Abstract
NG2 uttrykkende celler (polydendrocytes, oligodendrocyte forløper-celler) er de fjerde store glial cellepopulasjon i det sentrale nervesystemet. Under embryonal og postnatal utvikling de aktivt spre og generere myelinating oligodendrocytter. Disse cellene har ofte vært studert i primær dissosiert kulturer, nevroner cocultures, og i fast vev. Bruke nylig tilgjengelige transgene mus linjer skive kultur-systemer kan brukes til å undersøke spredning og differensiering av oligodendrocyte avstamning celler i både grå og hvit substans regioner av brain og lillehjernen. Skive kulturer er forberedt fra tidlig postnatal mus og holdes i kultur i opptil 1 måned. Disse skiver kan avbildes flere ganger i løpet av kulturen for å undersøke cellulær oppførsel og interaksjoner. Denne metoden gjør det mulig visualisering av NG2 celledeling og trappene til oligodendrocyte differensiering samtidig som detaljert analyse av region-avhengigeent NG2 celle og oligodendrocyte funksjonelle heterogenitet. Dette er en kraftfull teknikk som kan brukes for å undersøke de indre og ytre signaler som påvirker disse cellene med tiden, i et cellulært miljø som er svært lik den som finnes in vivo.
Introduction
Organoytpic skive kulturer i det sentrale nervesystemet har vist seg å være svært nyttig for å studere nervecellen og glial cellebiologi i en semiintact system 1 - 4. Disse kulturene er relativt enkle å adoptere og beholde mange fordelene med primær dissociated cellekulturer som manipulering av det ekstracellulære miljøet og enkel tilgang for gjentatt langsiktig levende celle bildebehandling og elektrofysiologiske opptak 5-9. I tillegg skive kulturer opprett 3-dimensjonale vev cytoarchitecture, regional neural-tilkobling, og de fleste store celletyper som er tilstede i systemet. Disse egenskapene gjør disse kulturene et unikt og praktisk system for å undersøke enkelt celle atferd og fysiologi med mobilnettet og miljømessige interaksjoner.
NG2 celler er en befolkning på gliacellene i pattedyrs sentrale nervesystemet som fortsetter å spre seg og generere myelinating oligodendrocytter under embryonal og postnatal utvikling 10. De har blitt grundig studert i dissosiert primære cellekulturer, og ny utvikling av transgene mus linjer med NG2 celle-spesifikke uttrykk for fluorescerende proteiner har tilrettelagt in vivo skjebne kartlegging og elektrofysiologiske opptak i akutte slice forberedelser. Selv med disse studiene, er lite kjent om de timelige dynamikken i NG2 celleproliferasjon og oligodendrocyte differensiering. Selv dissosierte cellekultur er mye brukt for den relative innretningen i farmakologiske og genetiske manipulasjoner, er det ikke egnet for utspørrende funksjonelle forskjeller i disse celler i forskjellige områder av hjernen, spesielt når det er ønskelig å opprettholde sammenhengen av det cellulære mikromiljø. Skive kulturer gir en enkel alternativ som er mottagelig for farmakologiske manipulasjoner og har blitt brukt til å undersøke oligodendrocyte myelinisering 11,12, celleular respons etter Lysolecitin (LPC) eller antistoff indusert demyelination 13,14, og induksjon av remyelination via farmakologisk behandling 15.
En metode for å undersøke og opptre live bildebehandling og fast vev (eller postfixation) analyse av NG2 celleproliferasjon og oligodendrocyte differensiering i organotypic skive kulturer tatt fra både brain og lillehjernen er beskrevet. Dette er en effektiv metode som kan brukes til å studere den celle skjebnen til enkelt NG2 celler etter delingen 16 og for å oppdage region-og aldersavhengige forskjeller i vekstfaktor indusert NG2 celleproliferasjon 17. Denne relativt enkle teknikk er allment tilgjengelig for videre undersøke celle iboende og / eller miljø mekanismene som regulerer fysiologien av disse gliaceller og deres respons for neuronal aktivitet eller myelin skade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle dyr prosedyrer følger retningslinjene og har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité (IACUC) ved University of Connecticut.
MERK: For disse eksperimentene konstitutive NG2cre 18 (JAX # 008533) og induserbare NG2creER 16 (JAX # 008538) transgene mus krysset til Z / EG 19 (JAX # 003920) eller gtRosa26: YFP reporter 20 (JAX # 006148) linjer henholdsvis ble brukt til bilde NG2 celler og deres avkom. Til bilde modne oligodendrocytter ble PLPDsRed transgene mus 21 brukes. For konsistent overlevelse, kan skivene være isolert fra mus opp til postnatal dag 10 fra både forhjernen og cerebellum.
1. Skjær Forberedelse
- I en kultur hette, plasserer vevskulturstudier innstikk i seks brønners plater og tilsett 1 ml skive kultur medium (oppskrift i reagenser avsnitt). Sett platene i cellekulturinkubator ved 37 ° C med 5% CO2 i minst 2 timer før disseksjon.
- Sterilisere alle verktøy og vev chopper med 70% etanol.
- Boble disseksjon buffer (oppskrift i reagenser seksjon) med 95% O-2, 5% CO 2 på is i minst 15 min før starten av disseksjon.
- Anesthetize museunger ved å plassere dem på is i 5-10 min i henhold til godkjente dyre protokoller. Fastslå den aktuelle anestesidybden ved å bekrefte at musene ikke svare på halen og tå klemming.
- Halshogge dyr med skarpe sakser følgende dyreprotokoller. Raskt fjerne skallen over brain og lillehjernen ved først å lage en sagittal kutt fulgt av lateral snitt, ved hjelp av steriliserte verktøy. Skjær hjernenerver fra den ventrale overflaten av hjernen og lillehjernen ved forsiktig rullende vevet til siden.
- Plasser vev i et sterilt 35 mm skål med iskald buffer oksygenert disseksjon.
- Ved hjelp av et barberblad, bryte lillehjernen og brain. Deretter lage en mid-sagittal kutt through forhjernen og lillehjernen, skille halvkuler.
- Skjær 300 mikrometer tykke koronale og sagittal deler av forhjernen og lillehjernen med en manuell vev chopper. MERK: En manuell vev chopper tillater rask behandling fra disseksjon til kultur inkubasjon uten behov for agarose innebygging. En vibratome kan også brukes som beskrevet tidligere ni.
- Overfør atskilt skivene i ferske boblet kaldt disseksjon buffer på is.
- Bruk små dissekere eller veier spatler å skille enkelte kapitlene og overføre dem til preinkuberes seks brønn retter med kultur inserts.
- Fjern eventuelle overskytende disseksjon buffer fra overflaten av kulturen innlegget ved hjelp av en engangsoverføring pipette eller en P 200 pipettespiss. To til tre eller tre forhjerne cerebellare skiver kan plasseres på en kulturinnsats.
MERK: For konsistente resultater med forhjerne kulturer, er det ideelt å ta skiver spenner over anterior en tredjedel av corpus callosum(Figur 1A) for å studere både grå og hvit substans regioner i samme skive. Hvert dyr gir vanligvis seks forhjerne skiver og seks lillehjernen skiver. - Plasser de seks brønners plater i kuvøse og erstatte stykket medium med 1 ml skive medium 1 dag etter skive forberedelse og deretter annenhver dag frem til skive fiksering.
- Avhengig av eksperimentet, bruker skiver etter 5-7 dager i kultur. Bruk bare skiver som blir gjennomsiktig etter de første dagene og kast de som har ujevn ugjennomsiktig regioner. MERK: Opaque regioner i skiver er synlige ved øyet og vises som en klump av mørke celler under fase kontrast. Etter at teknikken har blitt mastret, døde ugjennomsiktig skiver oppstår sjelden, på mindre enn 1-5% av skiver.
2. Time-Lapse Imaging av NG2 celledeling og oligodendrocyte Differensiering
MERK: For å utføre time lapse avbildning av NG2 celleproliferasjon og differensiering vi bruker NG2cre: ZEG mus 16som uttrykker EGFP i NG2 celler og deres avkom (figur 1C-E). Reporter ekspresjon i denne linjen er tilstrekkelig robust til å oppnå levende bilder av GFP + celler i stykker umiddelbart etter snitting i en tidsperiode på minst fire uker. Den klareste bilder er oppnådd etter den første tynning periode på skiven, noe som skjer i løpet av de første 3-5 dager i kultur.
- Gjennom hele forsøket, holder skivene i en cellekulturinkubator ved 37 ° C og fjerne bare i korte tidsperioder (mindre enn 15 min per skive), og holder lokket på seks brønns plate mens avbildning.
- Ved hjelp av en invertert fluorescens mikroskop utstyrt med et digitalt kamera, ta bilder på første gang punktet med en 10X objektiv. MERK: Første gang punktene vil variere etter eksperimentet og kan være den dagen da skivene var forberedt eller helst punkt etter.
- Ta bilder fra flere regioner på tidspunktet punkt en i både grå og hvit substans områder av stykket. Note the region avbildes ved spesifikke landemerker i stykket, og ved å kartlegge bilde sted på et skjematisk som kan brukes for etterfølgende avbildnings sesjoner. Nyttige landemerker kan inkludere kantene av skiver og / eller orientering av hvit substans traktater. Bilde 4-8 steder på hver skive på hvert tidspunkt.
- Fang etterfølgende bilder med et intervall på 4-6 timer hvis undersøke NG2 celledeling og oligodendrocyte differensiering, helst over 5-7 dager.
- Fange et endelig bilde av alle regioner og fikse skiver umiddelbart. Tilsett 1 ml fiksativ (4% PFA med 0,1 M L-lysin 0,01 M natrium-meta-perjodat) til bunnen av innsatsen kultur, deretter legge ytterligere 1 ml på toppen av skivene. Pass på å ikke sprute fiksativ direkte på skive som det kan løsne fra membranen. Fest vev i 30 min og gå videre med immunhistokjemi hjelp utviklingsstadiet spesifikke markører som beskrevet i § 4.
- Vask skiver med 0,2 M natriumfosfat-buffer 3 x 10 minn. Lagre eventuelt skiver ved 4 ° C i 0,2 M natriumfosfatbuffer i 1-3 dager før farging men ideelt utføre farging innen 24 timer. Fortsett med immunhistokjemi som beskrevet nedenfor i punkt 4 for å bestemme hvor stor andel av celler som har differensierte inn oligodendrocytter (figur 2D-F).
3. Fate Kartlegging av NG2 celle Progeny Bruke induserbar Reporter transgene mus i skive kulturer
MERK: For å spore skjebnen til NG2 celler fra et bestemt tidspunkt i kulturen, induserbare NG2creER: kan YFP transgene mus brukes.
- Fremkall Cre rekombinasjon og reporter ekspresjon ved tilsetning av 100 nM 4OHT oppløst i etanol til kulturmediet. MERK: Reporter positive celler skal vises i løpet av 1-2 dager på en induksjons effektivitet på ~ 20-25% YFP + NG2 + / NG2 + celler og på dette tidspunktet vil alle være celler på NG2 cellestadiet (figur 2A-C)
- Fikse og vaske skives ved ulike tidspunkt etter ulike manipulasjoner (beskrevet i pkt 2.5 og 2.6).
4. Slice Immunhistokjemi
- Skjær membraner med skiver festet av innleggene ved hjelp av en skalpell.
- Overfør skiver til individuelle brønner i en 24 brønns plate inneholdende fosfatbufret saltoppløsning (PBS) under anvendelse av et sett av pinsetter, tar seg ikke å forstyrre sammensetningen av stykket når plukke opp membranen.
- Overfør skivene til en 24 brønn plate med blokkeringsoppløsning inneholdende 5% normalt geiteserum (NGS) og 0,1% Triton-X100 i PBS i 1 time.
- Inkuber skiver i primær antistoff O / N i 5% NGS i PBS ved 4 ° C. For å identifisere celler i NG2 cellestadiet, bruker antistoffer mot NG2 og PDGFRα. For å identifisere differensierte oligodendrocytter, bruke et antistoff til adenomatøs polypose coli antigen (APC; klone CC1).
- På den andre dagen vask skiver i PBS 3 x15 min, deretter inkuberes i videregående Antibodør i 5% NGS i PBS i 1 time ved RT. Vask skiver i PBS 3 x15 min og montere på lysbilder. Monter med stykker opp og membranen som vender mot glide slik at membranen ikke vil være mellom målet og vevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksempler på representative data er gitt nedenfor som er oppnådd ved bruk skive kulturer fra både brain og lillehjernen av P8 NG2cre: ZEG, NG2creER: YFP og PLPDsRed transgene mus linjer. NG2 celler kan avbildes over dager i forhjerne og lillehjernen skiver (figur 1B-D, Video 1) og fenotype av disse cellene kan bestemmes etter fiksering og farging med NG2 og CC1 antistoffer (Figur 1E). I tillegg til live bildebehandling, kan celleproliferasjon også vurderes ved hjelp av immunhistokjemisk farging for celleproliferasjon markører som Ki67 (figur 1F). Disse dataene gir mulighet for detaljert analyse av de timelige dynamikken i oligodendrocyte differensiering etter NG2 celledeling på en enkelt celle basis. Fate kartlegging av NG2 celler kan utføres etter induksjon av CRE rekombinasjon i skiver med 4OHT i NG2creER: YFP mus (figur 2). YFP reporter-uttrykke NG2 + celler var found i kulturer i to dager etter tilsetning av 4OHT til kulturmediet (figur 2A). Seks dager etter 4OHT induksjon, hadde en andel av YFP + celler differensiert i CC1 + oligodendrocytter (Figur 2b). Disse dataene viser muligheten for å utføre skjebne kartlegging av NG2 celler i skiver hvor ekstracellulære miljøet kan bli manipulert til å teste effekten av farmakologiske midler eller ulike fornærmelser om skjebnen til NG2 celler. Forskjellige konsentrasjoner av 4OHT kan brukes for å oppnå forskjellige grader av cre rekombinasjon. For eksempel forårsaker eksponering til 100 nM 4OHT i 2 dager reporter ekspresjon i omtrent 20-25% av alle NG2 uttrykker cellene mens 1 iiM 4OHT resulterer i omtrent 60-70% rekombinasjon effektivitet. Endelig er omfattende myelin stede i disse kulturene og myelinating oligodendrocytter kan avbildes i levende og faste skiver ved hjelp PLPDsRed transgene mus (figur 3, Video 2).
Figur 1. Skjær kultur metode for langsiktig avbildning av NG2 celleproliferasjon og differensiering (AB) Skjematisk skildrer isolering av forhjernen og lillehjernen skiver (A) og påfølgende dyrking og time-lapse avbildning ved hjelp skive kultur inserts (B). (C ) Avbildning skisserte NG2 celledeling og påfølgende oligodendrocyte differensiering i NG2cre:. ZEG transgene mus (D) eksempel bilder anskaffet fra kortikale regioner i NG2cre: ZEG mus som viser et enkelt GFP + celle (piler) dividere to ganger over en periode på 122 timer, tid avbildet i øverste høyre hjørne som timer etter starten av bilde eksperiment. (E) Fiksering og farging med anti-NG2 og CC1 antistoffer av samme skive avslører at den avbildede dividing celler resulterte i tre NG2 + celler (piler). (F) Eksempel bilde som viser to Ki67 + NG2 + celler i en kortikal skive kultur. (G) Eksempel bilde som viser NG2 + celler (pilspisser) og deres prosesser sammenvevd med Neun + nevrale kjerner i en kortikal skive kultur. Scale barer 25 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Induksjon av YFP uttrykk å spore skjebnen til NG2 celler i forhjernen skive kulturer (AB) Bilder tatt av corpus callosum regionen brain skive kulturer fra NG2creER: YFP mus behandlet med 4OHT for 24 timer og deretter til venstre i kultur for to dager (A) eller 6 dager (B) (A) eller CC1 og YFP (B) viser differensiering av reporter positive NG2 celler i oligodendrocytter mens i kultur 6 dager etter CRE rekombinasjon (pil). Scale barer 25 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Imaging oligodendrocytter i skive kulturer fra PLPDsRed transgene mus. (A) Skjematisk skildrer isolering, dyrking og avbildning av lillehjernen skiver fra PLPDsRed transgene mus. (B) Bilde tatt fra en fast cerebellum skive etter 5 dager in vitro viser calbindin + ( cyan) Purkinje nevroner med myelinatedmyelin basisk protein + (MBP) (grønn) axoner rager inn i hvit substans regioner av stykket. Scale Bar 25 mikrometer. (C) lav forstørrelse bilder tatt fra samme region annenhver dag den indikerte i timer i cerebellum skive kulturer fra PLPDsRed mus ganger. Scale Bar 100 mikrometer. (D) lav forstørrelse bilde tatt fra en fast PLPDsRed skive kultur viser MBP uttrykk i hvit substans regioner hvor DsRed + celler er konsentrert. Scale Bar 100 mikrometer. (E) Høy forstørrelse bilde tatt fra en fast PLPDsRed skive kultur viser enkelt DsRed + oligodendrocytter med MBP + prosesser. Scale Bar 20 mikrometer. (F) Time-lapse sekvens tatt fra en PLPDsRed cerebellum skive som viser relativt stabile cellelegemer over 48 hr bildebehandling session, tid angitt i øvre høyre i timer. Scale Bar 25 mikrometer. PleaSE klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1. Levende Imaging av NG2 celledeling i en kortikal skive kultur representant time lapse-sekvens som viser flere celledelinger i en kortikal skive kultur tatt fra en NG2cre:. ZEG transgen mus. Video vises på fem bilder per sekund, montasje av bilder vist i figur 1. (Se "Video_1.mov" under Nedlastinger)
Video 2. Live-avbildning av oligodendrocytter i lillehjernen skive kulturer Representant time lapse-sekvens som viser små endringer i oligodendrocyte morfologi (pil) fotografert i løpet av 48 timer i et cerebellum skive tatt fra en PLPDsRed transgen mus. Video vises på 3 bilder per sekund, montasje av bildene som vises i figur 3. (Se "Video_2.mov" under Nedlastinger)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Myelinisering i sentralnervesystemet er vesentlig for effektiv kommunikasjon og aksonal neuronal overlevelse 22. NG2 celler produseres kontinuerlig myelinating oligodendrocytter inn i voksenlivet og samtidig opprettholde en fastboende befolkning i de fleste områder av hjernen 16,23 - 25. Noen genetiske og molekylære mekanismene som regulerer differensiering av disse cellene er blitt beskrevet, men mye gjenstår å bli oppdaget. Organotypic skive kulturer er et praktisk verktøy for å undersøke disse mekanismene på grunn av deres unike egenskaper for å opprettholde anatomiske regioner, enkel manipulasjon av det ekstracellulære miljøet, robust myelinisering, og tilstedeværelsen av alle de store celletyper. Disse egenskapene lette etterforskningen av korte og langsiktige interaksjoner mellom NG2 celler, oligodendrocytter og axoner 11,26. I tillegg er celletransplantasjon relativt enkel å utføre, og kan bli brukt til å undersøke region avhengig differences i celle atferd 17. Videre kan farmakologisk behandling legges til kultur medium for å undersøke molekylære mekanismer som påvirker NG2 celleproliferasjon og / eller differensiering i normal 17,27,28 og demyelinated kulturer 15,29. Endelig, er det teknisk mulig å bruke skive kulturer for å utføre skjermer for høy gjennomstrømning analyse av forbindelser som direkte NG2 celler til å formere seg eller skille, eventuelt også etter en demyelinerende fornærmelse 30.
Dagens metoder for å undersøke oligodendrocyte avstamning celler og deres samspill med axoner i en kontrollert kultur innstillingsmulighetene er co-kulturer med dissociated dorsal root ganglion (DRG) eller embryonale kortikale nevroner og NG2 celler 31,32, som var basert på originale forberedelser utviklet for å undersøke DRG -Schwann celle interaksjoner 33. Disse kulturer har blitt brukt til å undersøke grunnleggende egenskapene axon og oligodendrocyteavstamning celle interaksjoner blant neuronal aktivitet-avhengig signalisering for å indusere differensiering og myelin produksjon 32,34 - 36, i tillegg til andre spørsmål som for eksempel avhengighet av axon diameter og NG2 celletetthet kontrollerende proliferasjon og utbruddet av 37 differensiering. Mens disse coculture systemer er ideelle for å ta opp slike spørsmål, direkte korrelasjon og søknad til in vivo situasjonen er ikke alltid klart. Som nevnt tidligere, organotypic skive kulturer gir en unik tilstand av å opprettholde mange av de lokale nevrale forbindelser og tredimensjonal cytoarchitecture som er tapt i co-kultur preparater av dissosiert celler. Videre motsetning organotypic skive kulturer, co-kultur systemer av dissosiert celler ofte ikke inkludere andre gliacellene og ekstracellulære matrise molekyler som har vist seg å spille sentrale roller i utvikling, vedlikehold og fysiologi av NG2 celler, oligodendrocytter, Og myelin. Med den dramatiske veksten i rekke verktøy tilgjengelig for spesifikk merking og manipulering av forskjellige cellepopulasjoner med virale vektorer og transgene dyr, langsiktig bildebehandling og skjebne kartlegging i organotypic skive kulturer skulle vise seg å være en kraftfull teknikk for etterforskningen av NG2 celle spredning, differensiering og oligodendrocyte myelinisering.
Flere kritiske trinnene bør utføres når du utfører disse eksperimentene for å sikre skive overlevelse og data reproduserbarhet. Først, for å generere friske skiver, snitting og isolering av skiver bør utføres så raskt som mulig og i iskald buffer disseksjon. Sekund, mens automatisert bildeposisjonen oppkjøpet med en motorisert scenen på fluorescens mikroskop kan være nyttig, er det mange faktorer som kan forstyrre den nøyaktige flytting av regionene fotografert og manuell gjentatt oppkjøp er nødvendig for å få konsekvent pålitelig bilder over multiple dager. Dette er særlig nødvendig dersom skivene er holdt i en cellekulturinkubator mellom avbildnings sesjoner og ikke i en fase-top inkubator. Tredje, under skive fiksering, flekker, og montering er det svært viktig å håndtere skiver forsiktig som enhver forstyrrelse av vev vil resultere i manglende evne til å flytte levende fotografert regioner og celler. Det er ingen spesifikke endringer i tradisjonelle metoder som brukes for skive kultur preparater som brukes til studier av nevroner og astrocytter.
Det er flere begrensninger i skive dyrkningsmetode som må tas i betraktning. Astrocytter, mikroglia og NG2 celler er kjent for å reagere på CNS-skade med økt proliferasjon ved skadestedet og dannelsen av en glial arr. Prosessen med utarbeidelse av skiver resulterer i noen omorganisering og en innledende reaktiv glial respons fra disse cellene. NG2 celleproliferasjon prisene tilbake til nivåer tilsvarende det som er rapportert in vivo for matchetstadier av utviklingen etter flere dager i kultur Men økt spredning priser og innledende reaktiv fenotype av disse cellene må vurderes når tolke dataene. Tilstedeværelsen av hesteserum i dyrkningsmediet kan endre NG2 celleproliferasjon og bør vurderes ved tolkning av funn av noe eksperiment. I tillegg til dette, mens det er spontan neuronal aktivitet, sanseinntrykk og lang rekkevidde forbindelser mellom nerveceller mangler, noe som kan føre til endret nerveaktiviten stykket. Endelig er utfordrende uten bruk av spesifikke promoter drevet virale vektorer eller transgene mus, celletypespesifikke genetiske manipulasjoner innen skive kultursystemer. Mens disse begrensningene bør vurderes ved utforming av eksperimenter, skive kulturer er et unikt system som kan benyttes til å få ny innsikt i spørsmål som ikke kan besvares med dissociated cellekulturer eller i intakt dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slice Culture Medium | |||
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11090 | 50% |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175 | 25% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | 25mM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 1mM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 1mg/L |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 0.4mM |
| Horse Serum | Hyclone | SH30074.03 | 25% |
| Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius | |||
| Dissection Buffer | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 124mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.004mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | 1.25mM |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M7506 | 4.004mM |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 2mM |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | 26mM |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | 10mM |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 2.0mM |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | 0.075mM |
| Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use | |||
| Other Reagents and Supplies | |||
| 4-hydroxy tamoxifen (4OHT) | Sigma-Aldrich | H7904 | 100nM |
| Paraformaldehyde (PFA) | EM Sciences | 19200 | 4% |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L-6027 | 0.1M |
| Sodium Metaperiodate | Sigma-Aldrich | S-1878 | 0.01M |
| Rabbit anti NG2 antibody | Chemicon (Millipore) | AB5320 | 1:500 |
| Mouse anti CC1 antibody | Calbiochem (Millipore) | OP80 | 1:200 |
| Mouse anti Ki67 antibody | Vision Biosystems | NCL-Ki67-MM1 | 1:300 |
| Mouse anti NeuN antibody | Chemicon (Millipore) | MAB377 | 1:500 |
| Species specific secondary antibodies | Jackson Immunoresearch | ||
| Normal Goat Serum (NGS) | 5% | ||
| Triton X-100 | 0.10% | ||
| Mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size | Fisher Scientific | PICM03050 | |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Ethanol | |||
| 95% O2 5% CO2 gas mix | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| Sterile six well plates | |||
| Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas | |||
| Manual or automatic tissue chopper | |||
| Razor blades | |||
| Disposable transfer pipettes | |||
| 35mm and 60mm sterile Petri dishes | |||
| Stereomicroscope | |||
| Inverted Phase Microscope | |||
| Laminar Flow Hood | |||
| Tissue Culture Incubator | |||
| Inverted Fluorescence Microcope | |||
References
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), (1991).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures for long-term live imaging. Nature Protocols. 1 (3), 1165-1171 (2006).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Neuroscience. 7 (2), (2004).
- Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures. Journal of Visualized Experiments JoVE. (61), (2012).
- Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of Visualized Experiments JoVE. (6), e235 (2007).
- Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 10 (1), 9-22 (2009).
- Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
- Bin, J. M., Leong, S. Y., Bull, S. -J., Antel, J. P., Kennedy, T. E. Oligodendrocyte precursor cell transplantation into organotypic cerebellar shiverer slices: a model to study myelination and myelin maintenance. PloS one. 7 (7), (2012).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78 (2), 157-166 (2004).
- Harrer, M. D., von Budingen, H. C., et al. Live imaging of remyelination after antibody-mediated demyelination in an ex model for immune mediated CNS damage. Experimental Neurology. 216 (2), 431-438 (2009).
- Fancy, S. P. J., Harrington, E. P., et al. Axin2 as regulatory and therapeutic target in newborn brain injury and remyelination. Nature Neuroscience. 14 (8), 1009-1016 (2011).
- Zhu, X., Hill, R. A., Dietrich, D., Komitova, M., Suzuki, R., Nishiyama, A. Age-dependent fate and lineage restriction of single NG2 cells. Development. 138 (4), 745-753 (2011).
- Hill, R. A., Patel, K. D., Medved, J., Reiss, A. M., Nishiyama, A. NG2 Cells in White Matter But Not Gray Matter Proliferate in Response to PDGF. Journal of Neuroscience. 33 (36), 14558-14566 (2013).
- Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
- Novak, A., Guo, C., Yang, W., Nagy, A., Lobe, C. G. Z/EG, a double reporter mouse line that expresses enhanced green fluorescent protein upon Cre-mediated excision. Genesis. 28 (3-4), 147-155 (2000).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
- Hirrlinger, P. G., Scheller, A., et al. Expression of reef coral fluorescent proteins in the central nervous system of transgenic mice. Molecular and Cellular Neuroscience. 30 (3), 291-303 (2005).
- Nave, K. -A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Rivers, L. E., Young, K. M., et al. PDGFRA/NG2 glia generate myelinating oligodendrocytes and piriform projection neurons in adult mice. Nature Neuroscience. 11 (12), 1392-1401 (2008).
- Dimou, L., Simon, C., Kirchhoff, F., Takebayashi, H., Gotz, M. Progeny of Olig2-expressing progenitors in the gray and white matter of the adult mouse cerebral cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (41), 10434-10442 (2008).
- Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration. Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).
- Ioannidou, K., Anderson, K. I., Strachan, D., Edgar, J. M., Barnett, S. C. Time-lapse imaging of the dynamics of CNS glial-axonal interactions in vitro and ex vivo. PloS one. 7 (1), e30775 (2012).
- Ghoumari, A. M., Baulieu, E. E., Schumacher, M. Progesterone increases oligodendroglial cell proliferation in rat cerebellar slice cultures. Neuroscience. 135 (1), 47-58 (2005).
- Azim, K., Butt, A. M. GSK3β negatively regulates oligodendrocyte differentiation and myelination in vivo. Glia. 59 (4), 540-553 (2011).
- Hussain, R., El-Etr, M., et al. Progesterone and nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. 152 (10), 3820-3831 (2011).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Lubetzki, C., Demerens, C., et al. Even in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (14), 6820-6824 (1993).
- Demerens, C., Stankoff, B., et al. Induction of myelination in the central nervous system by electrical activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (18), 9887-9892 (1996).
- Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
- Stevens, B., Tanner, S., Fields, R. D. Control of myelination by specific patterns of neural impulses. The Journal of Neuroscience. 18 (22), 9303-9311 (1998).
- Stevens, B., Porta, S., Haak, L. L., Gallo, V., Fields, R. D. Adenosine: a neuron-glial transmitter promoting myelination in the CNS in response to action potentials. Neuron. 36 (5), 855-868 (2002).
- Wake, H., Lee, P. R., Fields, R. D. Control of local protein synthesis and initial events in myelination by action potentials. Science. 333 (6049), New York, N.Y 1647-1651 (2011).
- Rosenberg, S. S., Kelland, E. E., Tokar, E., De la Torre, A. R., Chan, J. R. The geometric and spatial constraints of the microenvironment induce oligodendrocyte differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14662-14667 (2008).
