Abstract
NG2表达细胞（polydendrocytes，少突胶质细胞前体细胞）的第四个主要的神经胶质细胞群在中枢神经系统。在胚胎和出生后发育，他们积极地繁殖，并产生髓鞘少突胶质细胞。这些细胞通常被研究的初级分离培养，共培养神经元，并在固定的组织。使用新的可用的转基因小鼠系切片培养系统可被用于研究细胞增殖少突胶质谱系细胞的分化中的前脑和小脑的灰质和白质的区域。切片培养物从出生后早期小鼠制备的，并保持在培养达1个月。这些片可以在培养期间被多次成像研究细胞行为和交互作用。这种方法允许NG2细胞分裂的可视化，并导致少突胶质细胞分化，同时支持的详细分析步骤区域依赖耳鼻喉科NG2细胞和少突胶质细胞功能的异质性。这是一个功能强大的技术，可用于研究在它十分相似， 在生物体内发现了一个蜂窝环境影响，这些细胞随着时间的内在和外在的信号。
Introduction
中枢神经系统Organoytpic切片文化已被证明是研究神经元和神经胶质细胞生物学的semiintact系统1非常有用- 4。这些文化都比较简单采用和保留主要的游离细胞培养的诸多好处，如操控外环境，并易于进行反复长期活细胞成像和电生理记录5 - 9。此外，切片培养维持3维组织细胞结构，区域神经连接性，并且最重要的细胞类型是存在于系统中。这些特性使得这些文化独特而方便的系统研究单个细胞的行为和生理与细胞和环境的相互作用。
NG2细胞为神经胶质细胞在哺乳动物中枢神经系统中的继续增殖和产生微米的人口胚胎和出生后发育过程中10 yelinating少突胶质细胞。它们已被广泛研究中解离的原代细胞培养，以及最近的转基因小鼠系与荧光蛋白的NG2细胞特异性表达的发展促进了体内命运映射和电生理记录在急性切片准备。即使有了这些研究，知之甚少的NG2细胞增殖和少突胶质细胞分化的时间动态。虽然分离的细胞培养物被广泛用于在药理学和遗传操作相对设施，它不适合用于询问这些细胞在不同脑区的功能上的差异特别是当它是需要维持细胞微环境的上下文。切片培养提供了一个简单的替代方案，是适合于药理学操作，并已被用于研究少突胶质细胞髓鞘形成11,12，细胞溶血卵磷脂（LPC），或通过药物治疗15抗体诱发的脱髓鞘13,14，和诱导髓鞘再生后ular响应。
的方法进行调查，并进行实时成像和固定的组织（或postfixation）中描述的NG2细胞增殖和少突胶质细胞分化来自前脑和后脑取器官切片文化分析。这是一个可用于研究单个NG2细胞的细胞命运的除法16后，并发现在生长因子诱导的NG2细胞增殖17与地区和年龄依赖性差异的有效方法。这种相对简单的技术是普及进一步研究细胞的内在和/或环境调节这些神经胶质细胞的生理机能，他们的反应神经元的活动或髓鞘损伤的机制。
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Protocol
注：所有动物的程序都遵循的指导方针，并已批准的机构动物照顾与使用委员会（IACUC）在康涅狄格大学。
注：对于这些实验组成NG2cre 18（JAX＃008533），并诱导NG2creER 16（JAX＃008538）的转基因小鼠杂交到Z / EG 19（JAX＃003920）或gtRosa26：YFP记者20（JAX＃006148）线分别使用到图像NG2细胞和它们的后代。图像成熟少突胶质细胞，PLPDsRed转基因小鼠21人使用。对于一致的存活率，切片可以从小鼠中分离到来自前脑和小脑出生后第10天。
1，切片准备
- 在培养罩，将在6孔板组织培养的插入和加入1 ml片培养基（配方中的试剂部分）。放置在细胞培养孵化器板在37℃下用5％的前夹层的CO 2的至少2个小时。
- 消毒所有工具和组织切碎，用70％的乙醇。
- 泡沫夹层缓冲液（配方中的试剂部）用95％O 2，5％CO 2在冰上至少15分钟清扫开始之前。
- 通过按照批准的动物协议将它们放在冰上5-10分钟麻醉小鼠的幼崽。通过确认该小鼠不向尾部和脚趾夹住响应确定麻醉的适当深度。
- 杀头使用下列动物的协议锋利的剪刀动物。首先使矢状切后外侧切口，用消毒工具快速去除颅骨比前脑和小脑。通过仔细轧制组织的侧切割从大脑和小脑的腹侧表面脑神经。
- 将组织中含有冰冷的氧化夹层缓冲无菌35mm培养皿。
- 使用刀片，切断小脑和前脑。然后做一个正中矢状切救援人员到场唉前脑和小脑，分离半球。
- 切断前脑和小脑的300微米厚的冠状面和矢状切面有手动组织菜刀。注意：A手册组织切碎机可以从解剖到培养孵育快速处理，而不需要琼脂糖嵌入。如前面9所述的vibratome也可以使用。
- 传输分离成片新鲜冒泡冷夹层缓冲冰上。
- 使用小型解剖或重铲分隔各个部分，转让给预孵育6孔板与文化的刀片。
- 使用一次性移液管或P 200枪头文化插入的表面去除多余的夹层缓冲。两到三个前脑或三个小脑切片可以被放置在一个培养插管。
注：对于脑的文化一致的结果，它是理想的取片横跨前三分之一的胼胝体（ 图1A），以便研究二者灰质和白质的区域在相同的切片。每只动物通常会产生6前脑片和6片小脑。 - 将6孔板中培养器并用1ml片介质1天后切片制备，然后每隔一天直到切片固定更换切片平台。
- 根据不同的实验中，使用后的5-7天中培养切片。只使用成为第几天后，透明片，丢弃那些有不均匀的不透明区域。注：片内的不透明区域是由眼可见的，显示为暗细胞在相差一丛。后的技术已经掌握了，死不透明片很少发生，在切片小于1-5％。
NG2细胞分裂和少突胶质细胞分化的2时间推移成像
注：要执行的NG2细胞的增殖和分化时间推移成像，我们使用NG2cre：ZEG鼠16这在NG2细胞及其后代（ 图1C-E）的表达绿色荧光蛋白。记者在这条线的表达是足够坚固的切片为至少四周的时间段之后立即获得GFP在切片的实时图像+细胞。最清晰的图像切片，这发生在文化第3-5天的初始变薄期后获得的。
- 整个实验过程中，保持在细胞培养恒温箱切片在37℃下，只为短暂的时间除去（每片小于15分钟），保持盖子上的6孔板中，同时影像。
- 用配有数码相机的倒置荧光显微镜，在使用10X物镜在第一时间点捕捉图像。注：第一次点将通过实验有所不同，可当准备切片或后一天的任何时间点。
- 在该片段的两种灰质和白质的区域捕获来自多个区域的图像，在时间点之一。注日Ë区域由片内特定地标和通过映射对可用于随后的成像会话的示意性的图像的位置进行成像。有用的地标可包括白质的切片和/或取向的边缘。图像七时五十六每个切片在每个时间点上的位置。
- 在4-6小时的间隔拍摄图像以后，如果检查NG2细胞分裂和少突胶质细胞分化，最好在5-7天。
- 捕获所有区域的最终图像，并立即修复片。加入1 ml固定液（4％PFA中，用0.1M L-赖氨酸的0.01M偏高碘酸钠）对培养插管的底部，然后在切片上添加另一个1毫升。请注意不要直接喷在固定液中的片上，因为它可以从膜分离。修复组织30分钟，并如第4描述进行使用发育阶段特异性标志物免疫组织化学。
- 洗涤切片用0.2M磷酸钠缓冲液3×10米英寸如有必要，存储之前在4℃下的切片在1-3天的0.2M磷酸钠缓冲液中的免疫染色，但最好在24小时内进行染色。用免疫组织化学进行的在第4如下所述来确定已分化为少突胶质细胞（ 图2D-F）的细胞的比例。
的NG2细胞的后代在切片培养的诱导记者转基因小鼠3命运映射
注意：要在培养一个特定的时间点跟踪NG2细胞的命运，诱导NG2creER：YFP的转基因小鼠可以使用。
- 诱导的Cre重组和报告基因的表达通过添加100nM的4OHT溶解于乙醇的培养基中。注：记者阳性细胞应该在〜20-25％的YFP + NG2 + / NG2 +细胞的诱导效率和在该时间点出现在1-2天内将全部细胞在NG2细胞阶段（ 图2A-C）的
- 修复和洗片在不同的时间分秒各种操作后（在章节2.5和2.6中描述）。
4，免疫组化切片
- 切断附着了用解剖刀刀片的切片的膜。
- 传送片来使用一套镊子的24孔磷酸含板缓冲盐水（PBS）的各个孔中，注意不要拿起膜时打乱片的组合物。
- 传送片以24孔板用封闭含5％正常山羊血清（NGS）和0.1％的Triton-X100的PBS中进行1小时的解决方案。
- 孵育切片的主要抗体的O / N的PBS中5％NGS在4℃。用于鉴定细胞中的NG2细胞阶段中，使用抗体来NG2和PDGFRα。为了识别有区别的少突胶质细胞，利用抗体对结肠腺瘤性结肠息肉病抗原（APC;克隆CC1）。
- 在PBS 3×15分钟第二天洗切片，然后在培养中学antibo模具在PBS中5％NGS 1小时，在室温。在PBS洗3×15分钟片和安装在载玻片上。安装用片和膜对着滑动，使该膜不会成为目标和组织之间。
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Representative Results
具有代表性的数据的例子如下已使用切片培养从P8 NG2cre两者的前脑和小脑获得：ZEG，NG2creER：YFP和PLPDsRed转基因小鼠品系。 NG2细胞可以被成像在中前脑和小脑切片（ 图1B-D视频1），并且这些细胞的表型天可以固定后进行测定，并与NG2和CC1的抗体（ 图1E）的免疫染色。除了 实时成像，细胞增殖，也可以用免疫组织化学染色对细胞增殖的标记物如Ki67表达（ 图1F）进行评估。这些数据允许NG2细胞分裂后，少突胶质细胞分化的时间动力学上的单个细胞基础详细分析。 YFP的小鼠（ 图2）：NG2细胞的命运映射可诱导CRE重组与4OHT在NG2creER切片后进行。 YFP记者表达NG2 +细胞FOUND中培养另外4OHT的培养基中（ 图2A）后两天。 4OHT诱导后6天后，YFP +细胞的比例已经分化为CC1 +少突胶质细胞（ 图2B）。这些数据表明在切片，其中胞外环境可以被操纵，以测试药剂或对NG2细胞的命运各种损伤的影响进行NG2细胞的命运映射的可行性。不同浓度4OHT的可以用来实现不同程度的CRE重组。例如，暴露于100nM的4OHT 2天，使报告基因的表达在所有NG2表达细胞的大约20-25％，而1μM4OHT导致约60-70％的复合效率。最后，大量的髓磷脂是存在于这些培养和髓鞘少突胶质细胞可在现场和固定片使用PLPDsRed转基因小鼠（ 图3，视频2）进行成像。
图1：切片培养方法的NG2细胞的增殖和分化（AB）示意图描绘前脑和小脑切片（A）和随后的培养和延时成像的隔离使用切片培养插入（二）长期成像（C ）刻画勾勒NG2细胞的分裂和随后的少突胶质细胞分化NG2cre：ZEG转基因小鼠（D）例如，从NG2cre的皮层区域采集的图像：ZEG小鼠表现出单一的GFP +细胞（箭头），过了一段122小时分两次，一次描绘在右上角作为成像实验开始后的小时（E）固定并用抗NG2与同一切片的CC1的抗体的免疫染色表明，在成像的dividi纳克细胞导致3 NG2 +细胞（箭头）（F）的实施例的图像显示两个的Ki67 + NG2 +细胞的皮质切片培养（G）的实施例的图像显示NG2 +细胞（箭头）和它们的过程中皮质交织在一起的NeuN +神经元的核片文化。比例尺为25μm ，请点击这里查看该图的放大版本。
图2：感应YFP的表达跟踪NG2细胞在脑切片文化（AB）摘自NG2creER脑切片培养的胼胝体区域图像的命运 ：与4OHT 2处理24小时，然后留在文化YFP小鼠天（A）或6天（B） YFP（A）或CC1和YFP（B）展示了记者阳性NG2细胞分化为少突胶质细胞，6天后在培养CRE重组（箭头）。比例尺为25μm ，请点击这里查看该图的放大版本。
图3：少突胶质细胞成像从PLPDsRed转基因小鼠切片文化。（一）示意图描绘了隔离，培养和PLPDsRed转基因小鼠小脑切片成像（B）图像的固定小脑切片后第5天在体外显示出钙结合蛋白+拍摄（青色），浦肯野神经元髓鞘髓鞘碱性蛋白+（MBP）（绿色）的轴突伸入片的白质区域。比例尺为25μm（C）来自同一区域拍摄的隔日在小时中从PLPDsRed小鼠小脑切片培养指定的时间低放大率图像。比例尺为100μm（D）从固定PLPDsRed切片培养出的白质区域，其中红色荧光+细胞都集中MBP的表达采取低倍率的图像。比例尺为100μm（E）从固定PLPDsRed切片培养出单一的红色荧光+少突胶质细胞与MBP +流程采取高放大倍率的图像。比例尺为20μm（F）从PLPDsRed小脑切片取定时序列示出在48小时的成像会话相对稳定的细胞体，在右上表示以小时为单位的时间。比例尺为25μm。 认罪SE点击这里查看该图的放大版本。
NG2细胞分裂的皮质切片培养1视频实时成像代表时间流逝序列显示了从NG2cre采取了皮质切片培养多种细胞分裂：ZEG转基因小鼠。视频显示以每秒5帧，在图1所示的图像的蒙太奇（请参阅“Video_1.mov”下载下）
视频2，现 场少突胶质细胞成像小脑切片文化代表时间流逝序列显示在少突胶质细胞形态（箭头）从PLPDsRed转基因小鼠采取了小脑片拍摄超过48个小时的微小变化。视频显示在每秒3帧， 如图3所示的图像拼接。（请参阅“Video_2.mov”下载下）
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Discussion
髓鞘在中枢神经系统是用于有效的神经元沟通和轴突存活22是必不可少的。 NG2细胞不断产生髓鞘少突胶质细胞到成年期，同时保持常住人口中大部分脑区16,23 - 25。调节这些细胞的分化一定的遗传和分子机制进行了描述，但仍有许多有待发现。器官切片培养物是一种方便的工具来调查这些机制，由于其独特的保持解剖区域，容易操纵的胞外环境中的，健壮的髓鞘形成，并且所有主要的细胞类型的存在的特征。这些特征促进NG2细胞，少突胶质细胞和轴突11,26之间短和长期的相互作用研究。此外，细胞移植是比较容易进行，并且可以用于研究区域依赖性ðifferences细胞的行为17。而且，药物治疗可以添加到培养基中，以探讨影响NG2细胞增殖和/或分化的正常17,27,28分子机制和脱髓鞘培养15,29。最后，它是用切片培养，以该指示NG2细胞甚至可能是后脱髓鞘损伤30的增殖或分化的化合物的高通量分析执行画面技术上是可行的。
目前的方法研究少突胶质细胞系细胞和它们之间的相互作用，在可控的文化背景轴突包括联合培养与分离的背根神经节（DRG）或胚胎皮层神经元和NG2细胞31,32，这是基于发展研究DRG原来准备-Schwann细胞相互作用33。这些培养物已被用于研究轴突和少突胶质细胞的基本性质谱系细胞的相互作用，包括神经元活性依赖的信号，诱导分化和髓鞘生产32,34 -除了其它问题36如轴突直径和NG2细胞密度控制增殖依赖性和分化37的发作。虽然这些共培养系统是理想的解决这些问题，直接关系并应用到体内情况并不总是很清楚。如前面提到的，器官切片培养物提供维持许多地方的神经元连接和三维细胞结构被丢在解离的细胞的共培养物制剂的独特条件。而且不像器官切片培养物，解离的细胞的共培养系统通常不包括其他神经胶质细胞和细胞外基质分子，其已显示在NG2细胞的发育，维持和生理学中发挥关键作用，少突胶质细胞和髓鞘。凭借在各种可用于特定的标签和操作不同的细胞群用病毒载体和转基因动物，长期的成像和器官切片文化的命运映射工具的急剧增长应该证明是一个强大的技术NG2细胞的研究增殖，分化和少突胶质细胞髓鞘形成。
进行这些试验时，以确保片存活和数据重现的几个关键步骤应进行。首先，为了产生健康的切片，切片和切片的隔离应迅速地进行尽可能并在冰冷的解剖缓冲器。其次，虽然自动图像采集位置上的荧光显微镜电动载物台可以是有用的，有很多因素会干扰成像和手动重复采集区域的精确搬迁是必要的，以获得稳定可靠的图像在含多处ê天。这是特别必要的，如果带被保持在成像会话之间，而不是在一个阶段顶培养箱细胞培养孵化器。第三，在切片固定，染色，并安装它是非常重要的处理的片轻轻地为组织的任何干扰将导致无法移居活成像区域和细胞。有没有具体的修改，以用于所使用的神经元和星形胶质细胞的研究切片文化传统制剂方法。
有几个限制是必须考虑的切片培养法。星形胶质细胞，小胶质细胞和NG2细胞是已知的和在损伤部位增加的增殖和神经胶质瘢痕的形成响应于中枢神经系统的损伤。制备切片的结果在某些重组，并从这些细胞中的初始反应性神经胶质反应的过程。 NG2细胞增殖率恢复到类似报道在体内的水平相匹配发展后的文化但是增加的增殖率和这些细胞的初始反应型数天阶段必须解释这些数据时，必须考虑。马血清的培养液中的存在可能会改变NG2细胞增殖和解释任何实验的结果时，应考虑。除了这一点，而那里是自发的神经元活动，感觉输入与神经元之间的远程连接，而不足时，这可能导致在片内改变的神经元活性。最后，没有切片培养系统中使用特定的启动子驱动的病毒载体或转基因小鼠中，细胞类型特异性基因操作的是具有挑战性的。而这些限制应当设计实验时，应考虑，切片培养物是一种独特的系统，该系统可以被用来获得新的洞察到，不能用离解的细胞培养物，或在完整的动物回答问题。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slice Culture Medium | |||
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11090 | 50% |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175 | 25% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | 25mM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 1mM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 1mg/L |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 0.4mM |
| Horse Serum | Hyclone | SH30074.03 | 25% |
| Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius | |||
| Dissection Buffer | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 124mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.004mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | 1.25mM |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M7506 | 4.004mM |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 2mM |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | 26mM |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | 10mM |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 2.0mM |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | 0.075mM |
| Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use | |||
| Other Reagents and Supplies | |||
| 4-hydroxy tamoxifen (4OHT) | Sigma-Aldrich | H7904 | 100nM |
| Paraformaldehyde (PFA) | EM Sciences | 19200 | 4% |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L-6027 | 0.1M |
| Sodium Metaperiodate | Sigma-Aldrich | S-1878 | 0.01M |
| Rabbit anti NG2 antibody | Chemicon (Millipore) | AB5320 | 1:500 |
| Mouse anti CC1 antibody | Calbiochem (Millipore) | OP80 | 1:200 |
| Mouse anti Ki67 antibody | Vision Biosystems | NCL-Ki67-MM1 | 1:300 |
| Mouse anti NeuN antibody | Chemicon (Millipore) | MAB377 | 1:500 |
| Species specific secondary antibodies | Jackson Immunoresearch | ||
| Normal Goat Serum (NGS) | 5% | ||
| Triton X-100 | 0.10% | ||
| Mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size | Fisher Scientific | PICM03050 | |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Ethanol | |||
| 95% O2 5% CO2 gas mix | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| Sterile six well plates | |||
| Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas | |||
| Manual or automatic tissue chopper | |||
| Razor blades | |||
| Disposable transfer pipettes | |||
| 35mm and 60mm sterile Petri dishes | |||
| Stereomicroscope | |||
| Inverted Phase Microscope | |||
| Laminar Flow Hood | |||
| Tissue Culture Incubator | |||
| Inverted Fluorescence Microcope | |||
References
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