Abstract
NG2を発現する細胞（polydendrocytes、オリゴデンドロサイト前駆細胞）は、中枢神経系における第四の主要なグリア細胞集団である。胚および生後発育の間、彼らは積極的に増殖し、ミエリンオリゴデンドロサイトを生成します。これらの細胞は、一般的に、一次解離し文化、ニューロン共培養において、および固定された組織で研究されてきた。新たに利用可能なトランスジェニックマウス系統は、培養系をスライス使用すると、前脳および小脳の両方の灰白質と白質領域においてオリゴデンドロサイト系譜細胞の増殖および分化を調査するために使用することができる。スライス培養は、生後初期のマウスから調製され、最大1ヶ月間培養物中で維持される。これらのスライスは、細胞の挙動および相互作用を調査するために、培養期間にわたって複数回撮像することができる。この方法は、NG2細胞分裂の可視化との詳細な分析を可能にしながら、オリゴデンドロサイト分化を導くステップ地域に依存可能にするカミカゼNG2細胞とオリゴデンドロサイトの機能異質。これは、密接にインビボで見出さことに似ている細胞環境において経時的にこれらの細胞に影響を与える内因性および外因性のシグナルを調査するために使用することができる強力な技術である。
Introduction
4 -中枢神経系のOrganoytpicスライス培養はsemiintactシステム1において、ニューロンおよびグリア細胞生物学を研究するために極めて有用であることが証明されている。 9 -これらの培養物を採用し、そのような細胞外環境の操作を繰り返し、長期生細胞イメージングのための容易なアクセスおよび電気生理学的記録5と、一次解離細胞培養の多くの利点を保持することは比較的簡単である。また、スライス培養は、3次元組織細胞構築、地域の神経接続を維持し、ほとんどの主要な細胞型がシステムに存在している。これらの特性は、これらの培養ユニークで便利なシステムは、セルラーと環境の相互作用を持つ単一細胞の挙動や生理学を調査することにします。
NG2細胞は増殖およびmを生成し続ける、哺乳動物の中枢神経系におけるグリア細胞の集団である胚および生後発育10の間にオリゴデンドロサイトをyelinating。それらは、広範囲に解離した初代細胞培養物において研究されており、蛍光タンパク質のNG2細胞特異的発現を有するトランスジェニックマウス系統の最近の開発は、急性スライス標本におけるインビボでの運命マッピングおよび電気生理学的記録に容易になった。でも、これらの研究で、少しはNG2細胞の増殖およびオリゴデンドロサイト分化の時間的なダイナミクスについてはほとんど知られていない。解離した細胞培養が広く薬理学的および遺伝的操作の相対的機能のために使用されるが、それは細胞の微小環境のコンテキストを維持することが望ましい場合に特に異なる脳領域におけるこれらの細胞の機能的な違いを問い合わせるには適していない。スライス培養は、細胞の薬理学的操作に適しているとオリゴデンドロサイトミエリン形成11,12を調査するために使用されている単純な代替物を提供する（LPC）をリゾレシチンまたは抗体誘発性脱髄13,14、および薬理学的治療15を介して再ミエリンの誘導後ウラル応答。
前脳および小脳の両方から採取した器官型スライス培養におけるNG2細胞増殖およびオリゴデンドロサイト分化の分析をライブイメージングし、固定組織（または後固定）を調査し、実行するための方法が記載されている。これは、分割後に単16 NG2細胞の細胞運命を研究するために、成長因子誘導されるNG2細胞増殖の17地域および年齢依存性の違いを発見するために使用できる強力な方法である。この比較的単純な技術はさらに、これらのグリア細胞の生理学および神経活動またはミエリン損傷への応答を調節する細胞内因性および/または環境のメカニズムを調査する、広くアクセス可能です。
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Protocol
注：すべての動物の手順は、ガイドラインに従っているとコネチカット大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されている。
注：それぞれ用いたYFPレポーター20（JAX＃006148）ライン：これらの実験のために、構成NG2cre 18（JAX番号008533）および誘導性NG2creER 16（JAX番号008538）トランスジェニックマウスは、Z / EG 19（JAX＃003920）またはgtRosa26交配画像NG2細胞とその子孫。画像成熟したオリゴデンドロサイトには、21を使用したトランスジェニックマウスをPLPDsRed。一貫性の生存のために、スライスは、アップ前脳と小脳の両方から生後10日目にマウスから単離することができる。
1スライスの準備
- 培養フード中で、6ウェルプレート中で組織培養インサートを配置し、1mlのスライス培養培地（試薬セクションのレシピ）を加える。解剖の前に、5％CO 2を少なくとも2時間、37℃で細胞培養インキュベーターでプレートを置きます。
- 70％エタノールですべてのツールと組織チョッパーを滅菌する。
- 解剖の前の開始に少なくとも15分間、氷上で95％O 2、5％CO 2をバブル解剖バッファー（試薬セクションのレシピ）。
- 承認された動物プロトコールに従って5〜10分間氷上に置くことにより仔マウスを麻酔。マウスは尾とつま先のピンチに応答しないことを確認することにより麻酔の適切な深さを確かめる。
- 動物プロトコールに従って鋭いハサミを使って動物を首を切る。すぐに滅菌ツールを使用して、第一横切開に続いて矢状カットを行うことで、前脳および小脳の上の頭蓋骨を削除します。慎重に側に組織を圧延することにより、脳と小脳の腹側表面から脳神経をカットします。
- 氷のように冷たい酸素添加解剖バッファーを含む滅菌35mmの皿に組織を置きます。
- カミソリの刃を使用して、小脳および前脳を切断。その後半ば矢状カットのthroを作る前脳および小脳ぐふ、半球を分離する。
- 手動の組織チョッパーで前脳と小脳の300μmの厚さの冠状および矢状断面をカットします。注：手動の組織チョッパーをアガロース包埋を必要とせずに培養インキュベーション解剖からの迅速な処理を可能にする。以前に説明したように9ビブラトームを使用することもできる。
- 氷の上に新鮮に泡立て冷たい解剖バッファーに分けスライスを転送します。
- 各部を分離し、培養インサートで6ウェル皿をプレインキュベートするためにそれらを転送するために、小さな解剖や計量へらを使用してください。
- 使い捨てトランスファーピペットまたはP 200ピペットチップを用いて培養インサートの表面から余分な解剖バッファを削除します。 2〜3前脳または三小脳スライスが1つの培養インサート上に配置することができる。
注：前脳文化と一貫性のある結果のためには、脳梁の前三分の一にまたがるスライスを取ることが理想的である（ 図1A）は、同じスライス内の両方の灰白質と白質の領域を研究するためである。各動物は、通常6前脳スライスと6小脳スライスが得られます。 - インキュベーター中で6ウェルプレートを置き、スライス固定されるまで一日おきに、次にスライス標本後にスライス培地1ml 1日とスライス培地を交換し。
- 実験によっては、培養中の5-7日後にスライスを使用。最初の数日後に透明になるだけのスライスを使用し、不均一な不透明領域を有するものを捨てる。注：スライス内の不透明な領域は、目で表示され、位相差の下で暗い細胞の塊として表示されます。技術が習得された後、死んで不透明なスライスはスライス未満の1〜5％で、めったに起こらない。
2 NG2細胞分裂のタイムラプスイメージングおよびオリゴデンドロサイト分化
注：私たちはNG2creを使用NG2細胞の増殖および分化のタイムラプスイメージングを実行するには：ZEGマウス16NG2細胞およびそれらの子孫（ 図1C-E）でEGFPを発現する。この行のレポーター発現は、直ちに少なくとも4週間の期間にセクショニングの後のスライスでGFP +細胞のライブ画像を得るために十分に堅牢である。鮮明な画像を、培養の最初の3〜5日間で発生したスライスの初期間伐期間後に得られる。
- 実験の間、37℃で細胞培養インキュベーター内のスライスを維持し、時間の短い期間だけ除去（スライスあたり15分未満）、6ウェルプレートに蓋をしながら撮影を維持する。
- デジタルカメラを備えた倒立蛍光顕微鏡を用いて、10×対物レンズを用いて第1の時点の画像を取り込む。注記：ファーストタイムポイントは、実験によって異なりますし、後の切片を調製した日またはどの時点であってもよい。
- スライスの両方グレーと白質領域に時点1での複数の領域から画像をキャプチャします。目に注意してくださいE領域は、スライス内の特定のランドマークによって、後続のイメージングセッションのために使用することができ、回路図に画像の位置をマッピングすることによって画像化した。有用なランドマークは白質路のスライスおよび/または方向のエッジを含むことができる。画像各時点における各スライス上の四から八箇所。
- NG2細胞の分裂とオリゴデンドロサイト分化を調べる場合には、理想的には上の5-7日、4〜6時間の間隔で次の画像をキャプチャします。
- すべての地域の最終的な画像をキャプチャし、すぐにスライスを修正します。その後のスライスの上に別の1ミリリットルを追加し、カルチャーインサートの底まで（0.1M L-リジン0.01Mのメタ過ヨウ素酸ナトリウムを用いて4％PFA）固定液1ミリリットルを加える。それが膜から切り離すことができますように、スライスの上に直接固定液を噴出しないように注意してください。 30分間、組織を固定し、4章で説明したように発達段階特異的マーカーを用いた免疫組織化学を進める。
- 0.2 Mリン酸ナトリウム緩衝液3×10 mを有する洗浄スライスインチ1-3日間、0.2 Mリン酸ナトリウム緩衝液中に4℃で必要に応じて、店舗のスライス24時間以内に染色を行う理想的に免疫染色が、前に。 4章で後述のように、オリゴデンドロサイト（ 図2D-F）に分化した細胞の割合を決定するために、免疫組織化学を続行します。
スライス培養で誘導レポータートランスジェニックマウスを使用したNG2細胞子孫の3運命のマッピング
注：培養物中の特定の時点からNG2細胞の運命を追跡するために、誘導性NG2creER：YFPトランスジェニックマウスを使用することができる。
- 培養培地に、エタノールに溶解した100nMの4OHTを追加することによって、Cre組換えおよびレポーター発現を誘導する。注：レポーター陽性細胞は〜20〜25％YFP + NG2 + / NG2 +細胞の誘導効率で1〜2日以内に表示されますと、この時点ですべてのNG2細胞段階における細胞（ 図2A〜C）になります
- スライスを修正し、洗う異なる時点での、さまざまな操作をした後に（セクション2.5および2.6に記載されている）。
4。スライス免疫組織化学
- メスを用いて、インサートの外に取り付けられたスライスを有する膜をカット。
- 膜をピックアップする際のスライスの組成を破壊しないように注意しながら、ピンセットのセットを用いてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含有する24ウェルプレートの各ウェルにスライスを転送する。
- 1時間PBS中の5％正常ヤギ血清（NGS）および0.1％トリトン-X100を含有するブロッキング溶液で24ウェルプレートにスライスを転送する。
- 4℃で、PBS中の5％NGS中の一次抗体でO / N内のスライスをインキュベートする。 NG2細胞段階における細胞を同定するために、NG2およびPDGFRαに対する抗体を使用しています。分化したオリゴデンドロサイトを識別するための、大腸腺腫性ポリポーシス抗原に対する抗体を使用する（APC;クローンCC1）を。
- PBS 3×15分で二日目の洗浄スライス上で、その後二次antiboでインキュベート室温で1時間、PBS中の5％NGSで死ぬ。 PBS 3×15分でスライスを洗浄し、スライド上にマウントします。膜は客観的かつ組織との間にされないようにスライドが直面しているスライスアップと膜とのマウント。
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Representative Results
ZEG、NG2creER：YFP及びPLPDsRedトランスジェニックマウス系統の代表的なデータの例は、P8 NG2creの前脳および小脳の両方からスライス培養を用いて得られたその下に示す。 NG2細胞は、前脳および小脳切片における日間（ 図1B-D、ビデオ1）の上に画像化することができ、これらの細胞の表現型は、固定およびNG2およびCC1抗体による免疫染色（ 図1E）後に決定することができる。リアルタイム画像に加えて、細胞増殖はまた、Ki67に（ 図1F）のような細胞増殖マーカーについて免疫組織化学的染色を用いて評価することができる。これらのデータは、個別のセル単位でNG2の細胞分裂後のオリゴデンドロサイト分化の時間的な動力学の詳細な分析を可能にする。 YFPマウス（ 図2）：NG2細胞の運命マッピングはNG2creERで4OHTでスライスにおけるCre組換えの誘導後に行うことができる。 YFPレポーター発現NG2 +の細胞は、foをした二日間の培養培地（ 図2A）に4OHTの添加後培養においてウント。六日の4OHT誘導後、YFP +細胞の割合はCC1 +オリゴデンドロサイト（ 図2B）に分化した。これらのデータは、細胞外環境は、薬理学的薬剤またはNG2細胞の運命に対するさまざまな傷害の効果を試験するために操作することができるスライスNG2細胞の運命マッピングを実行する可能性を示している。 4OHTの異なる濃度のcre組換えの異なる程度を達成することができる。 1μM4OHTが約60〜70％の再結合効率が低下している間たとえば、2日間で100 nMの4OHTへの暴露は、すべてNG2発現細胞の約20〜25％でレポーター発現の原因となる。最後に、広範なミエリンは、これらの培養物中に存在し、オリゴデンドロサイトミエリンPLPDsRedトランスジェニックマウス（ 図3、ビデオ2）を用いて、ライブ·固定スライスで撮像することができる。
図前脳および小脳切片（A）およびその後の培養およびスライス培養インサートを用いてタイムラプスイメージング（B）の単離を示すNG2細胞の増殖および分化の長期イメージング（AB）図用1スライス培養方法。（C ）NG2creにNG2細胞の分裂およびその後のオリゴデンドロサイト分化の概要を描写：皮質NG2creの領域から取得したZEGトランスジェニックマウス（D）の例画像：122時間かけ倍割る単一GFP +細胞（矢印）を示すZEGマウスは、時間が示されて抗NG2と同一スライスのCC1抗体による免疫染色（E）固定。イメージング実験開始後時間などの右上隅にあると明らかにし、その画像形成されたdividingの細胞を3 NG2 +細胞（矢印）が得られた。（F）の例の画像二つのKi67を示す+ NG2 +皮質内のNeuN +ニューロン核絡み合っ皮質スライス培養中の細胞（G）の例を示す画像NG2 +細胞（矢印）とそのプロセススライス培養。スケールバーは25μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
YFPの発現図2。誘導は前脳スライス培養におけるNG2細胞（AB）NG2creERから前脳スライス培養の脳梁領域から撮影した画像の運命を追跡する ：2培養で24時間4OHTで処理した後、左YFPマウス日間（A）又は6日間（B） YFP（A）またはCC1とYFP（B）のために免疫染色した。スケールバーは25μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
+カルビンジンを示すin vitroで 5日後に固定された小脳切片から取った図PLPDsRedトランスジェニックマウスからのスライス培養における3イメージングオリゴデンドロサイト。（A）図、アイソレーションを描い培養し、PLPDsRedトランスジェニックマウスの小脳スライスのイメージング。（B）画像（髄シアン）プルキンエニューロンスライスの白質領域内に突出するミエリン塩基性タンパク質+（MBP）（緑）軸索。スケールバーは25μm。PLPDsRedマウスから小脳スライス培養における時間で示された時間に一日おきに同じ領域からキャプチャ（C）低倍率画像。のDsRed +細胞が集中する白質領域中のMBP発現を示す固定PLPDsRedスライス培養から採取されたスケールバーは100μm。（D）低倍率画像。 MBP +プロセスと単一のDsRed +オリゴデンドロサイトを示す固定PLPDsRedスライス培養から採取されたスケールバーは100μm。（E）高倍率画像。スケールバーは20μm。48時間撮像セッションにわたって比較的安定した細胞体を示すPLPDsRed小脳スライスから撮影（F）タイムラプスシーケンス、時間右上に示された時間。スケールバーは25μm。 嘆願SEはこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
皮質スライス培養におけるNG2細胞分裂のビデオ1。ライブイメージング NG2creから取ら皮質スライス培養における複数の細胞分裂を示す代表的な時間経過系列：ZEGトランスジェニックマウスを。ビデオは、毎秒5フレーム、 図1に示されている画像のモンタージュで表示されます。（ダウンロードの下に「Video_1.mov」を参照してください）
ビデオ小脳スライス培養におけるオリゴデンドロサイトの2。ライブイメージング PLPDsRedトランスジェニックマウスから採取された小脳スライスで48時間かけて撮像されたオリゴデンドロサイトの形態（矢印）の小さな変化を示す代表的な時間経過の系列。ビデオは、毎秒3コマ、 図3に示す画像のモンタージュで表示されます。（ダウンロードの下に「Video_2.mov」を参照してください）
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Discussion
中枢神経系の髄鞘形成は、効率的な神経細胞のコミュニケーションと軸索の生存22に不可欠である。 25 -ほとんどの脳領域16,23における居住人口を維持しながら、NG2細胞は、継続的に大人になってミエリンオリゴデンドロサイトを生成します。これらの細胞の分化を調節するいくつかの遺伝的および分子メカニズムを説明してきたが、多くは発見されていない。器官型スライス培養は、これらの解剖学的領域を維持することの彼らのユニークな特性のためのメカニズム、細胞外環境の容易な操作、堅牢髄鞘、すべての主要な細胞型の存在を調査するための便利なツールです。これらの特性は、NG2細胞、オリゴデンドロサイトおよび軸索11,26間の短期および長期的な相互作用の研究を促進する。さらに、細胞移植は、実行するのが比較的容易であり、領域依存dは調査するために使用することができ細胞の挙動17にifferences。さらに、薬理学的治療は、正常17,27,28にNG2細胞の増殖および/ または分化に影響する分子機構および脱髄培養物15,29を調査するために培養培地に添加することができる。最後に、それも脱髄傷害後30おそらく、増殖または分化するNG2細胞を導く化合物のハイスループット分析のためのスクリーニングを行うためにスライス培養を使用することが技術的に可能である。
現在の方法は、オリゴデンドロサイト系譜細胞を調査するために、制御さカルチャ設定での軸索との相互作用は、解離した後根神経節（DRG）またはDRGを調査するために開発したオリジナルの準備に基づいていた胚性皮質ニューロンおよびNG2細胞31,32、との共培養物を含む-Schwannセル33を相互対話。これらの培養物を軸索とオリゴデンドロサイトの基本特性を調べるために使用されてきたそのような軸索 直径およびNG2細胞密度制御増殖の依存性と分化37の発症など、他の質問に加えて、36 -分化およびミエリン生産32,34を誘導する神経活動依存性のシグナル伝達を含む系細胞の相互作用。これらの共培養システムは、そのような問題に対処するために理想的であるが、in vivoの状況に直接的な相関関係、アプリケーションは必ずしも明確ではない。前述のように、器官型切片培養物は、局所神経結合及び解離した細胞の共培養調製物中に失われた三次元細胞構築の多くを維持するユニークな条件を提供する。さらに、器官型スライス培養とは異なり、解離細胞の共培養システムは、しばしば、他のグリア細胞およびNG2細胞の発達、維持及び生理学において重要な役割を果たすことが示されている細胞外マトリックス分子、オリゴデンドロサイトを含んでいない、およびミエリン。ウイルスベクターおよびトランスジェニック動物との別個の細胞集団の特異的標識および操作のための利用可能なさまざまなツールの劇的な増加に伴い、器官型スライス培養の長期的なイメージングと運命マッピングはNG2細胞の調査のための強力な技術であることを証明する必要があります増殖、分化、およびオリゴデンドロサイトミエリン形成。
スライスの生存とデータ再現性を確実にするために、これらの実験を行う際に、いくつかの重要なステップが実施されるべきである。まず、健康なスライスを生成するために切片化し、切片の単離は可能な限り迅速かつ氷冷解剖バッファのように行われるべきである。蛍光顕微鏡での電動ステージによる自動化された画像位置取得が便利ですしながら第二に、画像形成された領域とマニュアル繰り返さ買収の正確な再配置を崩壊させることができる多くの要因がありますmultiplにわたって一貫して信頼性の高い画像を得ることが必要である電子時代。スライスは、撮像セッションの間ではなく、ステージトップインキュベーター内で細胞培養インキュベーター内に保持されている場合、これは特に必要である。第三に、スライス固定、染色、および実装時に、それは組織の中断がライブ画像形成された領域および細胞を再配置することができないことになりますようにそっとスライスを処理するために極めて重要である。ニューロンとアストロサイトの研究のために使用されているスライス培養標本のために使用される従来の方法としては、特に修正はありません。
考慮しなければならないスライス培養法にはいくつかの制限がある。アストロサイト、ミクログリアおよびNG2細胞が増加した損傷部位で増殖およびグリア性瘢痕の形成とCNS損傷に応答することが知られている。いくつかの再編成およびこれらの細胞からの初期の反応性グリア応じてスライス結果を調製する方法。 NG2細胞増殖率が一致したためにインビボで報告されたものと同様のレベルに戻るデータを解釈する際、培養中の数日後に、開発の段階では、しかし、増殖の増加率とこれらの細胞の初期反応性表現型が考慮されなければならない。培養培地中のウマ血清の存在は、NG2細胞の増殖を変化させることができ、任意の実験の結果を解釈する際に考慮されるべきである。これに加えて、スライス内の改変された神経活動につながる可能性が自発的な神経活動、感覚入力とニューロン間の長距離接続が不足しているが、そこにある間。最後に、スライス培養系内の特異的プロモーター駆動型ウイルスベクターまたはトランスジェニックマウス、細胞型特異的遺伝子操作を使用せずに困難である。これらの制限は、実験を設計する際に考慮されるべきであるが、スライス培養は、解離細胞培養物と又は無傷動物において答えることができない質問に新たな洞察を得るために利用することができるユニークなシステムです。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slice Culture Medium | |||
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11090 | 50% |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175 | 25% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | 25mM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 1mM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 1mg/L |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 0.4mM |
| Horse Serum | Hyclone | SH30074.03 | 25% |
| Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius | |||
| Dissection Buffer | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 124mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.004mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | 1.25mM |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M7506 | 4.004mM |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 2mM |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | 26mM |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | 10mM |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 2.0mM |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | 0.075mM |
| Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use | |||
| Other Reagents and Supplies | |||
| 4-hydroxy tamoxifen (4OHT) | Sigma-Aldrich | H7904 | 100nM |
| Paraformaldehyde (PFA) | EM Sciences | 19200 | 4% |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L-6027 | 0.1M |
| Sodium Metaperiodate | Sigma-Aldrich | S-1878 | 0.01M |
| Rabbit anti NG2 antibody | Chemicon (Millipore) | AB5320 | 1:500 |
| Mouse anti CC1 antibody | Calbiochem (Millipore) | OP80 | 1:200 |
| Mouse anti Ki67 antibody | Vision Biosystems | NCL-Ki67-MM1 | 1:300 |
| Mouse anti NeuN antibody | Chemicon (Millipore) | MAB377 | 1:500 |
| Species specific secondary antibodies | Jackson Immunoresearch | ||
| Normal Goat Serum (NGS) | 5% | ||
| Triton X-100 | 0.10% | ||
| Mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size | Fisher Scientific | PICM03050 | |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Ethanol | |||
| 95% O2 5% CO2 gas mix | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| Sterile six well plates | |||
| Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas | |||
| Manual or automatic tissue chopper | |||
| Razor blades | |||
| Disposable transfer pipettes | |||
| 35mm and 60mm sterile Petri dishes | |||
| Stereomicroscope | |||
| Inverted Phase Microscope | |||
| Laminar Flow Hood | |||
| Tissue Culture Incubator | |||
| Inverted Fluorescence Microcope | |||
References
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