flera gånger under odlingsperioden för att undersöka cellulära beteende och samspel. Denna metod möjliggör visualisering av NG2 celldelning och de steg som leder till oligodendrocyt differentiering samtidigt som detaljerad analys av region-beroendeent NG2 cell och oligodendrocyt funktionell heterogenitet. Detta är en kraftfull teknik som kan användas för att undersöka de inre och yttre signaler som påverkar dessa celler över tiden i en cellulär miljö som liknar den som finns in vivo.
Introduction
Organoytpic slice kulturer i det centrala nervsystemet har visat sig vara mycket användbart för att studera neuron och gliaceller cellbiologi i ett semiintact systemet 1-4. Dessa kulturer är relativt enkla att införa och behålla många fördelar med primära dissocierade cellkulturer såsom manipulation av den extracellulära miljön och enkel tillgång för upprepad långsiktig levande cell imaging och elektrofysiologiska inspelningar 5-9. Dessutom slice kulturer behålla 3-dimensionell vävnads cytoarchitecture, regional neurala anslutning, och de flesta större celltyper finns i systemet. Dessa egenskaper gör dessa kulturer ett unikt och bekvämt system för att undersöka en enda cell beteende och fysiologi med cellulära och miljösamspel.
NG2-celler är en population av gliaceller i centrala nervsystemet hos däggdjur som fortsätter att föröka sig och skapa myelinating oligodendrocyter under embryonal och postnatal utveckling 10. De har studerats i dissocierade primära cellkulturer, och den senaste tidens utveckling av transgena möss linjer med NG2 cellspecifikt uttryck av fluorescerande proteiner har underlättat in vivo öde kartläggning och elektrofysiologiska inspelningar i akuta slice förberedelser. Även med dessa studier, är lite känt om de temporala dynamiken i NG2 celltillväxt och oligodendrocyt differentiering. Även dissocierad cellodling används allmänt för den relativa anläggningen i farmakologiska och genetiska manipulationer, är det inte lämpligt för att förhöra funktionella skillnader av dessa celler i olika områden i hjärnan i synnerhet när det är önskvärt att bibehålla ramen för den cellulära mikromiljön. Slice kulturer ger ett enkelt alternativ som är mottaglig för farmakologiska manipulationer och har använts för att undersöka oligodendrocyt myelination 11,12, cellular svar efter lysolecitin (LPC) eller antikropp inducerad demyelinisering 13,14, och induktion av remyelinisering via farmakologisk behandling 15.
En metod för att undersöka och spela live avbildning och fast vävnad (eller postfixation) analys av NG2 celltillväxt och oligodendrocyt differentiering i organotypiska slice kulturer tas från både framhjärnan och lillhjärnan beskrivs. Detta är en kraftfull metod som kan användas för att studera cellödet av enstaka NG2 celler efter divisionen 16 och för att upptäcka regions och åldersberoende skillnader i tillväxtfaktor inducerade NG2 cellproliferation 17. Denna relativt enkel teknik är allmänt tillgänglig för ytterligare undersöka cell inneboende och / eller miljömässiga mekanismer som reglerar fysiologi dessa gliaceller och deras svar på nervaktivitet eller myelinskada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla djurförsök följer de riktlinjer och har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of Connecticut.
OBS: För dessa experiment konstitutiva NG2cre 18 (JAX # 008.533) och inducerbara NG2creER 16 (JAX # 008.538) transgena möss korsas till Z / EG 19 (JAX # 003.920) eller gtRosa26: YFP reporter 20 (JAX # 006.148) linjer respektive användes till bild NG2-celler och deras avkomma. Till bild mogna oligodendrocyter, var PLPDsRed transgena möss 21 används. För konsekvent överlevnad, kan skivor isoleras från möss upp till postnatal dag 10 från både framhjärnan och lillhjärnan.
1. Slice Förberedelser
- I en kultur huva, placera vävnadskulturinsatser i sex brunnsplattor och tillsätt 1 ml skiva odlingsmedium (recept i reagenser avsnitt). Placera plattorna i cellodlingsinkubator vid 37 ° C med 5% CO 2 i minst 2 h före dissektion.
- Sterilisera alla verktyg och vävnads chopper med 70% etanol.
- Bubble dissektion buffert (recept i reagenser avsnitt) med 95% O2, 5% CO2 på is i minst 15 minuter före starten av dissekering.
- Bedöva mus valpar genom att placera dem på is i 5-10 min enligt godkända djurprotokoll. Därefter bestäms den lämplig anestesidjup genom att bekräfta att mössen inte svarar på svansen och tå nypa.
- Halshugga djur med hjälp av vassa saxar följande djurprotokoll. Snabbt ta bort skallen över framhjärnan och lillhjärnan genom att först göra en sagittal snitt följt av lateralt snitt, med hjälp av steriliserade verktyg. Skär kranialnerver från den ventrala ytan av hjärnan och cerebellum genom att försiktigt rulla vävnaden åt sidan.
- Placera vävnad i en steril 35 mm skål innehållande iskall syresatt dissektion buffert.
- Med hjälp av ett rakblad, kapa lillhjärnan och framhjärnan. Gör sedan en mid-sagittal snitt through framhjärnan och lillhjärnan, separera halvkloten.
- Skär 300 nm tjocka koronala och sagittala avsnitt av framhjärnan och lillhjärnan med manuell vävnad chopper. OBS: En manuell vävnad chopper möjliggör snabb behandling från dissektion till kultur inkubation utan behov av agaros inbäddning. En vibratome kan också användas såsom beskrivits tidigare 9.
- Överför separerade skivor i nyligen bubblade kall dissektion buffert på is.
- Använd små dissekera eller väger spatlar att separera enskilda avsnitt och överföra dem till förinkuberad sex brunnar med kulturinsatser.
- Ta bort överflödigt dissektion buffert från ytan av odlingsinsatsen med hjälp av en engångsöverföring pipett eller en P 200 pipettspetsen. Två till tre framhjärnan eller tre cerebellära skivor kan placeras på en kultur insatsen.
OBS: För konsekventa resultat med framhjärnan kulturer, är det perfekt att ta skivor som spänner över den främre en tredjedel av corpus callosum(Figur 1 A) i syfte att studera både grå och vit substans regioner på samma skiva. Varje djur ger vanligtvis 6 framhjärnan skivor och 6 cerebellum skivor. - Placera de sex brunnsplattor i inkubatorn och byt skiva mediet med 1 ml slice-medium 1 dag efter skiva beredning och sedan varannan dag tills slice fixering.
- Beroende på försöket, använd skivor efter 5-7 dagar i odling. Använd endast skivor som blir transparent efter de första dagarna och kasta de som har ojämna ogenomskinliga områden. OBS: Ogenomskinlig regioner inom segment är synliga för ögat och visas som en klump av mörka celler under fas kontrast. När tekniken har bemästrat, döda opaka skivor förekommer sällan, på mindre än 1-5% av skivor.
2 Time-Lapse avbildning av NG2 celldelning och Oligodendrocyte differentiering
OBS: För att utföra time lapse avbildning av NG2 celltillväxt och differentiering vi använder NG2cre: ZEG möss 16som uttrycker EGFP i NG2-celler och deras avkomma (Figur 1C-E). Reporter uttryck i denna linje är tillräckligt robust för att få levande bilder av GFP + celler i skivor direkt efter snittning under en tidsperiod om minst fyra veckor. De tydligaste bilderna erhålls efter den inledande gallring perioden för den del, som sker under de första 3-5 dagar i odling.
- Under hela försöket, hålla skivorna i en cellkultur inkubator vid 37 ° C och ta bort bara under korta perioder (mindre än 15 min per skiva), att hålla locket på sex brunnar medan avbildning.
- Med hjälp av ett inverterat fluorescensmikroskop utrustat med en digitalkamera, ta bilder vid den första tidpunkten med hjälp av en 10X objektiv. OBS: Första tidpunkter varierar genom experiment och kan vara dagen då skivorna var beredda eller helst punkt efter.
- Fånga bilder från flera regioner vid tidpunkten ett i både grå och vita substansen områden segmentet. Note: tee region avbildas av specifika landmärken inom skiva och genom att mappa bild läge på en schematisk, som kan användas för efterföljande avbildning sessioner. Användbara landmärken kan innehålla kanterna på skivorna och / eller orientering av vita substans. Bild 4-8 platser på varje skiva vid varje tidpunkt.
- Fånga efterföljande bilder med ett intervall på 4-6 timmar, om att undersöka NG2 celldelning och oligodendrocyt differentiering, helst mer än 5-7 dagar.
- Fånga en slutlig bild av alla regioner och fixa skivorna omedelbart. Tillsätt 1 ml fixativ (4% PFA med 0,1 M L-lysin 0,01 M natriummeta perjodat) till botten av odlingsinsatsen och tillsätt sedan ytterligare 1 ml ovanpå skivorna. Se till att inte spruta fixerings direkt på skiva eftersom det kan lossna från membranet. Fäst vävnaden i 30 min och fortsätt med immunhistokemi använder utvecklingsstadiespecifika markörer som beskrivs i avsnitt 4.
- Tvätta skivor med 0,2 M natriumfosfatbuffert 3 x 10 min. Om nödvändiga, lagra skivor vid 4 ° C i 0,2 M natriumfosfatbuffert för 1-3 dagar före immunfärgning men idealiskt utföra färgning inom 24 tim. Fortsätt med immunohistokemi som beskrivs nedan i avsnitt 4 för att bestämma hur stor andel av celler som har differentierade i oligodendrocyter (Figur 2D-F).
3 Ödet Kartläggning av NG2 cell Progeny Använda Inducerbar Reporter Transgena möss i Slice kulturer
OBS: För att spåra öde NG2-celler från en viss tidpunkt i kulturen, inducerbara NG2creER: kan YFP transgena möss användas.
- Inducera Cre rekombination och reporterexpression genom tillsats av 100 nM 4OHT löstes i etanol till odlingsmediet. OBSERVERA: Reporter positiva celler bör visas inom 1-2 dagar vid en induktions effektivitet ~ 20-25% YFP + NG2 + / NG2 + celler och vid denna tidpunkt kommer alla att vara celler vid NG2 cellstadiet (Figur 2A-C)
- Fix och tvätta skivas vid olika tidpunkter efter olika manipulationer (som beskrivs i avsnitten 2.5 och 2.6).
4. Slice Immunohistokemi
- Skär membran med skivorna kopplade ur insatserna med hjälp av en skalpell.
- Överför skivor till enskilda brunnar i en 24 brunnar innehåller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med hjälp av en uppsättning pincett, noga med att inte störa sammansättningen av den del när man plockar upp membranet.
- Överför skivorna till en 24 brunnars platta med blockeringslösning innehållande 5% normalt getserum (NGS) och 0,1% Triton-X100 i PBS under 1 tim.
- Inkubera skivor i primär antikropp O / N i 5% NGS i PBS vid 4 ° C. För att identifiera celler i NG2 cellstadiet, använder antikroppar mot NG2 och PDGFRα. För att identifiera differentierade oligodendrocyter, använd en antikropp mot adenomatös polypos coli antigen (APC, klon CC1).
- På den andra dagen tvätta skivor i PBS 3 x15 min, sedan inkubera vid sekundär Antibodör i 5% NGS i PBS under 1 h vid RT. Tvätta skivor i PBS 3 x15 min och montera på diabilder. Montera med skivor upp och membran inför bilden så att membranet inte kommer att vara mellan den objektiva och vävnaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Exempel på representativa uppgifter ges nedan som har erhållits med slice kulturer från både framhjärnan och lillhjärnan i P8 NG2cre: ZEG, NG2creER: YFP och PLPDsRed transgen mus linjer. NG2-celler kan avbildas under dagarna i framhjärnan och lillhjärnan skivor (Figur 1B-D, Video 1) och fenotyp av dessa celler kan bestämmas efter fixering och immunfärgning med NG2 och CC1 antikroppar (Figur 1E). Förutom att leva avbildning, kan celltillväxt också utföras med immunhistokemisk färgning för cellproliferationsmarkörer såsom Ki67 (Figur 1F). Dessa data möjliggör detaljerad analys av de temporala dynamiken i oligodendrocyt differentiering efter NG2 celldelning på individuell cell basis. Ödet kartläggning av NG2-celler kan utföras efter induktion av cre-rekombination i skivor med 4OHT i NG2creER: YFP möss (figur 2). YFP reporter-uttryck NG2 + celler var found i kulturerna två dagar efter tillsats av 4OHT till odlingsmediet (Figur 2A). Sex dagar efter 4OHT induktion, hade en andel av YFP + celler differentieras till CC1 + oligodendrocyter (Figur 2B). Dessa data visar att möjligheten att utföra öde kartläggning av NG2-celler i skivor där den extracellulära miljön kan manipuleras för att testa effekterna av farmakologiska medel eller olika förolämpningar på öde NG2-celler. Olika koncentrationer av 4OHT kan användas för att uppnå olika grader av cre-rekombination. Till exempel exponering för 100 nM 4OHT i 2 dagar orsakar reporter uttryck i cirka 20-25% av alla NG2 uttryckande celler medan 1 ^ M 4OHT ger ca 60-70% rekombinationseffektivitet. Slutligen är omfattande myelin närvarande i dessa kulturer och myeliniserande oligodendrocyter kan avbildas i levande och fixerade skivor använder PLPDsRed transgena möss (fig 3, video 2).
Figur 1 Skiva odlingsmetod för långsiktig avbildning av NG2 celltillväxt och differentiering (AB) Schematisk visar isoleringen av framhjärnan och lillhjärnan skivor (A) och efterföljande odling och tidsförlopp avbildning med slice kulturinsatser (B). (C ) Återgivning skisserar NG2 celldelning och efterföljande oligodendrocyt differentiering i NG2cre:. ZEG transgena möss (D) Exempel bilder förvärvas från kortikala regioner i NG2cre: ZEG möss som uppvisar en enda GFP + celler (pilar) dividera två gånger under en period av 122 h, tid avbildad i övre högra hörnet timmar efter starten av avbildningsexperiment. (E) Fixering och immunfärgning med anti-NG2 och CC1 antikroppar av samma skiva visar att den avbildade dividing celler resulterade i tre NG2 + celler (pilar). (F) Exempel bild som visar två Ki67 + NG2 + celler i en kortikal bit kultur. (G) Exempel bild som visar NG2 + celler (pilspetsar) och deras processer sammanflätade med Neun + neuronala kärnor i en kortikal bit kultur. Skala Bars 25 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 Induktion av YFP uttryck att spåra ödet för NG2-celler i framhjärnan slice kulturer (AB) bilder tagna av corpus callosum regionen av framhjärnan slice kulturer från NG2creER: YFP möss behandlade med 4OHT för 24 h och lämnades sedan i kultur under två dagar (A) eller 6 dagar (B) (A) eller CC1 och YFP (B) visar differentieringen av reporter positiva NG2 celler i oligodendrocyter medan kultur 6 dagar efter cre rekombination (pil). Skala Bars 25 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Imaging oligodendrocyter i slice kulturer från PLPDsRed transgena möss. (A) Schematisk visar isolering, odling och avbildning av cerebellum skivor från PLPDsRed transgena möss. (B) Bild tagen från en fast cerebellum skiva efter 5 dagar in vitro visar calbindin + ( cyan) purkinje nervceller med myeliniserademyelinbasprotein + (MBP) (grön) axoner som skjuter in i vita substans regioner i segmentet. Scale Bar 25 um. (C) låg förstoring bilder som tagits från samma region varannan dag vid de tidpunkter som anges i timmar i lillhjärnan slice kulturer från PLPDsRed möss. Scale Bar 100 pm. (D) Låg förstoring bild tagen från en fast PLPDsRed bit kultur visar MBP uttryck i vita substans regioner där DsRed + celler är koncentrerade. Scale Bar 100 pm. (E) Hög förstoring bild tagen från en fast PLPDsRed bit kultur visar enstaka DsRed + oligodendrocyter med MBP + processer. Scale Bar 20 pm. (F) Time-lapse-sekvens tagen från en PLPDsRed cerebellum skiva visar relativt stabila cellkroppar under 48 h avbildning session, tid som anges i övre högra i timmar. Scale bar 25 | im. Grundense klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1 Live avbildning av NG2 celldelning i en kortikal bit kultur representant time lapse-sekvens visar flera celldelningar i en kortikal bit kultur tas från en NG2cre:. ZEG transgen mus. Videon visas på 5 bilder per sekund, montage av bilder som visas i figur 1. (Se "Video_1.mov" under Downloads)
Video 2 Live avbildning av oligodendrocyter i lillhjärnan slice kulturer representant time lapse-sekvens som visar små förändringar i oligodendrocyt morfologi (pil) avbildas över 48 timmar i en lillhjärnan skiva tas från en PLPDsRed transgen mus. Videon visas vid 3 bilder per sekund, montage av bilder som visas i figur 3. (Se "Video_2.mov" under Downloads)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Myelinisering i det centrala nervsystemet är viktigt för effektiv neuronal kommunikation och axonal överlevnad 22. NG2-celler genererar kontinuerligt myeliniserande oligodendrocyter i vuxen ålder, medan en bofast befolkning i de flesta områden i hjärnan 16,23 upprätthålla - 25. Vissa genetiska och molekylära mekanismer som reglerar differentieringen av dessa celler har beskrivits, men mycket återstår att upptäcka. Organotypiska slice kulturer är ett praktiskt verktyg för att undersöka dessa mekanismer på grund av deras unika egenskaper upprätthålla anatomiska regioner, enkel manipulation av den extracellulära miljön, robust myelination, och närvaron av alla större celltyper. Dessa egenskaper underlättar utredning av korta och långa interaktioner mellan NG2-celler, oligodendrocyter och axoner 11,26. Dessutom är relativt lätt att utföra celltransplantation och kan användas för att undersöka området beroende differences i cellbeteende 17. Dessutom kan farmakologiska behandlingar sättas till odlingsmediet för att undersöka molekylära mekanismer som påverkar NG2 cellproliferation och / eller differentiering i normala 17,27,28 och demyelinerade kulturer 15,29. Slutligen är det tekniskt möjligt att använda slice kulturer att utföra skärmar för hög genomströmning analys av föreningar som direkt NG2-celler att föröka sig eller skilja, kanske till och med efter en demyeliniserande förolämpning 30.
Nuvarande metoder för att undersöka oligodendrocythärkomst celler och deras interaktioner med axoner i en kontrollerad kultur inställning inkluderar co-kulturer med dissocierade dorsalrotganglia (DRG) eller embryonala kortikala neuroner och NG2-celler 31,32, vilket var baserade på originalpreparat som utvecklats för att undersöka DRG -Schwann cellinteraktioner 33. Dessa kulturer har använts för att undersöka de grundläggande egenskaperna av axon och oligodendrocythärstamning cell interaktioner inklusive nervaktivitet beroende signalering att inducera differentiering och myelin produktion 32,34 - 36 utöver andra frågor som t.ex. beroendet av axon diameter och NG2 celltäthet kontrollerande spridning och uppkomsten av differentiering 37. Även om dessa samodling system är idealiska för att ta itu med sådana frågor, direkt korrelation och ansökan till in vivo-situationen är inte alltid tydlig. Som tidigare nämnts, organotypiska slice kulturer ger en unik förutsättning för att upprätthålla många av de lokala neuronala anslutningar och tredimensionell cytoarchitecture som går förlorade i samarbete kultur preparat av dissocierade celler. Vidare till skillnad organotypiska slice kulturer, co-odlingssystem för dissocierade celler ofta inte inkludera andra gliaceller och extracellulära matrixmolekyler som har visat att spela nyckelroller i utveckling, underhåll och fysiologi NG2-celler, oligodendrocyterOch myelin. Med den dramatiska tillväxten i olika verktyg tillgängliga för specifik märkning och hantering av olika cellpopulationer med virala vektorer och transgena djur, långsiktig imaging och öde kartläggning i organotypiska slice kulturer skulle visa sig vara en kraftfull teknik för utredning av NG2 cell proliferation, differentiering och oligodendrocyt myelination.
Flera viktiga steg bör utföras när du utför dessa experiment för att säkerställa slice överlevnad och reproducerbarhet uppgifter. Först, för att generera friska skivor, sektionering och isolering av skivor bör utföras så snabbt som möjligt och i iskall dissektion buffert. För det andra, medan automatisk bildläge förvärv med en motoriserad skede på fluorescensmikroskop kan vara användbart, det finns många faktorer som kan störa den exakta omlokalisering av regionerna avbildas och manuell upprepad förvärvs är nödvändigt för att få konsekvent tillförlitliga bilder över Thurstone dagarna. Detta är särskilt nödvändigt om skivorna hålls i en cellodlingsinkubator mellan avbildning sessioner och inte i en scen-top inkubator. För det tredje, det är under slice fixering, färgning, och monterings oerhört viktigt att hantera skivorna försiktigt som eventuella störningar i vävnaden kommer att resultera i en oförmåga att flytta levande avbildade regioner och celler. Det finns inga särskilda ändringar traditionella metoder som används för slice kultur preparat som används för studier av nervceller och astrocyter.
Det finns flera begränsningar för bit kultur metod som måste beaktas. Astrocyter, mikroglia och NG2-celler är kända för att svara på CNS-skada med ökad proliferation vid platsen för skadan och bildandet av en gliaceller ärr. Processen att förbereda skivor resultat i vissa omorganisation och en initial reaktiv glia svar från dessa celler. NG2 cellproliferationshastigheter återgå till de nivåer som rapporterades in vivo för matchadeutvecklingsstadier efter flera dagar i odling men de ökade spridningshastigheter och initial reaktiv fenotypen av dessa celler måste beaktas vid tolkning av uppgifterna. Förekomsten av hästserum i odlingsmediet kan förändra NG2 celltillväxt och bör beaktas vid tolkning av resultaten av alla experiment. Utöver detta, samtidigt som det finns spontana nervaktivitet, sinnesintryck och långväga förbindelser mellan nervceller saknas, vilket kan leda till förändrad nervaktivitet inom segmentet. Slutligen utan användning av specifika promotordrivna virala vektorer eller transgena möss, cell typspecifika genetiska manipulationer inom slice kultursystem är en utmaning. Även dessa begränsningar bör beaktas när man utformar experiment slice kulturer är ett unikt system som kan användas för att få nya insikter i frågor som inte kan besvaras med dissocierade cellkulturer eller i det intakta djuret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slice Culture Medium | |||
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11090 | 50% |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175 | 25% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | 25mM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 1mM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 1mg/L |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 0.4mM |
| Horse Serum | Hyclone | SH30074.03 | 25% |
| Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius | |||
| Dissection Buffer | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 124mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.004mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | 1.25mM |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M7506 | 4.004mM |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 2mM |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | 26mM |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | 10mM |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 2.0mM |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | 0.075mM |
| Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use | |||
| Other Reagents and Supplies | |||
| 4-hydroxy tamoxifen (4OHT) | Sigma-Aldrich | H7904 | 100nM |
| Paraformaldehyde (PFA) | EM Sciences | 19200 | 4% |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L-6027 | 0.1M |
| Sodium Metaperiodate | Sigma-Aldrich | S-1878 | 0.01M |
| Rabbit anti NG2 antibody | Chemicon (Millipore) | AB5320 | 1:500 |
| Mouse anti CC1 antibody | Calbiochem (Millipore) | OP80 | 1:200 |
| Mouse anti Ki67 antibody | Vision Biosystems | NCL-Ki67-MM1 | 1:300 |
| Mouse anti NeuN antibody | Chemicon (Millipore) | MAB377 | 1:500 |
| Species specific secondary antibodies | Jackson Immunoresearch | ||
| Normal Goat Serum (NGS) | 5% | ||
| Triton X-100 | 0.10% | ||
| Mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size | Fisher Scientific | PICM03050 | |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Ethanol | |||
| 95% O2 5% CO2 gas mix | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| Sterile six well plates | |||
| Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas | |||
| Manual or automatic tissue chopper | |||
| Razor blades | |||
| Disposable transfer pipettes | |||
| 35mm and 60mm sterile Petri dishes | |||
| Stereomicroscope | |||
| Inverted Phase Microscope | |||
| Laminar Flow Hood | |||
| Tissue Culture Incubator | |||
| Inverted Fluorescence Microcope | |||
References
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), (1991).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures for long-term live imaging. Nature Protocols. 1 (3), 1165-1171 (2006).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Neuroscience. 7 (2), (2004).
- Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures. Journal of Visualized Experiments JoVE. (61), (2012).
- Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of Visualized Experiments JoVE. (6), e235 (2007).
- Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 10 (1), 9-22 (2009).
- Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
- Bin, J. M., Leong, S. Y., Bull, S. -J., Antel, J. P., Kennedy, T. E. Oligodendrocyte precursor cell transplantation into organotypic cerebellar shiverer slices: a model to study myelination and myelin maintenance. PloS one. 7 (7), (2012).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78 (2), 157-166 (2004).
- Harrer, M. D., von Budingen, H. C., et al. Live imaging of remyelination after antibody-mediated demyelination in an ex model for immune mediated CNS damage. Experimental Neurology. 216 (2), 431-438 (2009).
- Fancy, S. P. J., Harrington, E. P., et al. Axin2 as regulatory and therapeutic target in newborn brain injury and remyelination. Nature Neuroscience. 14 (8), 1009-1016 (2011).
- Zhu, X., Hill, R. A., Dietrich, D., Komitova, M., Suzuki, R., Nishiyama, A. Age-dependent fate and lineage restriction of single NG2 cells. Development. 138 (4), 745-753 (2011).
- Hill, R. A., Patel, K. D., Medved, J., Reiss, A. M., Nishiyama, A. NG2 Cells in White Matter But Not Gray Matter Proliferate in Response to PDGF. Journal of Neuroscience. 33 (36), 14558-14566 (2013).
- Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
- Novak, A., Guo, C., Yang, W., Nagy, A., Lobe, C. G. Z/EG, a double reporter mouse line that expresses enhanced green fluorescent protein upon Cre-mediated excision. Genesis. 28 (3-4), 147-155 (2000).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
- Hirrlinger, P. G., Scheller, A., et al. Expression of reef coral fluorescent proteins in the central nervous system of transgenic mice. Molecular and Cellular Neuroscience. 30 (3), 291-303 (2005).
- Nave, K. -A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Rivers, L. E., Young, K. M., et al. PDGFRA/NG2 glia generate myelinating oligodendrocytes and piriform projection neurons in adult mice. Nature Neuroscience. 11 (12), 1392-1401 (2008).
- Dimou, L., Simon, C., Kirchhoff, F., Takebayashi, H., Gotz, M. Progeny of Olig2-expressing progenitors in the gray and white matter of the adult mouse cerebral cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (41), 10434-10442 (2008).
- Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration. Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).
- Ioannidou, K., Anderson, K. I., Strachan, D., Edgar, J. M., Barnett, S. C. Time-lapse imaging of the dynamics of CNS glial-axonal interactions in vitro and ex vivo. PloS one. 7 (1), e30775 (2012).
- Ghoumari, A. M., Baulieu, E. E., Schumacher, M. Progesterone increases oligodendroglial cell proliferation in rat cerebellar slice cultures. Neuroscience. 135 (1), 47-58 (2005).
- Azim, K., Butt, A. M. GSK3β negatively regulates oligodendrocyte differentiation and myelination in vivo. Glia. 59 (4), 540-553 (2011).
- Hussain, R., El-Etr, M., et al. Progesterone and nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. 152 (10), 3820-3831 (2011).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Lubetzki, C., Demerens, C., et al. Even in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (14), 6820-6824 (1993).
- Demerens, C., Stankoff, B., et al. Induction of myelination in the central nervous system by electrical activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (18), 9887-9892 (1996).
- Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
- Stevens, B., Tanner, S., Fields, R. D. Control of myelination by specific patterns of neural impulses. The Journal of Neuroscience. 18 (22), 9303-9311 (1998).
- Stevens, B., Porta, S., Haak, L. L., Gallo, V., Fields, R. D. Adenosine: a neuron-glial transmitter promoting myelination in the CNS in response to action potentials. Neuron. 36 (5), 855-868 (2002).
- Wake, H., Lee, P. R., Fields, R. D. Control of local protein synthesis and initial events in myelination by action potentials. Science. 333 (6049), New York, N.Y 1647-1651 (2011).
- Rosenberg, S. S., Kelland, E. E., Tokar, E., De la Torre, A. R., Chan, J. R. The geometric and spatial constraints of the microenvironment induce oligodendrocyte differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14662-14667 (2008).
