Abstract
NG2 ifade eden hücreler (polydendrocytes oligodendrosit öncü hücreleri), merkezi sinir sisteminde, dördüncü bir glial hücre içerisinde yer alırlar. Embriyonik ve postnatal gelişim sırasında aktif çoğalırlar ve Myelinating oligodendrositleri oluşturmak. Bu hücreler sık primer ayrışmış kültürler, nöron cocultures okudu ve sabit dokuda edilmiştir. Kullanımı uygun yeni transgenik fare soyları kültür sistemleri ön beyin ve beyincik hem gri ve beyaz madde bölgelerde oligodendrosit soy hücrelerinin çoğalması ve farklılaşması araştırmak için kullanılabilir dilim. Dilim kültürleri erken doğum sonrası farelerde hazırlanan ve 1 aya kadar kültür içinde tutulur. Bu dilimler hücresel davranış ve etkileşimleri araştırmak için kültür dönemi boyunca birden fazla kez görüntülenmiş olabilir. Bu yöntem NG2 hücre bölünmesi görselleştirme ve ayrıntılı analizini sağlarken olgodendrosit farklılaşma giden adımlar bölgede-bağlıdır veriyorent NG2 hücre ve olgodendrosit fonksiyonel heterojenite. Bu ise, in vivo olarak bulunan andıran bir hücresel ortamda zaman bu hücreleri etkileyen iç ve dış sinyalleri araştırmak için kullanılan bir güçlü bir tekniktir.
Introduction
4 - merkezi sinir sistemi Organoytpic dilim kültürlerinin semiintact sistem 1 'de nöron ve glial hücre biyolojisi çalışmak için çok yararlı olduğu kanıtlanmıştır. 9 - Bu kültürler, kabul ve bu hücre dışı ortamın bir manipülasyon ve tekrarlamalı uzun-süreli canlı hücre görüntüleme için kolay erişim ve elektrofizyolojik kayıtları 5, birincil hücre kültürleri ayrışmış birçok yararlarını korumak için nispeten basittir. Buna ek olarak, dilim kültürler, 3 boyutlu doku hücre mimarisini, bölgesel sinir bağlantısına sahip, ve en önemli hücre tiplerinin sistemde bulunmaktadır. Bu özellikler hücresel ve çevresel etkileşimleri ile tek hücre davranış ve fizyolojisini araştırmak için bu Kültürlerin benzersiz ve kullanışlı bir sistem yapmak.
NG2 hücrelerinin çoğalmasını ve m oluşturmaya devam memelilerin merkezi sinir sistemindeki glial hücreler bir nüfusembriyonik ve postnatal gelişim 10 sırasında oligodendrositleri yelinating. Bunlar yaygın olarak ayrışmış primer hücre kültürlerinde incelenmiştir ve floresan proteinleri NG2, hücre spesifik ifadesi ile transgenik fare hatları son gelişmeler, akut dilim preparasyonlarında in vivo kaderi haritalama ve elektrofizyolojik kayıtları kolaylaştırmıştır. Hatta bu çalışmalar ile, küçük NG2 hücre çoğalması ve olgodendrosit farklılaşmasının zamansal dinamikleri hakkında bilinmektedir. Ayrışık hücre kültürü geniş farmakolojik ve genetik manipülasyon göreli tesis için kullanılır, ancak, bunun hücresel mikro-bağlamını sağlamak tercih edilir, özellikle, beynin farklı bölgelerinde bu hücrelerin fonksiyonel farklılıklar sorgulamak için uygun değildir. Dilim kültürleri, hücre farmakolojik manipülasyonlar mükellef ve olgodendrosit myelinleşmeyi 11,12 araştırmak için kullanılır olmuştur basit bir alternatif sağlamak(LPC) lisolesitin veya antikor farmakolojik tedavinin 15 üzeri demiyelinizasyonu 13,14 ve remiyelinizasyon indüklenmesini sonra ular yanıt.
Bir yöntem araştırmak ve canlı görüntüleme ve sabit doku (veya Postfiksasyon) ön beyin ve beyincik hem de alınan organotipik dilim kültürlerde NG2 hücre çoğalması ve farklılaşması olgodendrosit analizini tarif gerçekleştirmek için. Bu bölünme sonrası 16 tek NG2 hücrelerinin hücre kaderine incelemek için ve büyüme faktörü ile uyarılan NG2 hücre çoğalması 17 bölge ve yaşa bağlı farka için kullanılabilir güçlü bir yöntemdir. Bu, nispeten basit teknik ayrıca doğuştan ve / veya çevresel, bu glial hücre fizyolojisi ve nöronal aktivite ya da mielin hasarına cevabı düzenleyen mekanizmaların hücre araştırılması yaygın erişilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm hayvan prosedürleri yönergeleri izleyerek ve Connecticut Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: YFP muhabiri 20 (JAX # 006148) çizgiler sırasıyla kullanıldı: NG2cre 18 bünye (JAX # 008533) ve NG2creER 16 uyarılabilir bu deneylerde (JAX # 008538) için transgenik fareler 19 (JAX # 003920) veya gtRosa26 / EG Z'ye geçti Görüntü NG2 hücreleri ve soylarına. Görüntü olgun oligodendrositlere, PLPDsRed transgenik farenin 21 kullanılmıştır. Tutarlı hayatta kalmak için, dilimler ön beyin ve beyincik hem doğum sonrası gün 10 fareden izole edilebilir.
1. Dilim Hazırlık
- Bir kültürü kaputu, altı iyi plakaları doku kültürü yerlefltirmede ve (reaktif bölümünde tarifi) 1 ml dilim kültür ortamı ekleyin. % 5 ile 37 ° C'de diseksiyon önce CO2 en az 2 saat, hücre kültürü inkübatöründe plakaları koyun.
- % 70 etanol ile tüm araçları ve doku chopper sterilize edin.
- Diseksiyon önce başlamasından en az 15 dakika boyunca buz üzerinde% 95 O2,% 5 CO2 ile kabarcık tampon diseksiyon (reaktif bölümünde tarif).
- Onaylanmış hayvan protokollere göre 5-10 dakika süreyle buz üzerinde yerleştirerek fare yavrular anestezisi. Farenin kuyruk ve ayak sıkıştığı yanıt vermeyen onaylayarak anestezi uygun derinliğini teyit edin.
- Hayvan protokolleri aşağıdaki keskin bir makas kullanarak hayvanları başını kesmek. Hızla ilk sterilize araçlarını kullanarak lateral insizyon ardından sagital kesim, yaparak ön beyin ve beyincik üzerinde kafatası çıkarın. Dikkatli bir tarafına doku yuvarlayarak beyin ve beyincik ventral yüzeyinden kafatası sinirlerinde kesin.
- Buzla soğutulmuş, oksijenli diseksiyon tampon içeren steril bir 35 mm çanak doku yerleştirin.
- Bir jilet kullanarak, beyincik ve ön beyin sever. Sonra mid-sagital kesim uçtan bir uca yapmakhemisferleri ayıran öf ön beyin ve beyincik.
- Manuel doku kıyıcı ile ön beyin ve beyincik 300 mikron kalınlığında koronal ve sagital kesitler halinde kesilmiştir. NOT: Manuel doku kesici ve agaroz yerleştirilmesi için gerek kalmadan kültür kuluçkalamadan diseksiyon ikinci hızlı bir şekilde işlenebilirlik sağlar. Daha önce tarif edildiği gibi, 9 bir vibratome da kullanılabilir.
- Buz üzerinde taze kabarmış soğuk diseksiyon tampon ayrılır dilim aktarın.
- Küçük diseksiyon kullanın veya bireysel bölümleri ayırmak ve kültürü ekler ile altı iyi yemekler preinkübe aktarmak için spatulası ağırlığında.
- Tek kullanımlık bir transfer pipeti veya P 200 pipet ucu kullanılarak kültür uç yüzeyinden herhangi bir aşırı diseksiyon tamponunu çıkarın. Üç önbeyinde üç serebellar dilim iki bir kültür insert yerleştirilebilir.
NOT: ön beyin kültürleri ile tutarlı sonuçlar için, anterior korpus kallosum üçte birini kapsayan dilim almak idealdirAynı dilim içinde hem gri hem de beyaz cevher bölgelerini incelemek için (Şekil 1A). Her hayvan genellikle 6 ön beyin dilimleri ve 6 beyincik dilimleri verir. - Inkübatör altı havuzlu plakalar yerleştirin ve daha sonra 1 1 gün sonra dilim dilim hazırlanması ortamının mililitresi ve dilim sabitleme kadar her gün ile dilim orta yerine.
- Deneye bağlı olarak, kültür 5-7 gün sonra dilimler kullanın. Sadece ilk birkaç gün sonra şeffaf hale dilimleri kullanın ve düzensiz opak bölgeler var olanlar atın. NOT: dilimler içinde Opak bölgeler gözle görünür ve faz kontrast altında koyu hücrelerin bir yığın olarak görünür. Teknik hakim olmuştur sonra ölü opak dilimler dilim az% 1-5, nadiren meydana gelir.
NG2 hücre Bölümü ve Oligodendrosit Farklılaşma 2. Time-Lapse Görüntüleme
NOT: ZEG farenin 16: biz NG2cre kullanmak NG2 hücre çoğalması ve farklılaşması zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek içinNG2 hücreleri ve soyu (Şekil 1C-E) EGFP ifade edilmektedir. Bu hat Raportör ekspresyonu, kısa bir sürede en az dört haftalık bir süre boyunca kesit sonra dilimler canlı GFP görüntüleri + hücreler elde etmek için yeterince sağlamdır. Açık görüntüler kültüründe ilk 3-5 gün içinde gerçekleşir dilim, ilk incelmesi döneminden sonra elde edilir.
- Deney boyunca, 37 ° C'de hücre kültürü inkübatöründe dilimleri tutmak ve kısa süreler için, sadece kaldırma (dilim başına en az 15 dakika), altı yuvalı plaka sırasında görüntüleme üzerindeki kapağı tutmak.
- Bir dijital kamera ile donatılmış bir ters floresan mikroskop kullanılarak, bir 10X objektif kullanılarak ilk kez noktasında görüntüleri yakalayabilir. NOT: İlk kez puan deney göre değişir ve dilimler hazırlanmıştır gün veya sonrasında herhangi bir zaman noktası olabilir.
- Dilim hem gri hem de beyaz cevher alanlarında zaman noktasında bir çoklu bölgelerden görüntüler yakalayın. Not thdilim içinde belirli noktalara ile ve daha sonra bir görüntüleme oturumları için kullanılabilecek bir şema üzerinde görüntü konumu eşleyerek görüntülenmiş e bölgesi. Faydalı yerlerine beyaz cevher yollarının dilimleri ve / veya yönlendirme kenarlarını içerebilir. Görüntü her zaman noktasında her dilim 4-8 yerleri.
- 4-6 saat arayla sonraki fotoğrafları çekmek NG2 hücre bölünmesini ve olgodendrosit farklılaşma, ideal üzerinde 5-7 gün inceleyerek eğer.
- Tüm bölgelerin nihai bir görüntü yakalamak ve hemen dilimleri düzeltmek. Daha sonra dilimler üzerine başka bir 1 ml ilave edilir, kültür ucun tabanına (0.1 M L-lisin, 0.01 M sodyum meta-periodat ile% 4 PFA), sabitleyici 1 ml ilave edilir. Bu membran ayırmak gibi dilim doğrudan Fiksatif fışkırtma dikkat edin. 30 dakika boyunca doku saptamak ve bölüm 4'te tarif edildiği gibi gelişimsel aşama spesifik markörleri kullanılarak immünohistokimya ile devam edin.
- 0.2 M sodyum fosfat tamponu, 3 x 10 m ile yıkayın dilimleriolarak. 1-3 gün boyunca 0.2 M sodyum fosfat tampon maddesi içinde 4 ° C'de, gerekli deposu dilimleri daha önce immüno-boyama ve ancak ideal olanı ise, 24 saat içinde ve boyama gibi. Oligodendrositler (Şekil 2D,-F) farklılaşmış olan hücrelerin oranını belirlemek için bölüm 4, aşağıda tarif edildiği gibi immünohistokimya ile devam edin.
Dilim Kültürlerde indüklenebi- Muhabir transgenik fareler kullanılarak NG2 hücre Döl 3. Kader Haritalama
Not: kültüründe belirli bir zaman noktasında NG2 hücrelerin kaderini izlemek için, uyarılabilir NG2creER: YFP transgenik fareler kullanılabilir.
- Kültür ortamına, etanol içerisinde çözündürüldü, 100 nM 4OHT ekleyerek, Cre rekombinasyonunu ve bildirici ifadesini teşvik eder. Not: Raportör pozitif hücreler, bütün NG2 hücre aşamasında hücreler olacaktır ~% 20-25, YFP + NG2 + / + hücrelerinin NG2 bir indüksiyon verimle ve bu zaman noktasında 1-2 gün içinde görünecektir (Şekil 2A-C)
- Fix ve dilim yıkayınFarklı zaman noktalarında in çeşitli değişiklikler yapıldıktan sonra (Bölüm 2.5 ve 2.6 'da tarif edilmiştir).
4. Dilim İmmünhistokimya
- Bir neşter kullanılarak ekler dışarı ekli dilimleri ile membranlar kesti.
- Membran taşırken dilimin bileşimi bozmak için özen cımbız bir dizi kullanılarak 24 gözenekli bir plaka ihtiva eden fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), tek tek oyuklara dilimleri aktarın.
- 1 saat boyunca PBS içerisinde% 5 normal keçi serumu (NGS) ve% 0.1 Triton-X100 içeren bloke etme çözeltisi, 24 gözlü bir levhaya dilimleri aktarın.
- 4 ° C'de PBS içinde% 5 NGS / birincil antikor O'da N dilimleri inkübe edin. NG2 hücre safhasında hücrelerin belirlenmesi için, ve NG2 PDGFRα antikorlar kullanır. Diferansiye oligodendrositlerin belirlenmesi için, adenomatus poliposis koli antijene karşı bir antikorun kullanılması (APC klon CC1).
- PBS 3 x15 dakikada ikinci gün yıkama dilimleri, daha sonra ikincil Antibo kuluçkaya yatmaktadıroda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS içerisinde% 5 NGS ölür. PBS 3 x15 dakika dilimleri yıkayın ve slaytlar monte. Membran objektif ve doku arasındaki olmayacak şekilde slayt karşı karşıya dilimleri yukarı ve membran ile monte edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Örnek veri örnekleri aşağıda verilmektedir P8 NG2cre bir ön beyin ve beyincik hem de dilim kültürleri kullanılarak elde edilmiştir ki: zeg, NG2creER: YFP ve transgenik fare hatları PLPDsRed. NG2 hücreleri ön beyin ve beyincik dilimleri (Şekil 1B-D, video 1) ve bu hücrelerin fenotip gün boyunca görüntülü olabilir tespit edilerek ve NG2 ve CC1 antikorları (Şekil 1E) ile immünboyama edilebilir. Canlı görüntülemeye ek olarak, hücre çoğalması aynı zamanda Ki67 (Şekil 1F) gibi hücre çoğalması işaretleri için imünohistokimyasal lekeleme kullanılarak değerlendirilebilir. Bu veriler bir tek hücre bazında NG2 hücre bölünmesi sonrası olgodendrosit farklılaşma zamansal dinamikleri ayrıntılı analizi için izin verir. YFP fareler (Şekil 2): NG2 hücre kaderi haritalama NG2creER içinde 4OHT ile dilimleri CRE rekombinasyon indüksiyonundan sonra gerçekleştirilebilir. YFP raportör salgılayan NG2 + hücreler vardı foİki gün sonra, kültür ortamı (Şekil 2A) için 4OHT eklendikten sonra kültürler und. Altı gün 4OHT indüksiyondan sonra, YFP + hücrelerinin bir kısmı, CC1 + oligodendrositler (Şekil 2B) ayrışmıştır, oldu. Bu veriler dışı ortam farmakolojik ajanlar ve NG2 hücrelerin kaderi çeşitli hakaretler etkilerini test etmek için manipüle edilebilir dilimleri NG2 hücrelerinin kaderi haritalama gerçekleştirme uygulanabilirliğini göstermek. 4OHT farklı konsantrasyonları CRE rekombinasyon farklı derecelerde elde etmek için kullanılabilir. 1 uM 4OHT yaklaşık% 60-70 verim ile sonuçlanır rekombinasyon Örneğin, 2 gün süre ile, 100 nM 4OHT maruz tüm NG2 ifade eden hücrelerin, yaklaşık% 20-25 raportör ifade edilmesine neden olur. Son olarak, aşırı miyelin bu kültürlerde var olan ve myelinating oligodendrosit (Şekil 3, video 2) PLPDsRed transgenik fareler kullanılarak, canlı ve sabit dilim olarak görüntülenebilir.
NG2 hücre çoğalması ve farklılaşması (AB) şematik kesit kültürü kalıpları kullanılarak ön beyin ve beyincik dilimleri (A) ve daha sonra kültür ve zaman atlamalı görüntüleme izole edilmesini gösteren (B) 'nin uzun vadeli görüntüleme için Şekil 1. Dilim kültür yöntemi. (Cı ) NG2cre olarak NG2 hücre bölünmesini ve daha sonra oligodendrosit farklılaşmasını özetleyen Tasvir:. kortikal NG2cre bölgelerinden alınan ZEG transjenik farelerin (M) Örnek görsel: 122 saatlik bir süre boyunca iki kez bölünmesi, tek bir GFP + hücre (oklar) gösteren ZEG fareler, zaman tasvir Anti-NG2 ve aynı dilimin CC1 antikor ile immünboyama (E) tutuş sağlar. görüntüleme deney başladıktan sonra saat olarak, sağ üst köşede ve ortaya koymaktadır görüntülü dividing hücreler üç NG2 + hücrelerinin (oklar) ile sonuçlandı. (F) Örnek resmin iki Ki67 yok + NG2 + bir kortikal neun + nöronal çekirdekleri ile iç içe geçmiş bir kortikal dilim kültürü içindeki hücreler. (G) Örnek görüntü gösteren NG2 + hücreleri (ok başları) ve bunların işlemleri dilim kültür. Ölçek Barlar 25 mikron bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
YFP ifade Şekil 2. indüksiyonu ön beyin kesit kültürlerinde NG2 hücreleri (AB), ikinci ön-beyin NG2creER dilim kültürlerinin corpus callosum'un bölgenin çekilen görüntülerin kaderini izlemek için: 2 için kültür içinde 24 saat boyunca 4OHT ile muamele edildi ve daha sonra sol YFP mice günler (A) ya da 6 gün (B) (A) veya CC1 ve YFP (B) immunohistokimyasal. Ölçek Barlar 25 mikron bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
PLPDsRed transgenik farelerden alınan kesit kültürlerinde Şekil 3. Görüntüleme oligodendrosit (A). Şematik kültürlenmesi ve PLPDsRed transgenik farelerden alınan beyincik dilimlerinin görüntüleme izole görünümüdür. Nitro gösteren kalbindin + 5 gün sonra sabit bir dilim beyincik alınan (b) görüntü ( miyelinli ile camgöbeği) purkinje nöronlarıdilim beyaz cevher bölgelerine uzanan miyelin temel protein + (MBP) (yeşil) aksonlar. Ölçek Bar 25 mikron. PLPDsRed farelerin beyincik dilim kültürlerde saat içinde belirtilen zamanlarda her gün aynı bölgede yakalanan (C) Düşük büyütme görüntüleri. Ölçek Bar 100 mikron. (D) DsRed + hücreler konsantre edilir beyaz cevher bölgelerde MBP ifadesini gösteren sabit PLPDsRed dilim kültür alınmıştır Düşük büyütme görüntü. MBP + süreçleri ile tek DsRed + oligodendrositleri gösteren sabit PLPDsRed dilim kültür alınan Ölçeği Bar 100 mikron. (E) Yüksek büyütmeli görüntü. Ölçek Bar 20 mikron. 48 saat görüntüleme oturum boyunca nispeten istikrarlı hücre gövdeleri gösteren bir PLPDsRed beyincik dilim alınan (F) Time-lapse dizisi, saat üst sağ belirtilen zaman. Ölçek Bar 25 mikron. Please, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Bir kortikal dilim kültür NG2 hücre bölünmesinin Video 1. Canlı Görüntüleme bir NG2cre alınan bir kortikal dilim kültür birden fazla hücre bölünmeleri gösteren Temsilcisi time lapse-sırası:. ZEG transgenik fare. Video, saniyede 5 kare, Şekil 1'de gösterildiği görüntülerin montaj görüntülenir. (Yüklemeler altında "Video_1.mov" bak)
Video beyincik kesit kültürlerinde oligodendrosit 2. imaj bir PLPDsRed transgenik fareden alınan bir beyincik dilim içinde 48 saat boyunca görüntülenmiş oligodendrosit morfolojisi (ok) gösteren küçük değişiklikler Örnek zaman atlamalı-sırası. Video, saniyede 3 kare, Şekil 3'te gösterilen görüntülerin montaj görüntülenir. (Yüklemeler altında "Video_2.mov" bak)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Merkezi sinir sisteminde etkin Myelinasyon nöronal iletişim ve aksonal hayatta 22 için gereklidir. 25 - En beyin bölgelerinde 16,23 içinde yerleşik nüfusu korurken NG2 hücreleri sürekli yetişkinlik içine Myelinating oligodendrositleri oluşturmak. Bu hücrelerin farklılaşmasını düzenleyen bazı genetik ve moleküler mekanizmalar tarif edilmiştir ama çok keşfedilmeyi beklemektedir. Organotipik dilim kültürleri nedeniyle anatomik bölge, hücre dışı ortama kolay manipülasyon, sağlam myelinasyon, ve tüm önemli hücre tiplerinin varlığı sürdürmenin kendi benzersiz özellikleri bu mekanizmaları araştırmak için uygun bir araçtır. Bu özellikler NG2 hücreleri, oligodendrositler ve akson 11,26 arasında kısa ve uzun vadeli etkileşimlerinin araştırılması kolaylaştırır. Buna ek olarak, hücre nakli gerçekleştirmek için nispeten kolaydır ve bölge bağımlı d araştırmak için kullanılabilirhücre davranışı 17 ifferences. Bundan başka, farmakolojik tedavilerin, normal olarak 17,27,28 NG2 hücre çoğalmasını ve / veya farklılaşmasını etkileyen bir moleküler mekanizma ve miyelin kaybetmiş kültürleri 15,29 araştırmak için kültür ortamına ilave edilebilir. Son olarak, hatta bir demiyelinizan boşaltım 30 sonra, çoğalmaya veya ayırt etmek NG2 hücrelerin doğrudan bileşiklerin yüksek veri akışı analizi için ekranlar gerçekleştirmek için dilim kültürleri kullanmak için teknik olarak mümkündür.
Geçerli yöntemler kontrollü bir kültür ortamında akson ile olgodendrosit soy hücreleri ve bunların etkileşimlerini araştırmak DRG'yi araştırmak için geliştirilen özgün hazırlıkları dayanmaktadır çözülmüş dorsal kök ganglion (DRG) veya embriyonik kortikal nöronlar ve NG2 hücreleri 31,32 ile co-kültürler dahil etmek -Schwann hücre 33 etkileşimleri. Bu kültürler akson ve oligodendrosit temel özelliklerini araştırmak için kullanılmıştırAkson çapı ve NG2 hücre yoğunluğu kontrol çoğalmasının ve farklılaşmasının bağımlılığı 37 başlangıcı olarak diğer sorulara ek olarak 36 - nöron faaliyeti bağlı olarak sinyal verilmesini içeren soy hücre etkileşimleri ve farklılaşma miyelin üretiminize 32,34 tetiklemek için karıştırılabilir. Bu kokültürü sistemleri, soruları, in vivo durumu doğrudan ilişki ve uygulamayı ele ideal olmakla her zaman açık değildir. Daha önce belirtildiği gibi, Organotipik kültürler dilim ayrışmış hücrelerinin ko-kültür preparasyonlarda kaybolur yerel nöronal bağlantıları ve üç boyutlu hücre mimarisini birçok muhafaza benzersiz bir durum sağlamaktadır. Ayrıca Organotipik kültürler dilim farklı olarak, ayrışmış hücrelerinin ko-kültür sistemleri çoğu zaman, başka bir glial hücreler ve NG2 hücrelerinin geliştirilmesi, bakım ve bunların fizyolojideki önemli roller oynadığı kanıtlanmıştır hücre dışı matris moleküllerini oligodendrosit kapsamamaktadırVe miyelin. Özel etiketleme ve viral vektörler ve transgenik hayvanların, uzun vadeli görüntüleme ve organotipik dilim kültürlerde kaderi haritalama ile farklı hücre popülasyonlarının manipülasyonu için mevcut araçları çeşitli dramatik büyüme ile NG2 hücrenin soruşturma için güçlü bir teknik olarak ispatlamak zorundadır çoğalması, farklılaşması ve olgodendrosit myelinizasyondur.
Dilim hayatta kalma ve veri yeniden üretilebilirlik sağlamak için, bu deneyler, birkaç önemli işlemlerin yapılması gerekir. İlk olarak, sağlıklı dilimleri, kesit ve dilimlerin izolasyonu oluşturmak için mümkün olduğu ve buz gibi soğuk tampon maddesi içinde diseksiyon hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Floresan mikroskop motorlu bir sahne ile otomatik görüntü konumu elde etme yararlı olabilir İkincisi, görüntülü ve manuel tekrarlanan satın alma bölgelerin hassas tehcir bozabilir birçok faktör multipl üzerinde sürekli güvenilir görüntüleri almak için gerekli Bildiğiniz gibi,e gün. Dilimleri görüntüleme oturumları arasında olup, bir sahne üstü inkübatör bir hücre kültürü inkübatöründe tutulur, bu özellikle gereklidir. Üçüncü olarak, dilim tespit, boyama ve montaj esnasında dokusunun herhangi bir aksama canlı görüntülü bölgeleri ve hücreleri taşınmaya yetersizlik neden olacak gibi yavaşça dilim işlemek için son derece önemlidir. Nöronlar ve astrositlerde çalışmalarında kullanılmaktadır dilim kültür hazırlıkları için kullanılan geleneksel yöntemler için özel değişiklikler vardır.
Dikkate alınmalıdır dilim kültür yöntemine bazı sınırlamalar vardır. Astrositlerin, mikroglia ve NG2 hücrelerinin artan yaralanma yerinde çoğalması ve glial yara izi oluşumu ile CNS zararlı yanıt bilinmektedir. Bazı yeniden organizasyonunda dilimler sonuçları ve bu hücrelerden bir başlangıç reaktif glial yanıt hazırlanmasına yönelik proses. Bahisler için NG2 hücre çoğalma hızları in vivo bildirilen benzer seviyelerde dönmekveriler yorumlanırken kültür ancak artan proliferasyon oranları ve bu hücrelerin başlangıç reaktif fenotipi birkaç gün sonra gelişim aşamaları dikkate alınmalıdır. Kültür ortamında at serumu varlığı NG2 hücre çoğalmasını değiştirebilir ve herhangi bir deney bulguları yorumlanırken düşünülmelidir. Buna ek olarak, dilim içinde değişmiş nöronal aktivitenin neden olabilir spontan nöronal aktivitenin düzenlenmesi, duyu girişi ve nöronlar arasındaki bağlantı uzun menzilli eksik, söz konusudur. Son olarak, dilim kültür sistemi içinde spesifik promotörü tahrikli viral vektörler ya da transjenik farelerin, hücre tipine özgü genetik manipülasyonlar kullanılmadan zordur. Deney tasarlama zaman bu sınırlamalar dikkate alınmalıdır iken, dilim kültürleri ayrışmış hücre kültürleri veya sağlam hayvanda cevap olamaz soruları yeni fikir edinmek için kullanılabilir eşsiz bir sistem vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slice Culture Medium | |||
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11090 | 50% |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175 | 25% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | 25mM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 1mM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 1mg/L |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 0.4mM |
| Horse Serum | Hyclone | SH30074.03 | 25% |
| Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius | |||
| Dissection Buffer | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 124mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.004mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | 1.25mM |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M7506 | 4.004mM |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 2mM |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | 26mM |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | 10mM |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 2.0mM |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | 0.075mM |
| Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use | |||
| Other Reagents and Supplies | |||
| 4-hydroxy tamoxifen (4OHT) | Sigma-Aldrich | H7904 | 100nM |
| Paraformaldehyde (PFA) | EM Sciences | 19200 | 4% |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L-6027 | 0.1M |
| Sodium Metaperiodate | Sigma-Aldrich | S-1878 | 0.01M |
| Rabbit anti NG2 antibody | Chemicon (Millipore) | AB5320 | 1:500 |
| Mouse anti CC1 antibody | Calbiochem (Millipore) | OP80 | 1:200 |
| Mouse anti Ki67 antibody | Vision Biosystems | NCL-Ki67-MM1 | 1:300 |
| Mouse anti NeuN antibody | Chemicon (Millipore) | MAB377 | 1:500 |
| Species specific secondary antibodies | Jackson Immunoresearch | ||
| Normal Goat Serum (NGS) | 5% | ||
| Triton X-100 | 0.10% | ||
| Mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size | Fisher Scientific | PICM03050 | |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Ethanol | |||
| 95% O2 5% CO2 gas mix | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| Sterile six well plates | |||
| Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas | |||
| Manual or automatic tissue chopper | |||
| Razor blades | |||
| Disposable transfer pipettes | |||
| 35mm and 60mm sterile Petri dishes | |||
| Stereomicroscope | |||
| Inverted Phase Microscope | |||
| Laminar Flow Hood | |||
| Tissue Culture Incubator | |||
| Inverted Fluorescence Microcope | |||
References
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), (1991).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures for long-term live imaging. Nature Protocols. 1 (3), 1165-1171 (2006).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Neuroscience. 7 (2), (2004).
- Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures. Journal of Visualized Experiments JoVE. (61), (2012).
- Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of Visualized Experiments JoVE. (6), e235 (2007).
- Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 10 (1), 9-22 (2009).
- Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
- Bin, J. M., Leong, S. Y., Bull, S. -J., Antel, J. P., Kennedy, T. E. Oligodendrocyte precursor cell transplantation into organotypic cerebellar shiverer slices: a model to study myelination and myelin maintenance. PloS one. 7 (7), (2012).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78 (2), 157-166 (2004).
- Harrer, M. D., von Budingen, H. C., et al. Live imaging of remyelination after antibody-mediated demyelination in an ex model for immune mediated CNS damage. Experimental Neurology. 216 (2), 431-438 (2009).
- Fancy, S. P. J., Harrington, E. P., et al. Axin2 as regulatory and therapeutic target in newborn brain injury and remyelination. Nature Neuroscience. 14 (8), 1009-1016 (2011).
- Zhu, X., Hill, R. A., Dietrich, D., Komitova, M., Suzuki, R., Nishiyama, A. Age-dependent fate and lineage restriction of single NG2 cells. Development. 138 (4), 745-753 (2011).
- Hill, R. A., Patel, K. D., Medved, J., Reiss, A. M., Nishiyama, A. NG2 Cells in White Matter But Not Gray Matter Proliferate in Response to PDGF. Journal of Neuroscience. 33 (36), 14558-14566 (2013).
- Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
- Novak, A., Guo, C., Yang, W., Nagy, A., Lobe, C. G. Z/EG, a double reporter mouse line that expresses enhanced green fluorescent protein upon Cre-mediated excision. Genesis. 28 (3-4), 147-155 (2000).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
- Hirrlinger, P. G., Scheller, A., et al. Expression of reef coral fluorescent proteins in the central nervous system of transgenic mice. Molecular and Cellular Neuroscience. 30 (3), 291-303 (2005).
- Nave, K. -A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Rivers, L. E., Young, K. M., et al. PDGFRA/NG2 glia generate myelinating oligodendrocytes and piriform projection neurons in adult mice. Nature Neuroscience. 11 (12), 1392-1401 (2008).
- Dimou, L., Simon, C., Kirchhoff, F., Takebayashi, H., Gotz, M. Progeny of Olig2-expressing progenitors in the gray and white matter of the adult mouse cerebral cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (41), 10434-10442 (2008).
- Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration. Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).
- Ioannidou, K., Anderson, K. I., Strachan, D., Edgar, J. M., Barnett, S. C. Time-lapse imaging of the dynamics of CNS glial-axonal interactions in vitro and ex vivo. PloS one. 7 (1), e30775 (2012).
- Ghoumari, A. M., Baulieu, E. E., Schumacher, M. Progesterone increases oligodendroglial cell proliferation in rat cerebellar slice cultures. Neuroscience. 135 (1), 47-58 (2005).
- Azim, K., Butt, A. M. GSK3β negatively regulates oligodendrocyte differentiation and myelination in vivo. Glia. 59 (4), 540-553 (2011).
- Hussain, R., El-Etr, M., et al. Progesterone and nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. 152 (10), 3820-3831 (2011).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Lubetzki, C., Demerens, C., et al. Even in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (14), 6820-6824 (1993).
- Demerens, C., Stankoff, B., et al. Induction of myelination in the central nervous system by electrical activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (18), 9887-9892 (1996).
- Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
- Stevens, B., Tanner, S., Fields, R. D. Control of myelination by specific patterns of neural impulses. The Journal of Neuroscience. 18 (22), 9303-9311 (1998).
- Stevens, B., Porta, S., Haak, L. L., Gallo, V., Fields, R. D. Adenosine: a neuron-glial transmitter promoting myelination in the CNS in response to action potentials. Neuron. 36 (5), 855-868 (2002).
- Wake, H., Lee, P. R., Fields, R. D. Control of local protein synthesis and initial events in myelination by action potentials. Science. 333 (6049), New York, N.Y 1647-1651 (2011).
- Rosenberg, S. S., Kelland, E. E., Tokar, E., De la Torre, A. R., Chan, J. R. The geometric and spatial constraints of the microenvironment induce oligodendrocyte differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14662-14667 (2008).
