用于在相当于人类发育全部三个孕期阶段对小鼠进行酒精暴露的蒸气舱构建方法

摘要

我们展示了利用 readily available 的材料构建酒精蒸气室的方法，该装置可同时容纳6个鼠笼。我们进一步描述了其在小鼠胎儿酒精暴露模型中的应用，该模型相当于人类妊娠的全部3 个孕期。该实验范式在妊娠期以及出生后第1至12天对动物进行暴露。

摘要

发育期间接触酒精可能导致一系列形态学和行为学异常，这些异常统称为胎儿酒精谱系障碍（Fetal Alcohol Spectrum Disorders, FASDs）。在该谱系中最严重的情况是胎儿酒精综合征（Fetal Alcohol Syndrome, FAS），其特征为生长迟缓、颅面畸形以及神经行为缺陷。包括啮齿类动物在内的动物模型研究已阐明了FASDs病理生理过程中涉及的许多分子和细胞机制。向妊娠期啮齿类动物施用乙醇已被用于模拟人类在妊娠第一和第二孕期的酒精暴露。人类妊娠第三孕期的乙醇摄入则通过新生啮齿类动物进行建模。然而，目前极少有啮齿类研究对相当于人类妊娠全部三个孕期的乙醇暴露效应进行表征，而这种暴露模式在妊娠女性中较为常见。本文中，我们展示了如何利用易得的材料构建可容纳多达六个标准小鼠笼的挥发室。我们描述了一种挥发室实验范式，可用于在全部三个孕期模拟乙醇暴露，且对动物干预极少。我们的研究表明，妊娠母鼠对乙醇产生了显著的代谢耐受性。然而，新生小鼠并未产生代谢耐受，且胎儿数量、胎儿体重、胎盘重量、每窝仔鼠数量、每窝死产数量以及仔鼠体重均未受到乙醇暴露的显著影响。该实验范式的一个重要优势在于其适用于基因修饰小鼠的研究。此外，该范式最大限度减少了对动物的操作，而操作频繁是胎儿酒精研究中的一个主要混杂因素。

引言

孕期饮酒可能对胎儿造成伤害，导致多个器官和系统的持久性改变，显著降低受影响个体及其家庭的生活质量。据估计，在美国约有10%-30%的女性在怀孕期间饮酒，其中1%-8%存在暴饮行为^1,2。胎儿发育期间暴露于乙醇所引起的一系列效应统称为胎儿酒精谱系障碍（FASDs）。最近的估计表明，FASDs是一个重大的公共卫生问题，在美国的患病率高达2%-5%³。FASDs中最严重的表现形式是胎儿酒精综合征（FAS），其特征为生长迟缓、颅面异常以及神经行为缺陷，包括学习障碍。在美国，FAS的患病率估计为0.2%-0.7%³。目前可用于FASDs的治疗方法仅部分有效，而更有效疗法的开发受到对该复杂障碍谱系的细胞与分子机制理解不足的限制。

来自国家出生缺陷预防研究（NBDPS）的数据表明，孕妇饮酒最常见于妊娠早期^st 妊娠早期（在妊娠尚未被检测出时），随后在妊娠的后期阶段禁用 ²NBDPS 还发现，妊娠期间乙醇摄入的第二种最常见模式是在整个孕期的三个阶段均饮酒。²原因包括对胎儿乙醇暴露潜在危害的认识不足（即使在低剂量下）、产前保健获取受限、神经精神疾病既往史，以及乙醇滥用或依赖⁴有趣的是，国家出生缺陷预防研究（NBDPS）报告称，第三种最常见的消费模式是在孕早期完全禁酒^st 和 2^nd 3个孕期阶段，随....

方案

所有动物实验程序均经新墨西哥大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会批准。

1. 气相室组装

1. 使用圆锯或曲线锯按照视频中提供的尺寸切割聚碳酸酯板，用于制作箱体的顶部、底部、前部、后部、侧面和门（图1 和 表1）。
2. 使用圆锯或曲线锯在前板中央切割一个高8英寸、宽16英寸的开口。
3. 测量并标记铰链安装孔的位置，位置为将作为箱门的18英寸×10英寸聚碳酸酯板上。
4. 在门板上使用5/16英寸钻头钻出沉头孔，并使用3/16英寸钻头钻出螺钉孔。确保沉头孔位于门内侧，以便螺钉头嵌入。
5. 准备聚碳酸酯板以进行焊接。
6. 使用Weld-on #16将前板、后板和侧板组装到底板上。
7. 使用Weld-on #16密封各板之间的所有缝隙。
8. 使用Weld-on #16将顶板固定到位。
9. 使用夹具或厚重的教科书固定所有部件，直至焊缝完全固化。
10. 在前板上距开口下方1英寸处，安装一段1英寸×12英寸的聚碳酸酯条，用于连接门铰链。
11. 确保Weld-on固化时间至少为24小时。
12. 截取两段12英寸长的PEX管和一段1英寸长的PEX管。
13. 使用5/16英寸钻头，在每段12英寸长的PEX管的一端约1至2英寸处....

结果

图2A显示，怀孕小鼠及其新生后代在暴露舱内均接触了相对稳定的乙醇蒸气浓度，浓度范围为4-6 g/dl。图2B展示了怀孕小鼠血液乙醇浓度（BECs）随时间的变化情况。BECs采用基于标准乙醇脱氢酶的检测方法测定⁴⁸。在妊娠第5天（G5），暴露开始2小时后BECs迅速上升至约60 mM，并在4小时暴露期结束时达到峰值；暴露结束后再经过4小时，BECs逐渐下降至约12 mM。到妊娠第13-14天（G13-14），BECs显著降低至G5时检测水平的约60%。此外，BECs上升速度更慢，下降速度更快，表明乙醇在怀孕小鼠血液中的存留时间缩短。在接近分娩期（G18-20），BECs进一步降低至G5时水平的约30%。这些结果与怀孕小鼠体内对乙醇产生快速代谢耐受性的发育过程一致。图2C显示，新生后代暴露时的BECs接近30 mM。在这些动物中，BECs逐渐上升，在4小时暴露期结束时达到峰值，并在暴露结束后8小时逐渐恢复至基线水平。与怀孕母鼠不同的是，在新生期早期（P2）或晚期（P7-P12）暴露的新生小鼠之间，所测得的BECs水平无.......

讨论

本文详细描述了构建挥发性气体吸入舱的方法。建造这些吸入舱所需的材料和工具均可从多家商业供应商处轻松获得，且构建步骤相对简单。我们在此描述的系统不包含任何用于防止回流和混合的管路单向阀。我们在仅通空气的舱中未能检测到任何可测浓度的乙醇，表明乙醇未发生混合或倒流进入仅通空气的舱。应定期对仅通空气的舱进行乙醇蒸气检测（需注意，应在测试乙醇舱之前始终先测试空气舱，以避免呼气分析仪和/或注射器中残留乙醇蒸气的干扰）。理想情况下，应将吸入舱安置在动物饲养设施的专用房间内，以便在整个暴露实验期间持续安置小鼠笼具，避免运输小鼠，从而减少应激。该实验范式仅需配备通风出口的标准房间即可。然而，若房间与其他研究人员共用，则有必要将吸入舱置于带有独立隔间的房间内，以尽量减少其他动物接触乙醇气味。每个舱可容纳最多6个标准小鼠笼，因此相较于例如经口灌胃等方法，该方法劳动强度更低。

暴露范式可根据特定实验的需求轻松修改。可在相当于人类妊娠全部三个 trimester 的时期对动物进行乙醇暴露。需要注意的是，啮齿类动物发育阶段与人类发育的对应关系可能因所考虑的脑区以及所关注的发育过程（如神经发生、突触整合等）而有.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚碳酸酯 1/4" 清晰 48" × 24"	McMaster-Carr	8574K23	10
泡沫橡胶灯泡密封圈 3/8"w × 7/32"h	McMaster-Carr	93085K67	10 英尺
焊接式 #16	McMaster-Carr	7515A11	3
钢琴铰链 12" 长	McMaster-Carr	1658A11	2 × 1 英尺
标准压紧式快速夹钳	McMaster-Carr	5126A26	8
PEX 管 1/2"	McMaster-Carr	51275K88	10 英尺
带支管三通接头（黑色），每包10个	McMaster-Carr	5463K608	1
带刺插头接头（黑色）10个/包	McMaster-Carr	5462K79	1
带倒刺弯头管接头（黑色），10 个/包	McMaster-Carr	5463K596	1
3/8" 穿墙接头，管对螺纹管	McMaster-Carr	5463K851	1
Phillips 机用螺钉 4-40	McMaster-Carr	91772A112	1
4-40 机器螺钉六角螺母	McMaster-Carr	90480A005	1
面板安装式流量计 2-20	McMaster-Carr	41945K76	3
1,000 毫升过滤烧瓶，每包6个	VWR	89001-800	2
精密封口隔垫	VWR	89084-490	1
VWR 黑色橡胶塞 #8 单孔	VWR	59581-367	1
TUBE TYGON R3603 3/8X9/16 50'	VWR	89068-556	1
TUBE TYGON R3603 1/4X11/16 50'	VWR	89068-502	1
曝气石 P2120	VWR	32573-007	1
3/8" T型连接器 Pk 20	VWR	46600-060	1
VWR 锥形断路器，每包10个	VWR	46600-110	1
3/8 英寸软管接头带阀直通接头	Colder Products Company	HFCD17612	1
中等容量气泵	LMI 制造商	DB60L	1
Nexelate 36英寸线架"W X 24"D X 63"H	全球工业	T9A990135	1
茎杆万向轮套装（4个）5" 聚氨酯轮	全球工业	T9A500591	1