Abstract
Les cellules exprimant NG2 (polydendrocytes, les cellules précurseurs d'oligodendrocytes) sont la quatrième grande population de cellules gliales dans le système nerveux central. Au cours du développement embryonnaire et postnatal elles prolifèrent activement et génèrent oligodendrocytes myélinisantes. Ces cellules ont souvent été étudiés dans des cultures primaires dissociées, co-cultures de neurones, et dans le tissu fixe. Utilisation de lignées de souris transgéniques nouvellement disponibles tranche systèmes de culture peuvent être utilisés pour étudier la prolifération et la différenciation des cellules de la lignée des oligodendrocytes dans les deux régions de la matière grise et blanche du cerveau et le cervelet. Cultures tranches sont préparées à partir de souris postnatales et sont maintenues en culture pendant 1 mois. Ces rondelles peuvent être imagées à plusieurs reprises au cours de la période de culture cellulaire pour étudier le comportement et les interactions. Cette méthode permet la visualisation de la division cellulaire NG2 et les étapes menant à la différenciation des oligodendrocytes, tout en permettant une analyse détaillée de région dépendent cellules oligodendrocytes et NG2 hétérogénéité fonctionnelle. Ceci est une technique puissante qui peut être utilisé pour étudier les signaux intrinsèques et extrinsèques qui influent sur ces cellules au cours du temps dans un environnement cellulaire qui ressemble étroitement à celle trouvée in vivo.
Introduction
Cultures tranche Organoytpic du système nerveux central se sont avérées extrêmement utiles pour l'étude de la biologie des neurones et des cellules gliales dans un système semiintact: 1 - 4. Ces cultures sont relativement simples à adopter et à conserver de nombreux avantages des cultures de cellules dissociées primaires telles que la manipulation de l'environnement extracellulaire et un accès facile pour l'imagerie des cellules vivantes à long terme répétées et des enregistrements électrophysiologiques 5 - 9. En outre, des cultures de tranches de tissu cytoarchitecture maintenir en 3 dimensions, la connectivité neuronale régionale, et la plupart des types cellulaires majeurs sont présents dans le système. Ces propriétés font de ces cultures un système unique et pratique pour étudier le comportement de cellules individuelles et de la physiologie des interactions cellulaires et environnementaux.
NG2 cellules sont une population de cellules gliales dans le système nerveux central des mammifères, qui continuent à proliférer et à produire myelinating oligodendrocytes pendant le développement embryonnaire et postnatal 10. Ils ont été largement étudiés dans des cultures primaires de cellules dissociées, et le développement récent des lignées de souris transgéniques avec expression spécifique des cellules NG2 des protéines fluorescentes a facilité la cartographie du destin in vivo et des enregistrements électrophysiologiques dans des préparations de tranches aiguës. Même avec ces études, on sait peu sur la dynamique temporelle de NG2 la prolifération cellulaire et la différenciation des oligodendrocytes. Bien que la culture de cellules dissociées est largement utilisé pour l'installation par rapport à des manipulations pharmacologiques et génétiques, il n'est pas adapté pour interroger les différences fonctionnelles de ces cellules dans les différentes régions du cerveau en particulier quand il est souhaitable de maintenir le cadre de la micro-cellulaire. Cultures Slice offrent une alternative simple qui se prête à des manipulations pharmacologiques et ont été utilisées pour étudier la myélinisation des oligodendrocytes 11,12, celluleréponse parti- après lysolécithine (LPC) ou anticorps induit une démyélinisation 13,14, et l'induction de la remyélinisation par un traitement pharmacologique 15.
Une méthode pour enquêter et effectuer l'imagerie en direct et les tissus fixés (ou postfixation) analyse de NG2 la prolifération cellulaire et la différenciation des oligodendrocytes dans les cultures organotypique prises de fois le cerveau et le cervelet est décrit. Il s'agit d'une méthode puissante qui peut être utilisé pour étudier le sort cellulaire des cellules NG2 simples après la division 16 et de découvrir la région et la différence d'âge-dépendante du facteur de croissance induit la prolifération des cellules NG2 17. Cette technique relativement simple est largement accessible à approfondir cellule intrinsèque et / ou l'environnement mécanismes de régulation de la physiologie de ces cellules gliales et leur réponse à l'activité neuronale ou lésions de la myéline.
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Protocol
NOTE: Toutes les procédures d'animaux suivent les directives et ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'Université du Connecticut.
NOTE: Pour ces expériences constitutifs NG2cre 18 (JAX # 008533) et inductibles NG2creER 16 (JAX # 008538) de souris transgéniques a traversé à Z / EG 19 (JAX # 003920) ou gtRosa26: YFP reporter 20 (JAX # 006148) lignes respectivement ont été utilisés à l'image des cellules NG2 et de leur progéniture. Pour l'image oligodendrocytes matures, PLPDsRed souris transgéniques 21 ont été utilisés. Pour la survie compatibles, les tranches peuvent être isolés à partir de souris jusqu'à 10 jours après la naissance à la fois du cerveau et le cervelet.
1 tranche Préparation
- Dans une hotte de culture, de placer des inserts de culture de tissu à six plaques à puits et ajouter 1 ml de milieu de culture de la tranche (recette dans la section des réactifs). Placer les plaques dans l'incubateur de culture cellulaire à 37 ° C avec 5% de CO 2 d'au moins 2 heures avant la dissection.
- Stériliser tous les outils et broyeur de tissus avec 70% d'éthanol.
- tampon de bulle de dissection (recette dans la section des réactifs) avec 95% O 2, 5% de CO 2 sur la glace pendant au moins 15 min avant le début de la dissection.
- Anesthésier souriceaux en les plaçant sur de la glace pendant 5-10 min selon des protocoles approuvés animaux. Déterminer la profondeur de l'anesthésie appropriée en confirmant que les souris ne répondent pas à la queue et pieds pincement.
- Décapiter les animaux à l'aide de ciseaux pointus, suivant des protocoles d'animaux. Enlever rapidement le crâne sur le cerveau et le cervelet en faisant d'abord une coupe sagittale suivie par incision latérale, en utilisant des outils stérilisés. Couper les nerfs crâniens de la surface ventrale du cerveau et du cervelet avec soin par laminage du tissu sur le côté.
- Passer tissu stérile dans une boîte de 35 mm contenant du tampon oxygéné de dissection glacée.
- En utilisant une lame de rasoir, couper le cervelet et le cerveau antérieur. Ensuite, faire une coupe mi-sagittal thropouah le cerveau et le cervelet, la séparation des hémisphères.
- Coupez les 300 coupes coronales et sagittales um d'épaisseur du cerveau et du cervelet avec un hachoir manuel de tissu. REMARQUE: Un hachoir manuel de tissu permet un traitement rapide de dissection à la culture incubation sans la nécessité d'intégration agarose. Un vibratome peut également être utilisé comme décrit précédemment 9.
- Transfert tranches séparées dans le tampon de dissection froide fraîchement barboter sur la glace.
- Utiliser une petite dissection ou pesant spatules pour séparer les sections individuelles et de les transférer à préincubée six plats et avec des inserts de culture.
- Retirez tout tampon de dissection excès de la surface de l'insert de culture en utilisant une pipette de transfert jetable ou une pointe P 200 de la pipette. Deux à trois cerveau antérieur ou trois tranches de cervelet peut être placé sur un insert de culture.
REMARQUE: Pour obtenir des résultats cohérents avec les cultures du cerveau antérieur, il est idéal pour les tranches couvrant la partie antérieure d'un tiers de corps calleux(Figure 1A) afin d'étudier les deux régions grises et blanches matière dans la même tranche. Chaque animal donne généralement de six tranches de cerveau antérieur et les six tranches de cervelet. - Placez les six plaques ainsi dans l'incubateur et remplacer le milieu de la tranche avec 1 ml de milieu de tranche 1 jour après la préparation de tranche, puis tous les deux jours jusqu'à ce que la tranche fixation.
- Selon l'expérience, utiliser des tranches après 5-7 jours de culture. Utilisez uniquement des tranches qui deviennent transparent après les quelques premiers jours et jeter ceux qui ont des zones opaques inégales. REMARQUE: les régions opaques dans les tranches sont visibles à l'œil nu et apparaissent comme un amas de cellules sombres en contraste de phase. Après la technique a été maîtrisé, morts tranches opaques sont rares, en moins de 1-5% des tranches.
2. imagerie time-lapse de la division cellulaire et NG2 Oligodendrocyte différenciation
REMARQUE: Pour effectuer laps de temps imagerie de NG2 la prolifération et la différenciation cellulaire, nous utilisons NG2cre: souris ZEG 16qui expriment l'EGFP dans les cellules NG2 et de leur progéniture (figure 1C-E). expression de rapporteur dans cette ligne est suffisamment robuste pour obtenir des images en direct des cellules GFP + dans les tranches immédiatement après la coupe pour une période de temps d'au moins quatre semaines. Les images les plus nettes sont obtenues après la période initiale de l'amincissement de la tranche, qui se produit au cours des 3-5 premiers jours de culture.
- Tout au long de l'expérience, garder les tranches dans un incubateur de culture de cellules à 37 ° C et ne retirez que pour de brèves périodes de temps (moins de 15 min par tranche), en gardant le couvercle sur la plaque de six puits tandis que d'imagerie.
- En utilisant un microscope inversé à fluorescence équipé d'une caméra numérique, de capturer des images au premier point de temps à l'aide d'un objectif 10X. REMARQUE: premiers points de temps varient par l'expérience et peuvent être le jour où les coupes ont été préparés ou n'importe quel moment après le temps.
- Capturez des images à partir de plusieurs régions à un point de temps dans les deux zones de la matière grise et blanche de la tranche. Remarque èmee région imagée par des sites spécifiques au sein de la tranche et de la cartographie de la position de l'image sur un schéma qui peut être utilisée pour des séances de formation d'image ultérieures. Points de repère utiles peuvent inclure des bords des tranches et / ou l'orientation de faisceaux de matière blanche. L'image de quatre à huit endroits sur chaque tranche à chaque point de temps.
- Capturer les images subséquentes à un intervalle de 4-6 heures si l'examen de la division des cellules NG2 et la différenciation des oligodendrocytes, idéalement plus de 5-7 jours.
- Capturer une image finale de toutes les régions et de fixer les tranches immédiatement. Ajouter 1 ml de fixateur (PFA 4% avec 0,1 M de L-lysine 0,01 M métaperiodate de sodium) à la partie inférieure de l'insert de culture, puis ajouter 1 ml d'autre sur le dessus des tranches. Prenez soin de ne pas injecter le fixateur directement sur la tranche, car il peut se détacher de la membrane. Fixer le tissu pendant 30 minutes et procéder à l'immunohistochimie en utilisant des marqueurs spécifiques au stade de développement tel que décrit dans la section 4.
- Tranches lavage avec du phosphate de sodium 0,2 M tampon 3 x 10 m. Si nécessaires, des tranches de conserver à 4 ° C à 0,2 M tampon phosphate de sodium pendant 1-3 jours avant immunomarquage mais idéalement effectuer de coloration dans les 24 heures. Passez par immunohistochimie comme décrit ci-dessous dans la section 4 pour déterminer la proportion de cellules qui sont différenciées en oligodendrocytes (figure 2D-F).
3. destin cartographie de NG2 descendance de la cellule en utilisant des souris transgéniques inductible Reporter dans les cultures Slice
NOTE: Pour suivre le destin des cellules NG2 d'un point de temps particulière dans la culture, NG2creER inductibles: souris transgéniques YFP peuvent être utilisés.
- Induire une recombinaison Cre et expression du reporteur par l'ajout de 100 nM 4OHT dissous dans de l'éthanol au milieu de culture. REMARQUE: cellules positives Reporter devraient apparaître dans les 1-2 jours à une efficacité d'induction de ~ 20-25% YFP cellules NG2 + + / NG2 + et à ce point de temps seront tous des cellules au stade de cellules NG2 (Figure 2A-C)
- Fixer et laver la tranches, à différents points dans le temps après diverses manipulations (décrits dans les sections 2.5 et 2.6).
4 Slice immunohistochimie
- Couper les membranes avec les tranches attachées sur les inserts à l'aide d'un scalpel.
- Transfert tranches de puits individuels d'une solution saline 24 plaque contenant bien tamponnée au phosphate (PBS) en utilisant un ensemble de pinces à épiler, en prenant soin de ne pas perturber la composition de la tranche d'enlèvement de la membrane.
- Transférer les tranches sur une plaque à 24 puits avec une solution de blocage contenant 5% de sérum normal de chèvre (NGS) et 0,1% de Triton-X100 dans du PBS pendant 1 heure.
- Incuber les tranches d'anticorps primaire O / N à 5% NGS dans du PBS à 4 ° C. Pour identifier les cellules au stade de la cellule NG2, en utilisant des anticorps dirigés contre le récepteur PDGFRa et NG2. Pour identifier les oligodendrocytes différenciés, utiliser un anticorps à l'antigène polypose adénomateuse coli (APC; clone CC1).
- Sur la deuxième tranches de lavage de jour en PBS 3 x15 min, puis incuber dans Antibo secondairemeurt dans 5% NGS dans du PBS pendant 1 heure à température ambiante. Laver les tranches dans du PBS 3 x15 min et monter sur des lames. Montage de tranches vers le haut et face à la membrane diapositive de sorte que la membrane ne sera pas entre l'objectif et le tissu.
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Representative Results
Des exemples de données représentatives sont donnés ci-dessous qui ont été obtenus à partir de cultures de tranche de la fois le cerveau et le cervelet de P8 NG2cre: ZEG, NG2creER: YFP et PLPDsRed lignées de souris transgéniques. Cellules NG2 peuvent être visualisés sur plusieurs jours dans du cerveau antérieur et le cervelet tranches (figure 1B-D, la vidéo 1) et le phénotype de ces cellules peut être déterminé qu'après la fixation et immunologique avec des anticorps NG2 et CC1 (figure 1E). De plus en mode d'imagerie, la prolifération cellulaire peut également être évaluée en utilisant la coloration immunohistochimique des marqueurs de prolifération cellulaire tels que Ki67 (Figure 1F). Ces données permettent une analyse détaillée de la dynamique temporelle de la différenciation des oligodendrocytes après la division cellulaire NG2 sur une base de cellule individuelle. cartographie destin des cellules NG2 peut être effectuée après l'induction de recombinaison cre en tranches avec 4OHT dans NG2creER: souris YFP (Figure 2). Cellules NG2 + de YFP journaliste exprimant étaient found cultures dans les deux jours après l'addition de 4OHT dans le milieu de culture (figure 2A). Six jours après 4OHT induction, une partie des cellules YFP + avait différencié en CC1 + oligodendrocytes (figure 2B). Ces données montrent la possibilité d'effectuer la cartographie de destin des cellules NG2 en tranches où le milieu extracellulaire peut être manipulé pour tester les effets d'agents pharmacologiques ou diverses insultes sur le sort des cellules NG2. Différentes concentrations de 4OHT peuvent être utilisées pour obtenir différents degrés de recombinaison cre. Par exemple, l'exposition à 100 nM 4OHT pendant 2 jours provoque l'expression de journaliste dans environ 20-25% de toutes les cellules exprimant NG2 tandis que 1 uM 4OHT donc à environ 60-70% d'efficacité de recombinaison. Enfin, une vaste myéline est présent dans ces cultures et les oligodendrocytes myélinisantes peut être imagé en tranches fixes et vivantes en utilisant des souris transgéniques PLPDsRed (Figure 3, vidéo 2).
Figure 1: Tranche méthode de culture pour l'imagerie à long terme de la prolifération des cellules NG2 et la différenciation (AB) Schéma montrant l'isolement de cerveau antérieur et de tranches de cervelet (A) et la culture ultérieure et imagerie time-lapse en utilisant des inserts de culture de tranche (B). (C ) Représentation décrivant la division des cellules NG2 et la différenciation des oligodendrocytes ultérieur dans NG2cre:. souris transgéniques ZEG (D) Exemples d'images acquises à partir de régions corticales de NG2cre: souris ZEG montrant une seule GFP + cellules (flèches) en divisant deux fois sur une période de 122 heures, temps représentés dans le coin supérieur droit comme heures après le début de l'expérience d'imagerie. (E) de fixation et de coloration immunologique avec des anticorps CC1 de la même tranche anti-NG2 et révèle que le dividi imagéecellules ng abouti à trois NG2 + cellules (flèches). (F) Exemple d'image montrant deux Ki67 + NG2 + cellules dans une culture de la tranche corticale. (G) Exemple d'image montrant NG2 + cellules (pointes de flèches) et leurs processus entrelacées avec NeuN + noyaux neuronaux dans une corticale culture tranche. Les barres d'échelle 25 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: induction de l'expression YFP pour suivre le destin des cellules NG2 dans les cultures du cerveau antérieur tranche (AB) Images prises de la région du corps calleux des cultures du cerveau antérieur tranche de NG2creER: souris YFP traités avec 4OHT pendant 24 heures et puis à gauche dans la culture pour 2 jours (A) ou de 6 jours (B) (A) ou CC1 et YFP (B) démontre la différenciation des cellules positives NG2 rapporteurs en oligodendrocytes en culture pendant 6 jours après la recombinaison cre (flèche). Les barres d'échelle 25 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 oligodendrocytes d'imagerie dans les cultures tranche de souris transgéniques PLPDsRed. (A) Schéma illustrant l'isolement, la culture et l'imagerie de tranches de cervelet de souris transgéniques PLPDsRed. (B) Image tirée d'une cervelet tranche fixe après 5 jours in vitro montrant calbindine + ( cyan) neurones de Purkinje avec myéliniséemyéline de base protéines + (MBP) (vert) axones dans les régions de la substance blanche de la tranche. Barre d'échelle de 25 um. (C) des images à faible grossissement capturés dans la même région tous les jours aux heures indiquées en heures dans les cultures cervelet tranche de souris PLPDsRed. Barre d'échelle de 100 um. (D) d'image à faible grossissement pris d'une tranche PLPDsRed culture fixe montrant l'expression de MBP dans les régions de la substance blanche, où les cellules DsRed + sont concentrés. Barre d'échelle de 100 um. (E) l'image à fort grossissement pris d'un PLPDsRed culture de la tranche fixe indiquant simples DsRed + oligodendrocytes avec les processus MBP +. Barre d'échelle de 20 um. (F) de séquence time-lapse pris d'un cervelet tranche PLPDsRed montrant les corps cellulaires relativement stables au cours de la session d'imagerie de 48 heures, le temps indiqué dans coin supérieur droit en heures. Barre d'échelle de 25 um. PlaidoyerSE Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Vidéo 1 imagerie en direct de la division cellulaire NG2 dans une culture de la tranche corticale temps Représentant défaut d'opposition de la séquence montrant de multiples divisions cellulaires dans une culture de la tranche corticale pris d'un NG2cre:. Souris transgénique ZEG. Vidéo s'affiche à 5 images par seconde, montage d'images de la figure 1. (Voir "Video_1.mov" sous Téléchargements)
Vidéo 2 de l'imagerie en direct des oligodendrocytes dans les cultures cervelet de tranche de temps représentant laps-séquence montrant de petits changements dans la morphologie des oligodendrocytes (flèche) imagé plus de 48 heures dans une tranche de cervelet pris d'une souris transgénique PLPDsRed. Vidéo s'affiche à 3 images par seconde, montage d'images montrées à la figure 3. (Voir "Video_2.mov" sous Téléchargements)
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Discussion
La myélinisation dans le système nerveux central est essentiel pour une communication efficace neuronale et la survie des axones 22. Cellules NG2 génèrent en permanence des oligodendrocytes myélinisantes à l'âge adulte, tout en maintenant une population résidente dans la plupart des régions du cerveau 16,23 - 25. Certains mécanismes génétiques et moléculaires qui régulent la différenciation de ces cellules ont été décrits, mais beaucoup reste à découvrir. Cultures organotypique sont un outil commode pour étudier ces mécanismes en raison de leurs caractéristiques uniques de maintien régions anatomiques, la manipulation facile de l'environnement extracellulaire, la myélinisation robuste, et la présence de tous les principaux types de cellules. Ces caractéristiques de faciliter les enquêtes des interactions à court et à long terme entre les cellules NG2, les oligodendrocytes et les axones 11,26. De plus, la transplantation de cellules est relativement facile à réaliser et peut être utilisé pour étudier la région dépendant de differences dans le comportement des cellules 17. En outre, les traitements pharmacologiques peuvent être ajoutés au milieu de culture pour étudier les mécanismes moléculaires qui influencent la prolifération des cellules NG2 et / ou la différenciation normale dans les cultures de démyélinisation 17,27,28 et 15,29. Enfin, il est techniquement possible d'utiliser des cultures de tranche pour réaliser des écrans pour l'analyse à haut débit de composés qui dirigent les cellules NG2 à proliférer ou se différencier, peut-être même après une démyélinisation insulte 30.
Les méthodes actuelles pour étudier les cellules oligodendrocytes de la lignée et de leurs interactions avec les axones dans un cadre de culture contrôlée comprennent des co-cultures avec dissocié ganglion de la racine dorsale (DRG) ou neurones corticaux embryonnaires et les cellules NG2 31,32, qui reposaient sur des préparations originales développées pour étudier DRG interactions cellule -Schwann 33. Ces cultures ont été utilisées pour étudier les propriétés fondamentales de l'axone et des oligodendrocytesles interactions des cellules de la lignée dont signalisation dépendant de l'activité neuronale pour induire la différenciation et la production de la myéline 32,34 - 36, en plus de questions, telles que la dépendance du diamètre de l'axone et la densité des cellules NG2 prolifération de commande et le début de la différenciation 37. Bien que ces systèmes de co-culture sont idéales pour répondre à ces questions, corrélation directe et application à la situation in vivo n'est pas toujours évident. Comme mentionné précédemment, des cultures de tranches organotypiques fournissent un état unique de maintenir un grand nombre de connexions neuronales locales et trois dimensions cytoarchitecture qui sont perdus dans la préparation de co-culture de cellules dissociées. En outre, contrairement cultures organotypique, les systèmes de co-culture de cellules dissociées, souvent, ne comprennent pas les autres cellules gliales et des molécules de la matrice extracellulaire qui ont montré à jouer un rôle clé dans le développement, la maintenance et la physiologie des cellules NG2, oligodendrocytesEt la myéline. Avec la croissance spectaculaire de la diversité des outils disponibles pour l'étiquetage et la manipulation de populations cellulaires distinctes avec des vecteurs viraux et les animaux transgéniques, l'imagerie à long terme et la cartographie de destin dans les cultures organotypique spécifique devrait se révéler une technique puissante pour l'étude des cellules NG2 la prolifération, la différenciation et la myélinisation des oligodendrocytes.
Plusieurs étapes critiques doivent être effectués lors de l'exécution de ces expériences pour assurer la survie de la tranche et la reproductibilité des données. Tout d'abord, afin de générer des tranches en bonne santé, la coupe et l'isolement des tranches doit être effectuée le plus rapidement possible et dans un tampon de dissection glacée. Deuxièmement, alors que l'acquisition de position de l'image automatisé avec une platine motorisée sur le microscope de fluorescence peut être utile, il ya beaucoup de facteurs qui peuvent perturber le transfert précis des zones exposées et d'acquisition de manuel répétée est nécessaire pour obtenir des images toujours plus fiables multiple jour. Ceci est particulièrement nécessaire si les tranches sont maintenues dans un incubateur de culture de cellules entre les sessions de formation d'image et non pas dans un incubateur étage supérieur. Troisièmement, lors de la fixation de la tranche, la coloration et le montage, il est extrêmement important de manipuler les tranches doucement toute perturbation du tissu se traduira par l'impossibilité de déplacer les régions et les cellules direct imagées. Il n'y a pas de modifications spécifiques aux méthodes traditionnelles utilisées pour les préparations de la culture de la tranche qui sont utilisés pour les études de neurones et les astrocytes.
Il existe plusieurs limites à la méthode de culture de la tranche qui doit être considéré. Les astrocytes et la microglie, les cellules NG2 sont connus pour répondre à des lésions du système nerveux central avec une prolifération accrue au niveau du site de la blessure et la formation d'une cicatrice gliale. Le processus de préparation des résultats tranches dans une réorganisation et une réponse gliale réactive initiale de ces cellules. NG2 taux de prolifération des cellules reviennent à des niveaux similaires à ceux observés in vivo pour appariésstades de développement après plusieurs jours de culture mais les des taux de prolifération accrue et phénotype réactive initiale de ces cellules doivent être pris en considération lors de l'interprétation des données. La présence de sérum de cheval dans le milieu de culture pourrait modifier NG2 la prolifération des cellules et doit être pris en compte lors de l'interprétation des résultats de toute expérience. En plus de cela, alors qu'il ya une activité spontanée des neurones, les entrées sensorielles et les connexions à longue distance entre les neurones font défaut, ce qui pourrait conduire à une altération de l'activité neuronale au sein de la tranche. Enfin, sans l'utilisation de promoteurs entraîné vecteurs viraux spécifiques ou des souris transgéniques, cellulaires manipulations génétiques spécifiques d'un type dans les systèmes de culture de tranche est difficile. Bien que ces limites doivent être considérés lors de la conception des expériences, des cultures de tranche sont un système unique qui peut être utilisé pour obtenir un nouvel aperçu des questions qui ne peuvent pas être résolues avec des cultures de cellules dissociées ou chez l'animal intact.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slice Culture Medium | |||
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11090 | 50% |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175 | 25% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | 25mM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 1mM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 1mg/L |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 0.4mM |
| Horse Serum | Hyclone | SH30074.03 | 25% |
| Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius | |||
| Dissection Buffer | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 124mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.004mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | 1.25mM |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M7506 | 4.004mM |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 2mM |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | 26mM |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | 10mM |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 2.0mM |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | 0.075mM |
| Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use | |||
| Other Reagents and Supplies | |||
| 4-hydroxy tamoxifen (4OHT) | Sigma-Aldrich | H7904 | 100nM |
| Paraformaldehyde (PFA) | EM Sciences | 19200 | 4% |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L-6027 | 0.1M |
| Sodium Metaperiodate | Sigma-Aldrich | S-1878 | 0.01M |
| Rabbit anti NG2 antibody | Chemicon (Millipore) | AB5320 | 1:500 |
| Mouse anti CC1 antibody | Calbiochem (Millipore) | OP80 | 1:200 |
| Mouse anti Ki67 antibody | Vision Biosystems | NCL-Ki67-MM1 | 1:300 |
| Mouse anti NeuN antibody | Chemicon (Millipore) | MAB377 | 1:500 |
| Species specific secondary antibodies | Jackson Immunoresearch | ||
| Normal Goat Serum (NGS) | 5% | ||
| Triton X-100 | 0.10% | ||
| Mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size | Fisher Scientific | PICM03050 | |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Ethanol | |||
| 95% O2 5% CO2 gas mix | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| Sterile six well plates | |||
| Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas | |||
| Manual or automatic tissue chopper | |||
| Razor blades | |||
| Disposable transfer pipettes | |||
| 35mm and 60mm sterile Petri dishes | |||
| Stereomicroscope | |||
| Inverted Phase Microscope | |||
| Laminar Flow Hood | |||
| Tissue Culture Incubator | |||
| Inverted Fluorescence Microcope | |||
References
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