Abstract
NG2 экспрессирующие клетки (polydendrocytes, клетки-предшественники олигодендроцитов) являются четвертым главным населения глиальных клеток в центральной нервной системе. Во время эмбрионального и постнатального развития они активно размножаются и генерировать myelinating олигодендроцитов. Эти клетки обычно были изучены в первичных диссоциированных культур нейронов, совместных культурах, и в основной ткани. Использовании новейших трансгенных линий мышей нарезать системы культивирования могут быть использованы для исследования пролиферацию и дифференцировку олигодендроцитов клона клеток в обоих серого и белого вещества регионах переднего мозга и мозжечка. Срез культуры готовят из ранних послеродовых мышей и хранятся в культуре в течение до 1 месяца. Эти кусочки могут быть отображены несколько раз в течение периода культивирования исследовать клеточный поведение и взаимодействие. Этот метод позволяет визуализация разделения NG2 клеток и шаги, ведущие к олигодендроцитов дифференциации при одновременном обеспечении подробный анализ региона-зависитЛОР NG2 клеток и олигодендроцитов функциональная гетерогенность. Это мощный метод, который может быть использован, чтобы исследовать внутренние и внешние сигналы, влияющие на эти клетки в течение долгого времени в сотовой среде, которая близко напоминает, что найдено в естественных условиях.
Introduction
Organoytpic срез культуры центральной нервной системы, оказались чрезвычайно полезны для изучения нейрон и глиальных клеточной биологии в semiintact системы 1 - 4. Эти культуры сравнительно просто принять и сохранить множество преимуществ первичных культурах диссоциированных клеток, таких как манипуляции с внеклеточной среде и легким доступом для повторил долгосрочного изображений живых клеток и электрофизиологических записей 5 - 9. Кроме того, срез культуры поддерживать 3-мерное тканей цитоархитектуры, региональных связей нейронной, и большинство крупных типы клеток присутствуют в системе. Эти свойства делают эти культуры уникальную и удобную систему для расследования одного поведение клеток и физиологию с сотовой и экологических взаимодействий.
NG2 клетки население глиальных клеток в центральной нервной системе млекопитающих, которые продолжают пролиферировать и генерируют мyelinating олигодендроцитов во время эмбрионального и постнатального развития 10. Они были широко изучены в диссоциированных первичных клеточных культур, и недавняя разработка трансгенных линий мышей с клеточно-специфической экспрессии NG2 флуоресцентных белков способствовала в отображении естественных судьбы и электрофизиологических записей в острых срезов препаратов. Даже с этими исследованиями, мало известно о временной динамики пролиферации клеток NG2 и олигодендроцитов дифференциации. Хотя диссоциированной клеточной культуры широко используется для относительного объекта в фармакологических и генетических манипуляций, он не подходит для допроса функциональные различия этих клеток в разных отделах головного мозга, особенно, когда желательно, чтобы поддерживать контекст сотовой микросреды. Срез культуры обеспечивают простой альтернативой то, что поддается фармакологических манипуляций и были использованы для расследования олигодендроцитов миелинизации 11,12, клеткаулар ответ после лизолецитина (LPC) или антитела индуцированной демиелинизации 13,14 и индукцию ремиелинизации через фармакологического лечения 15.
Способ для расследования и выступать с концертами изображений и фиксированной ткани (или postfixation) анализ пролиферации клеток NG2 и олигодендроцитов дифференциации в органотипических культур срез, взятых из обоих переднего мозга и мозжечка, описанное. Это мощный метод, который может быть использован для изучения клеток судьбу отдельных клеток NG2 после деления 16 и открыть для себя Region- и зависит от возраста различия в фактор роста распространения индуцированных NG2 клеток 17. Этот сравнительно простой метод широко доступны для дальнейшего расследования ячейку внутренней и / или окружающей среды механизмы, регулирующие физиологию этих глиальных клеток и их реакцию на нейронной активности или повреждения миелина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных в соответствии с инструкциями и были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) в Университете штата Коннектикут по.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих экспериментов учредительных NG2cre 18 (JAX # 008533) и индуцибельных NG2creER 16 (JAX # 008538) трансгенные мыши подошел к Z / EG 19 (JAX # 003920) или gtRosa26: YFP репортер 20 (JAX # 006148) линии соответственно были использованы с изображением NG2 клеток и их потомства. Для изображения зрелых олигодендроцитов, PLPDsRed трансгенных мышей 21 были использованы. Для последовательного выживания, ломтики могут быть выделены из мышей до 10 день постнатального как от переднего мозга и мозжечка.
1 ломтик Подготовка
- В капюшоне культуры, разместить культуры ткани вставки в шести луночные планшеты и добавить 1 мл ломтик культуральной среды (рецепт в реагентов разделе). Положите пластины в культуре клеток инкубаторе при температуре 37 ° С с 5% CO 2, по крайней мере 2 час до контрольного вскрытия.
- Стерилизовать все инструменты и ткани вертолет с 70% этанола.
- Bubble рассечение буфера (рецепт в реагентов разделе) с 95% О 2, 5% СО 2 на льду в течение не менее 15 мин до начала вскрытия.
- Обезболить щенков мыши, поместив их на льду в течение 5-10 мин в соответствии с утвержденными протоколами животных. Определить подходящий глубины анестезии, подтвердив, что мыши не реагируют на хвосте и ног щипать.
- Обезглавить животных, используя острые ножницы следующие протоколы животных. Быстро удалить череп над переднего мозга и мозжечка, сначала делает сагиттальный разрез с последующим боковым разрезом, с использованием стерильных инструментов. Вырезать черепных нервов из вентральной поверхности мозга и мозжечка, тщательно прокатки ткани в сторону.
- Поместите ткань в стерильную 35 мм блюдо с ледяной кислородом буфер рассечение.
- Используя лезвие, разорвать мозжечок и передний мозг. Затем сделайте в середине сагиттальной разрез беспересадочныйтьфу передний мозг и мозжечок, разделения полушарий.
- Вырезать 300 мкм-толстые фронтальной и сагиттальной разделы переднего мозга и мозжечка с механической ткани вертолета. ПРИМЕЧАНИЕ: ручная ткани измельчитель позволяет быструю обработку от вскрытия до культуры инкубации без необходимости агарозном вложения. Vibratome также могут быть использованы, как описано выше 9.
- Трансфер разделенные ломтики в недавно пропускают буфер холодно рассечение на льду.
- Используйте небольшую рассечения или весом шпатели для разделения отдельных разделов и передавать их на преинкубировали шесть также блюда с культурой вставками.
- Удалите излишки буфера рассечение с поверхности культурального вставки с помощью одноразовой пипетки передачи или пипетки наконечник Р 200. Два-три переднего мозга или мозжечка трех кусочков могут быть размещены на одной культуры вставки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения одинаковых результатов с переднего мозга культур, он идеально подходит, чтобы взять ломтики охватывающих передней трети мозолистого тела(1А) для того, чтобы изучать как серые и белые области материи в том же срезе. Каждое животное, как правило, дает 6 ломтиков переднего мозга и 6 частей мозжечка. - Поместите луночных шесть в инкубаторе и заменить ломтик среды 1 мл ломтик среде 1 день после приготовления срезов и затем через день до среза фиксации.
- В зависимости от эксперимента с помощью срезов через 5-7 дней в культуре. Используйте только ломтики, которые становятся прозрачными после первых нескольких дней и отбросить те, которые имеют неровные непрозрачные области. ПРИМЕЧАНИЕ: Непрозрачные участки внутри кусочков видны на глаз и появляются в виде скопления темных клеток под фазового контраста. После, как технология была освоена, мертвые непрозрачные ломтики встречаются редко, менее чем 1-5% от ломтиками.
2 цейтраферной Визуализация NG2 деления клеток и олигодендроцитов дифференциации
ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения функции длительной визуализации клеточной пролиферации NG2 и дифференциации мы используем NG2cre: ZEG мышей 16которые выражают EGFP в NG2 клеток и их потомства (Рисунок 1C-E). Репортер выражение в этой линии является достаточно прочным, чтобы получить живые изображения GFP + клеток в срезах сразу после срезов в течение периода времени, по меньшей мере, четырех недель. Наиболее четкие изображения получаются после начального периода прореживания среза, которая происходит в течение первых 3-5 дней в культуре.
- В течение всего эксперимента, держать ломтики в инкубаторе для клеточных культур при 37 ° С и удалить только в течение коротких периодов времени (менее 15 мин на срезе), сохраняя крышку на луночного планшета шесть в то время формирования изображения.
- Использование инвертированного флуоресцентного микроскопа, снабженного цифровой камеры, захват изображений в первой точке времени, используя цели 10X. ПРИМЕЧАНИЕ: Первые временные точки будет варьироваться в зависимости от эксперимента и может быть день, когда ломтики были подготовлены или в любое время точка после.
- Захват изображения с нескольких регионах в момент времени один в обоих серого и белого вещества областях среза. Примечание йэлектронной область отображаемого на конкретных ориентиров в пределах среза и путем сопоставления положения изображения на схеме, которая может быть использована для последующих сеансов обработки изображений. Полезные ориентиры могут включать края ломтиков и / или ориентации трактов белого вещества. Изображение 7:56 местах на каждом срезе в каждый момент времени.
- Захват остальных изображений с интервалом в 4-6 часа, если отдел экспертизы NG2 клеток и олигодендроцитов дифференциацию, в идеале более 5-7 дней.
- Захват окончательный образ всех регионах и немедленно устранить ломтики. Добавить 1 мл фиксатора (4% PFA 0,1 М L-лизина 0,01 М натрий мета-периодатом) в нижней части культуры вставки, а затем добавить еще 1 мл на верхней части ломтиков. Будьте осторожны, не шприц фиксатором непосредственно на срезе, как это может отделиться от мембраны. Закрепите ткань в течение 30 мин и заполните иммуногистохимии с использованием развития маркеры стадии конкретных, как описано в разделе 4.
- Ломтики Промыть 0,2 М натрия фосфатного буфера 3 х 10 мв. При необходимости хранить кусочки при 4 ° С в 0,2 М фосфатном буфере натрия в течение 1-3 дней перед иммунного окрашивания, но в идеале выполнить окрашивание в течение 24 часов. Продолжайте иммуногистохимии, как описано ниже в разделе 4, чтобы определить долю клеток, которые дифференцировались в олигодендроциты (Рисунок 2D-F).
3 Судьба картирование NG2 клеток потомства Использование Индуцибельная Репортер трансгенных мышей в срез культуры
Примечание: Чтобы отслеживать судьбу NG2 клеток от конкретной временной точке в культуре, индуцируемые NG2creER: YFP трансгенные мыши могут быть использованы.
- Вызвать Cre рекомбинации и репортер выражение добавлением 100 нМ 4OHT растворяют в этаноле в культуральную среду. Примечание: Reporter позитивные клетки должен появиться в течение 1-2 дней при индукционной эффективности ~ 20-25% YFP + NG2 + / NG2 + клеток и в этот момент времени все будут клетки на стадии NG2 клеток (Фигура 2А-С)
- Fix и мыть кусочекс при различных временных точках после различных манипуляций (описано в разделах 2.5 и 2.6).
4 Slice Иммуногистохимия
- Нарежьте мембран с ломтиками прикрепленных из вставок с помощью скальпеля.
- Трансфер ломтики в отдельные лунки 24 луночного планшета, содержащего фосфатным буферным раствором (PBS), используя набор пинцетом, стараясь не нарушить состав среза, когда поднимаете мембрану.
- Передача ломтики в 24-луночный планшет с блокировкой раствора, содержащего 5% нормальной козьей сыворотки (NGS) и 0,1% Triton-X100 в PBS в течение 1 часа.
- Инкубируйте срезов в начальной O антител / N в 5% NGS в PBS при 4 ° С. Для идентификации клеток в стадии NG2 клеток, использовать антитела к NG2 и PDGFRα. Для выявления дифференцированных олигодендроциты, использовать антитела к САП палочки антигена (APC; клон CC1).
- На втором ломтиками день стирки в PBS 3 x15 мин, затем инкубировать в средней Antiboумирает в 5% NGS в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре. Вымойте ломтики в PBS 3 x15 мин и смонтировать на слайдах. Установите с кусочками вверх и мембраны, стоящих перед слайд так, что мембрана не будет между объективным и ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Примеры репрезентативных данных приведены ниже, которые были получены с помощью срез культуры как от переднего мозга и мозжечка P8 NG2cre: ZEG, NG2creER: YFP и PLPDsRed трансгенных линий мышей. NG2 клетки могут быть отображены в течение нескольких дней в переднего мозга и мозжечка ломтиками (Фигура 1В-D, видео 1) и фенотипа этих клеток может быть определена после фиксации и иммунного окрашивания с NG2 и CC1 антител (1E) Рис. Кроме того, чтобы живого изображения, пролиферации клеток, также может быть оценена с помощью иммуногистохимического окрашивания для маркеров клеточной пролиферации, таких как Ki67 (Рисунок 1F). Эти данные позволяют для детального анализа временной динамики олигодендроцитов дифференциации после деления NG2 клеток на индивидуальной основе клеток. Судьба отображение NG2 клеток может осуществляться после индукции CRE рекомбинации в ломтики с 4OHT в NG2creER: YFP мыши (рисунок 2). + Клетки NG2 репортер-выражения YFP были FOунд в культурах через два дня после добавления 4OHT к культуральной среде (Фиг.2А). Через шесть дней после индукции 4OHT, доля + клеток YFP дифференцировались в CC1 + олигодендроцитах (Рисунок 2B). Эти данные указывают на целесообразность проведения судьба отображение NG2 клеток в срезах, где внеклеточной среде можно манипулировать, чтобы проверить эффекты фармакологических средств или различных оскорблений о судьбе NG2 клеток. Различные концентрации 4OHT могут быть использованы для достижения различных степеней CRE рекомбинации. Например, воздействие до 100 нм 4OHT в течение 2 дней вызывает репортера выражение в примерно 20-25% от всех клеток, экспрессирующих NG2 в то время как 1 мкМ 4OHT приводит к примерно 60-70% эффективности рекомбинации. Наконец, обширный миелина присутствует в этих культурах и myelinating олигодендроциты могут быть отображены в живых и фиксированных срезов с помощью PLPDsRed трансгенных мышей (Рисунок 3, Видео 2).
Рисунок 1 ломтик способ культивирования для долгосрочного визуализации распространения NG2 клеток и дифференцировка (AB) схематическое изображение изоляцию переднего мозга и мозжечка ломтиками (A) и последующего культивирования и покадровой обработки изображений с помощью срез культуры вставки (B). (C ) описание изложением разделение NG2 клеток и последующую дифференцировку олигодендроцитов в NG2cre:. ZEG трансгенных мышей (D) Пример изображения, полученные от корковых регионов NG2cre: мышей ZEG, показывающие одну GFP + клеток (стрелки), разделяющую два раза в течение 122 ч, время изображен в верхнем правом углу, как часов после начала эксперимента изображений. (E) фиксации и иммунного окрашивания с анти-NG2 и CC1 антител одного и того же среза показывает, что отображаемого dividiнг клетки в результате чего три NG2 + клеток (стрелки). (F) Пример изображения, показывая два Ki67 + NG2 + клеток в корковой культуры среза. (G) Пример изображение, показывающее NG2 + клетки (стрелки) и их процессы переплетаются с Neun + нейронных ядер в корковых ломтик культуры. Масштабные Бары 25 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2 индукции экспрессии YFP отслеживать судьбу NG2 клеток в передний мозг срез культуры (АВ) Изображения, полученные из мозолистого тела области переднего мозга срез культуры от NG2creER: мышей YFP обработанные 4OHT в течение 24 часов, а затем оставшиеся в культуре в течение 2 дней (А) или 6 дней (В) (А) или CC1 и YFP (B), демонстрирующего дифференциацию репортерных положительных клеток NG2 в олигодендроциты то время как в культуре через 6 дней после CRE рекомбинации (стрелка). Масштабные Бары 25 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3 визуализации олигодендроциты в срез культуры от PLPDsRed трансгенных мышей. (А) Схематическое изображающая изоляцию, культивирования и обработки изображений мозжечка ломтиками из PLPDsRed трансгенных мышей. (B), снятую с фиксированной мозжечка срез через 5 дней в пробирке показывая кальбиндин + изображения ( Cyan) Пуркинье нейроны с миелинизированныхосновного белка миелина + (МВР) (зеленый) аксоны выступающие в белом веществе регионах ломтик. Масштабная линейка 25 мкм. (C) низкой кратности изображения, снятые из того же региона через день в указанное время в часах в мозжечок срез культуры от мышей PLPDsRed. Масштабная линейка 100 мкм. (D) Низкая увеличением изображения получены из конкретного PLPDsRed среза культуры, показывая выражение MBP в белых районах от того, где DsRed + клетки сосредоточены. Масштабная линейка 100 мкм. (E) Высокое увеличение изображения получены из конкретного PLPDsRed культуры ломтик показывая одинокий DsRed + олигодендроцитов с MBP + процессов. Масштабная линейка 20 мкм. (F) последовательность Покадровый взяты из PLPDsRed мозжечка срез, показывающий относительно стабильные органы клеток по визуализации сессии 48 ч, время, указанное в правом верхнем углу в часах. Масштабная линейка 25 мкм. МольбаSE нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Видео 1 Живая съемка разделения NG2 клеток в корковой культуры ломтик представитель промежуток времени-последовательность отображения нескольких клеточных делений в корковой культуры среза взяты из NG2cre:. Трансгенной мыши ZEG. Видео отображается со скоростью 5 кадров в секунду, монтаж изображений, показанных на рисунке 1. (См "Video_1.mov" под Загрузки)
Видео 2 Онлайн изображений олигодендроцитов в мозжечок срез культуры Представитель промежуток времени-последовательность, показывая небольшие изменения в олигодендроцитов морфологии (стрелка) изображаемого более 48 часов в мозжечке ломтик взятого с PLPDsRed трансгенной мыши. Видео отображается со скоростью 3 кадра в секунду, монтаж изображений, показанных на рисунке 3. (См "Video_2.mov" под Загрузки)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Миелинизация в центральной нервной системе имеет важное значение для эффективного нейронов и аксонов связи выживание 22. NG2 клетки непрерывно генерировать myelinating олигодендроцитов во взрослую жизнь, поддерживая постоянное население в большинстве областей мозга 16,23 - 25. Некоторые генетические и молекулярные механизмы, регулирующие дифференциацию этих клеток были описаны, но многое еще предстоит открыть. Органотипической культуры ломтик являются удобным инструментом для изучения этих механизмов благодаря своим уникальным характеристикам поддержание анатомических областей, легко манипулировать внеклеточной среде, надежный миелинизации, и присутствие всех основных типов клеток. Эти характеристики облегчить расследование короткие и долгосрочные взаимодействия между NG2 клеток, олигодендроцитов и аксонов 11,26. Кроме того, трансплантации клеток является относительно легким для выполнения и может быть использован, чтобы исследовать область-зависимой Differences в поведении клеток 17. Кроме того, фармакологические процедуры могут быть добавлены в культуральную среду, чтобы исследовать молекулярные механизмы, влияющие на пролиферацию и / или дифференцировку клеток NG2 в нормальном 17,27,28 и демиелинизированные культур 15,29. Наконец, это технически возможно использовать срез культур для выполнения экраны для высокопроизводительного анализа соединений, которые направляют NG2 клетки к пролиферации или дифференциации, возможно, даже после демиелинизирующего оскорбление 30.
Современные методы для расследования олигодендроцит клональные клетки и их взаимодействия с аксонов в условиях контролируемой культуры включают сокультурах с диссоциированном спинномозговых ганглиев (DRG) или эмбриональных нейронов коры и NG2 клеток 31,32, которые были основаны на оригинальных препаратов, разработанных для расследования DRG -Schwann межклеточных взаимодействий 33. Эти культуры были использованы для исследования фундаментальных свойств аксона и олигодендроцитовлиния клеток взаимодействий, включая активность нейронов в зависимости от сигналов, чтобы индуцировать дифференцировку и миелина добычу 32,34 - 36 в дополнение к другим вопросам, таким как зависимость диаметра аксона и плотности NG2 клеток контрольного пролиферации и начала дифференциации 37. В то время как эти сокультивирования системы являются идеальным решением для решения таких вопросов, прямой корреляции и заявление в в естественных условиях ситуации не всегда ясно. Как упоминалось ранее, органотипической культуры ломтик обеспечивают уникальное состояние поддержания многие из местных нейронных соединений и трехмерной цитоархитектуры, которые потеряли в совместной культуре препаратов диссоциированных клеток. Кроме того в отличие органотипических культур срез, со-культуры системы диссоциированных клеток часто не включают в себя другие глиальные клетки и внеклеточные молекулы матрикса, которые показали, чтобы играть ключевую роль в разработке, обслуживании и физиологии NG2 клеток олигодендроциты, И миелина. В связи с резким ростом в различных инструментов, доступных для конкретной маркировки и манипуляции отдельных клеточных популяций с вирусными векторами и трансгенных животных, долгосрочного изображений и отображения судьбы в органотипических культур срез должен оказаться мощным средством для исследования NG2 клетки пролиферации, дифференцировке и олигодендроцитов миелинизации.
Несколько важных шагов должно осуществляться при выполнении этих экспериментов, чтобы обеспечить выживание ломтик и воспроизводимость данных. Прежде всего, для того, чтобы генерировать здоровые ломтиками, секционирования и выделение кусочки должны быть выполнены так быстро, как это возможно, и в охлажденном льдом буфере вскрытия. Во-вторых, в то время как автоматизированная приобретение положение изображения с моторизованным этапе на флуоресцентного микроскопа может быть полезно, есть много факторов, которые могут нарушить точное перемещение регионах отображенных и ручной повторил приобретения необходимо получить последовательно надежные изображения более Умножитье дней. Это особенно необходимо, если ломтики хранятся в культуры клеток инкубатора между сессиями изображений, а не в стадии-топ-инкубатора. В-третьих, во время среза фиксации, окрашивания, и монтаж чрезвычайно важно для обработки срезов нежно, как любое нарушение ткани приведет к невозможности переместить жить вошедшие регионы и клетки. Там нет конкретных модификации традиционных методов, используемых для подготовки ломтик культуры, которые используются для исследования нейронов и астроцитов.
Есть несколько ограничений метода культуры среза, которые необходимо учитывать. Астроциты, микроглии и NG2 клетки, как известно, чтобы ответить на поражения ЦНС с повышенным распространением в месте повреждения и формирования глиальных шрам. Процесс подготовки ломтики результаты в некоторой реорганизации и первоначальный реактивной глиальных ответ от этих клеток. NG2 скорости пролиферации клеток возврата уровней, аналогичных тем, которые приведены в естественных условиях в течение соответствуетэтапы развития после нескольких дней в культуре однако возросшие скорости пролиферации и начальная реактивной фенотипа этих клеток необходимо учитывать при интерпретации данных. Наличие лошадиной сыворотки в культуральной среде может изменить пролиферацию NG2 клеток и следует учитывать при интерпретации результатов любого эксперимента. В дополнение к этому, в то время как есть спонтанное нейронную активность, сенсорный вход и длинные соединения диапазон между нейронами отсутствуют, что может привести к измененной активности нейронов в срезе. И, наконец, без использования специфического промотора приводом вирусных векторов или трансгенных мышей, типа конкретных клеточных генетических манипуляций в системах культуры срезов является сложной задачей. В то время как эти ограничения должны быть учтены при проектировании экспериментов, срез культуры являются уникальная система, которая может быть использована для получения новой понимание вопросов, которые не может быть решен с культурами диссоциированных клеток или в интактного животного.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slice Culture Medium | |||
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11090 | 50% |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175 | 25% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | 25mM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 1mM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 1mg/L |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 0.4mM |
| Horse Serum | Hyclone | SH30074.03 | 25% |
| Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius | |||
| Dissection Buffer | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 124mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.004mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | 1.25mM |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M7506 | 4.004mM |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 2mM |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | 26mM |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | 10mM |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 2.0mM |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | 0.075mM |
| Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use | |||
| Other Reagents and Supplies | |||
| 4-hydroxy tamoxifen (4OHT) | Sigma-Aldrich | H7904 | 100nM |
| Paraformaldehyde (PFA) | EM Sciences | 19200 | 4% |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L-6027 | 0.1M |
| Sodium Metaperiodate | Sigma-Aldrich | S-1878 | 0.01M |
| Rabbit anti NG2 antibody | Chemicon (Millipore) | AB5320 | 1:500 |
| Mouse anti CC1 antibody | Calbiochem (Millipore) | OP80 | 1:200 |
| Mouse anti Ki67 antibody | Vision Biosystems | NCL-Ki67-MM1 | 1:300 |
| Mouse anti NeuN antibody | Chemicon (Millipore) | MAB377 | 1:500 |
| Species specific secondary antibodies | Jackson Immunoresearch | ||
| Normal Goat Serum (NGS) | 5% | ||
| Triton X-100 | 0.10% | ||
| Mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size | Fisher Scientific | PICM03050 | |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Ethanol | |||
| 95% O2 5% CO2 gas mix | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| Sterile six well plates | |||
| Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas | |||
| Manual or automatic tissue chopper | |||
| Razor blades | |||
| Disposable transfer pipettes | |||
| 35mm and 60mm sterile Petri dishes | |||
| Stereomicroscope | |||
| Inverted Phase Microscope | |||
| Laminar Flow Hood | |||
| Tissue Culture Incubator | |||
| Inverted Fluorescence Microcope | |||
References
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), (1991).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures for long-term live imaging. Nature Protocols. 1 (3), 1165-1171 (2006).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Neuroscience. 7 (2), (2004).
- Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures. Journal of Visualized Experiments JoVE. (61), (2012).
- Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of Visualized Experiments JoVE. (6), e235 (2007).
- Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 10 (1), 9-22 (2009).
- Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
- Bin, J. M., Leong, S. Y., Bull, S. -J., Antel, J. P., Kennedy, T. E. Oligodendrocyte precursor cell transplantation into organotypic cerebellar shiverer slices: a model to study myelination and myelin maintenance. PloS one. 7 (7), (2012).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78 (2), 157-166 (2004).
- Harrer, M. D., von Budingen, H. C., et al. Live imaging of remyelination after antibody-mediated demyelination in an ex model for immune mediated CNS damage. Experimental Neurology. 216 (2), 431-438 (2009).
- Fancy, S. P. J., Harrington, E. P., et al. Axin2 as regulatory and therapeutic target in newborn brain injury and remyelination. Nature Neuroscience. 14 (8), 1009-1016 (2011).
- Zhu, X., Hill, R. A., Dietrich, D., Komitova, M., Suzuki, R., Nishiyama, A. Age-dependent fate and lineage restriction of single NG2 cells. Development. 138 (4), 745-753 (2011).
- Hill, R. A., Patel, K. D., Medved, J., Reiss, A. M., Nishiyama, A. NG2 Cells in White Matter But Not Gray Matter Proliferate in Response to PDGF. Journal of Neuroscience. 33 (36), 14558-14566 (2013).
- Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
- Novak, A., Guo, C., Yang, W., Nagy, A., Lobe, C. G. Z/EG, a double reporter mouse line that expresses enhanced green fluorescent protein upon Cre-mediated excision. Genesis. 28 (3-4), 147-155 (2000).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
- Hirrlinger, P. G., Scheller, A., et al. Expression of reef coral fluorescent proteins in the central nervous system of transgenic mice. Molecular and Cellular Neuroscience. 30 (3), 291-303 (2005).
- Nave, K. -A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Rivers, L. E., Young, K. M., et al. PDGFRA/NG2 glia generate myelinating oligodendrocytes and piriform projection neurons in adult mice. Nature Neuroscience. 11 (12), 1392-1401 (2008).
- Dimou, L., Simon, C., Kirchhoff, F., Takebayashi, H., Gotz, M. Progeny of Olig2-expressing progenitors in the gray and white matter of the adult mouse cerebral cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (41), 10434-10442 (2008).
- Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration. Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).
- Ioannidou, K., Anderson, K. I., Strachan, D., Edgar, J. M., Barnett, S. C. Time-lapse imaging of the dynamics of CNS glial-axonal interactions in vitro and ex vivo. PloS one. 7 (1), e30775 (2012).
- Ghoumari, A. M., Baulieu, E. E., Schumacher, M. Progesterone increases oligodendroglial cell proliferation in rat cerebellar slice cultures. Neuroscience. 135 (1), 47-58 (2005).
- Azim, K., Butt, A. M. GSK3β negatively regulates oligodendrocyte differentiation and myelination in vivo. Glia. 59 (4), 540-553 (2011).
- Hussain, R., El-Etr, M., et al. Progesterone and nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. 152 (10), 3820-3831 (2011).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Lubetzki, C., Demerens, C., et al. Even in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (14), 6820-6824 (1993).
- Demerens, C., Stankoff, B., et al. Induction of myelination in the central nervous system by electrical activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (18), 9887-9892 (1996).
- Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
- Stevens, B., Tanner, S., Fields, R. D. Control of myelination by specific patterns of neural impulses. The Journal of Neuroscience. 18 (22), 9303-9311 (1998).
- Stevens, B., Porta, S., Haak, L. L., Gallo, V., Fields, R. D. Adenosine: a neuron-glial transmitter promoting myelination in the CNS in response to action potentials. Neuron. 36 (5), 855-868 (2002).
- Wake, H., Lee, P. R., Fields, R. D. Control of local protein synthesis and initial events in myelination by action potentials. Science. 333 (6049), New York, N.Y 1647-1651 (2011).
- Rosenberg, S. S., Kelland, E. E., Tokar, E., De la Torre, A. R., Chan, J. R. The geometric and spatial constraints of the microenvironment induce oligodendrocyte differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14662-14667 (2008).
