Summary
Vi viser konstruktionen af alkohol damp kamre ved hjælp af let tilgængelige materialer, der samtidig huser 6 mus bure. Vi beskriver deres anvendelse yderligere i en musemodel af føtal alkohol eksponering svarende til alle 3 trimester af graviditet. Dette paradigme udsætter dyr under drægtighed og postnatale dage 1-12.
Abstract
Indtagelse af alkohol under udvikling kan resultere i en konstellation af morfologiske og adfærdsmæssige abnormiteter, der er kollektivt kendt som Føtalt Alkohol Spectrum Disorders (FASDs). På det mest alvorlige ende af spektret er Føtalt Alkohol Syndrom (FAS), kendetegnet ved væksthæmning, craniofacial dysmorfologi og neurobehavioral underskud. Undersøgelser med dyremodeller, herunder gnavere, har belyst mange molekylære og cellulære mekanismer involveret i patofysiologien af FASDs. Ethanol administration til gravide gnavere er blevet brugt til at modellere menneskelig eksponering under første og andet trimester af graviditeten. Tredje trimester ethanol forbrug i mennesker er blevet modelleret ved hjælp af neonatale gnavere. Imidlertid har nogle gnavere karakteriseret effekten af ethanol eksponering under den svarer til alle tre trimester af graviditet, et mønster af eksponering, der er almindelig hos gravide kvinder. Her viser vi, hvordan man opbygger damp kamre fra let obtainable materialer, der kan hver rumme op til seks standard mus bure. Vi beskriver en damp kammer paradigme, der kan bruges til at modellere udsættelse for ethanol, med minimal håndtering, i alle tre trimester. Vores undersøgelser viser, at gravide dæmninger udviklet stor metabolisk tolerance over for ethanol. Men neonatale mus ikke udvikle metabolisk tolerance og antallet af fostre, fosterets vægt, placenta vægt, antal unger / kuld, antal døde unger / kuld, og ungerne blev ikke signifikant påvirket af ethanol eksponering. En vigtig fordel ved dette paradigme er dens anvendelighed til studier med genetisk modificerede mus. Derudover dette paradigme minimerer håndtering af dyrene, en stor forvirre i føtal alkohol forskning.
Introduction
Drinking under graviditeten kan skade fosteret, der forårsager vedvarende ændringer i mange organer og systemer, der væsentligt nedsætter livskvaliteten for de berørte personer og deres familier. Det anslås, at cirka 10-30% af kvinder drikker under graviditeten i USA, med 1-8% drikke i en binge mønster 1,2. Rækken af virkningerne af ethanol eksponering under fosterudviklingen er kollektivt kendt som føtale alkohol spektrum forstyrrelser (FASDs). De seneste skøn viser, at FASDs er et stort problem for folkesundheden med en prævalens så højt som 2-5% i US 3. De mere alvorlige manifestation af FASDs er Føtalt Alkohol Syndrom (FAS), som er karakteriseret ved væksthæmning, craniofaciale abnormiteter, og neurobehavioral underskud, herunder indlæringsvanskeligheder. Forekomsten af FAS er blevet anslået til at være 0,2-0,7% i US 3. De aktuelt tilgængelige behandlinger af FASDs kun er delvis effektiveog udvikling af mere effektive behandlinger er begrænset af dårlig forståelse af de cellulære og molekylære fundament af denne komplekse spektrum af lidelser.
Data fra de nationale Fødselsdefekter Prevention Study (NBDPS) viser, at gravide kvinder oftest drikker i løbet af 1. trimester, før graviditeten er blevet opdaget, efterfulgt af afholdenhed under senere stadier af drægtighedsperioden 2. Den NBDPS fandt også, at den anden mest almindelige mønster af ethanol forbrug under svangerskabet indebærer drikke i alle trimester af graviditeten 2. Årsagerne hertil er bl.a. mangel på bevidsthed om de potentielt skadelige virkninger af føtal ethanol eksponering (selv ved lave doser), begrænset adgang til prænatal pleje, positiv historie for neuropsykiatriske lidelser, og misbrug af eller afhængighed af ethanol 4.. Interessant NBDPS rapporterede, at den tredje mest almindelige forbrugsmønster involverede afholdenhed i 1
I et forsøg på at modellere de forskellige mønstre for ethanol forbrug observeret hos gravide kvinder, er der etableret en række udviklingsmæssige ethanol eksponering paradigmer bruge forskellige dyrearter, med rotter og mus bliver mest almindelige 5,6. Varigheden af graviditet i disse dyr typisk lasts cirka 3 uger, hvilket svarer til 1. og 2. trimester af graviditet. Mange gnavere har vurderet effekten af forskellige doser og mønstre af ethanol eksponering i denne periode. Eksempler på metoder, der ofte anvendes til at administrere ethanol til drægtige mus og rotter inkluderer administration via flydende kost 7,8, tilsætning af ethanol til drikkevandet 9,10 frivillig indtagelse af saccharin-sødede løsninger 11 mavesonde 12, damp indånding 13 og subkutan eller intraperitoneal injektion 14. Resultaterne af disse undersøgelser har gentaget flere af de underskud, der observeres i mennesker med FASDs, viser, at eksponeringen i de tidlige stadier af graviditeten er tilstrækkelig til at ødelægge neuronale kredsløb på tværs af hjernen (revideret i 6,15).
Forsøg med gnavere har også vist, at eksponering under svarende til 3. 16-18, intragastrisk intubation 19, subkutan injektion 20 og indånding dampe 21,22. Disse undersøgelser har overbevisende demonstreret, at hjernen vækstspurt er en periode med høj sårbarhed over for de udviklingsmæssige effekter af ethanol 6.
Som nævnt ovenfor, drikke i alle trimester af graviditeten er et fælles mønster af ethanol forbrug i kvinder 2. Imidlertid har forholdsvis få undersøgelser vurderet virkningen af dette mønster af eksponering ved hjælp af dyremodeller. Nogle af disse undersøgelser har taget advantage store dyr, hvor 3. trimester-ækvivalent forekommer i livmoderen snarere end den neonatale periode, som i tilfælde af rotter og mus. Disse dyremodeller inkluderer ikke-menneskelige primater 23,24 og får 25-27. Men disse dyremodeller har ikke været meget anvendt i FASDs forskning, dels på grund af høje omkostninger og behovet for specialiserede pasningsmuligheder. Gnavere er blevet mere almindeligt anvendt til at karakterisere effekten af alle trimester ethanol eksponering på fosterudviklingen 5.. Marsvin har været særligt fordelagtig i denne henseende givet deres omfattende prænatale udvikling og ligheder i hjernen modning til menneskers 28,29. Marsvin, har det været muligt at karakterisere virkningen af ethanol eksponering i livmoderen, der omfatter den tilsvarende periode menneskets udvikling 3. trimester. Den forholdsvis høje pris på disse dyr, samt den relativt lange varighed af deres graviditet(~ 67 dage), har begrænset deres brug til nogle få laboratorier, der arbejder på FASDs forskning.
På grund af deres omkostningseffektivitet og bred anvendelse inden for biomedicinsk forskning, har efterforskere brugte rotter til at modellere eksponering til ethanol i alle trimestre af graviditeten. I indledende undersøgelser blev rotter eksponeret under graviditeten via flydende kost efterfulgt af administration af ethanol via gastrostomi kunstigt opdrættet nyfødte (postnatal dag (P) 1-10) resulterer i peak blod ethanol niveauer (BEC) i dæmningen 0,08 g / dl og hvalpene 0,16 g / dl. Dette paradigme forårsagede langvarige ændringer i synsnerven myelination og reduceret antallet af Bergmann glia fibre i lillehjernen 30-32. Tilsvarende Maier og samarbejdspartnere at bruge kunstige opdrætsforhold administreret ethanol til gravide rotte dæmninger i en binge-lignende måde via intragastrisk intubation efterfulgt af neonatal administration i en del af 3. trimester tilsvarende (P4-9) 33,34. PEAK mødre og unger BECs var 0,3 g / dl ved både svangerskabsuge dag 20 og P6. Denne alt-trimester paradigme resulterede i væksthæmning, der var betydeligt større end hos unger udsat i udvalgte perioder af drægtighedsperioden 33.. Desuden rotter udsat for ethanol under svarer til alle trimester udviste en reduktion i antallet af cerebellare Purkinje og granulceller, der var større end hos dyr, der udsættes i andre perioder 34. Reduktioner i hippocampus celletal blev også rapporteret med dette paradigme, men disse virkninger synes at være primært en følge af eksponering i løbet af 3. trimester-ækvivalent 35. En fremgangsmåde, der involverer ethanol administration via intragastrisk sonde både drægtige rotter og neonatale mus er også blevet anvendt til at modellere alle trimester 36. Denne metode, som gav BEC af 0,13 g / dl hos moderdyrene (gestationel dag 17) og 0,24 g / dl i P6 unger, induceret long-varige ændringer i monoamin neurotransmitter niveauer i hippocampus og hypothalamus, og forøget ekspression af DNA-methyltransferaser og methyl-CpG-binding protein 2 i hippocampus 37,38. Ved hjælp af en lignende eksponering paradigme (BEC = 0,14-0,2 g / dl i dæmninger og 0,2 g / dl hos hvalpe), Gil-Mohapel et al. 39 registreret en stigning i antallet af nye umodne neuroner i dentatgyrus af voksne rotter, der kan repræsentere en udligningsmekanisme til ethanol-induceret neuronal skade eller en ændring i modningen af voksen-fødte neuroner. Efterforskere har også forsøgt at modellere alle trimester ethanol eksponering ved at udsætte dæmninger via flydende kost eller drikkevand under både graviditet og amning 9,40. Men nytten af at udsætte hvalpene via deres mors mælk er begrænset, fordi det typisk resulterer i lave pup BEC (fx 0,002-0,05 g / dl, 41,42).
Mus er også blevet anvendt extenstivt at karakterisere effekten af udviklingsmæssige ethanol eksponering. Denne dyremodel deler mange af de styrker, der er beskrevet ovenfor for rotte-dyremodel, med den yderligere fordel, at mange genetisk modificerede musestammer er tilgængelige 5. Mus med succes er blevet brugt til at karakterisere effekten af ethanol under den 1., 2. eller 3. trimester af graviditeten 43,44. Men virkningen af al trimester på disse dyr er ikke blevet godt karakteriseret, fordi det er teknisk sværere at udsætte musene under den svarer til alle trimester af graviditet. For eksempel kunstig opdræt og mavesonde, som har været anvendt med succes i rotter, kræver mere specialiserede procedurer i mus 45. Til de bedste af vores viden, har kun én undersøgelse til dato forsøgt at undersøge effekten af alle trimester ethanol eksponering hjælp mus; disse dyr blev udsat for ethanol-opløsning i drikkevand during graviditet og amning 46. Maternal BEC var 0,07 g / dl og pup BECs var ikke fastlagt, men forventes at være en brøkdel af dem i dæmninger.
Her beskriver vi en ny model for alle trimester ethanol eksponering af mus, hvor alkohol er administreret til både drægtige moderdyr og nyfødte via damp indånding kamre. Vapor kamre blev bygget på grundlag af et tidligere design 47. Vi giver detaljerede instruktioner om, hvordan at bygge indånding kamre og udføre procedurerne for eksponering. Vi giver også oplysninger om de BECs der kan opnås, og virkningerne af eksponering på ungernes overlevelse og vækst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Animal procedurer blev godkendt af University of New Mexico-Health Sciences Center Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1.. Vapor Chamber Assembly
- Cut polycarbonat plader med en rundsav eller stiksav til dimensionerne, der er fastsat i videoen for top, bund, front, ryg, sider og dør (figur 1 og tabel 1).
- Med en rundsav eller stiksav, skæres en åbning 8 inches høj med 16 inches lang i midten af frontpanelet.
- Måle og markere hullerne til klaver hængsel på 18 tommer med 10 tommer polycarbonat plader, der bliver døren til kammeret.
- I døren, bore counter sink huller med en 5/16 tommer borehoved, og med en 3/16 tomme borehoved, bore hullet til skruerne. Sørg for at bore counter synke huller på indersiden af døren for skruehovederne.
- Forbered polycarbonat plader til svejsning.
- Saml front, ryg og sidepaneler på bunden panelet ved hjælp Svejsenipler # 16.
- Seal eventuelle mellemrum mellem paneler med Svejsenipler # 16.
- Fastgør den øverste panel med Svejsenipler # 16.
- Brug stangklemmer eller tunge lærebøger at holde alt på plads, mens svejsningerne helbrede.
- Vedhæft en 1 tomme med en 12 tommer stykke polycarbonat på frontpanelet 1 tomme under åbningen til fastgørelse af døren hængslet.
- Vent mindst 24 timer for Weld-on til at helbrede.
- Klip 2 stykker af PEX rør 12 inches lang og 1 stykke 1 tomme lang PEX slange.
- Med en 5/16 borehoved, bore et hul i hver af de 12 tommer PEX slange ca 1 til 2 inches fra den ene ende.
- Vedhæft 2 x 12 tommer PEX rør til en 3/8 tomme T-stik med hullerne placeret væk fra stikket.
- Cap de åbne ender af PEX rør med 3/8 tomme stik.
- Fastgør klaver hængsel til frontpanelet og døren ved hjælp 4-40 maskinskruer og møtrikker.
- Brug af døren som en guide, mArken huller er nødvendige for klaver hængsel på 1 tomme spacer på frontpanelet af kammeret.
- Med en 3/16 tomme borehoved, bore huller i frontpanelet for klaver hængsel.
- Fastgør døren og klaver hængsel til frontpanelet ved hjælp af 4-40 maskinskruer og møtrikker.
- Saml klemmer som vist i videoen med en skive og møtrik på hver side af den side arm.
- Mark og bore 3/16 tomme huller til klemmer på frontpanelet og vedhæfte Vinkelklemmer med 4-40 maskinskruer og møtrikker.
- Tilføj 3/8 tommer gummibold sæler på indersiden af døren.
- Med en 5/8 inch boring borehoved et hul i midten af det øverste panel til indsugningsåbningen.
- Bor et 1/2 tommer hul i bunden / midten af bagpanel til exit port.
- Saml udgangsporten ved at skubbe det med gevind forsynede del af den 3/8 tomme gennem væggen adaptere gennem bagvæggen af kammeret damp i udgangsporten hul. Fastgør møtrikken fraindersiden af kammeret for at holde på plads.
- Fjern den beskyttende belægning fra polycarbonat ark.
- Fastgør 1 tommer stykke PEX slange til T-stik og tvinge PEX rør gennem hullet i toppen af kammeret indefra.
- Fastgør en 3/8 inch 90 albue til toppen af 1 tomme PEX rør udefra.
BEMÆRK: Bor et 1/2 tommer hul i døren og indsætte en 1/2 tommer sæl septa ind i hullet. - Gentag trin 1-22 for air kun styre kammer.
2.. Rack og Air Delivery Assembly
- Hvis placere kamrene på vognen / rack er nævnt i materialet liste, samle vognen i henhold til producentens anvisninger.
- Med reservedele møtrikker og bolte, vedhæfte et skrot stykke af polycarbonat til rack til at holde luftstrømningsorganet regulatorer.
- Overalt på skrot stykke polycarbonat, mærke og bore 3/4 tommer huller til luftstrømmen regulatorer og vedhæfte regulatorer med nødderbillede.
- Fastgør 3/8 tomme gennem-væg adapter til tilgangs-og afgangsåbninger af luftstrømmen regulatorer.
- Saml ethanol kolben med beluftning sten, # 8 prop og quick release in-line-stik.
- Ved anvendelse af 3/8 tomme Tygon slange, forbinde drøvleventil til luftpumpen og ethanol kolbe som vist i figur 1.
- For luften kun kammer, vedhæfte udgangsåbning Luftstrømsregulator til indløbet 3/8 tomme 90 albue med 3/8 tomme tygon slange, som vist i figur 1..
Fig. 1. Skematisk repræsentation af konfigurationen af damp kamre. En T-konnektor er fastgjort til den støjsvage luftpumpe. Den ene side af T-stik er direkte forbundet til en luftstrøm regulator til luften kun damp kammer. De øvrige filtreide er delt igen og fastgjort til 2 forskellige luftstrøm regulatorer, en for luft og en til ethanol. Luftkammeret er direkte forbundet til regulatoren som vist. For kammeret ethanol damp, er et Luftstrømsregulator tilsluttet perlator sten nedsænket i flydende ethanol i filteret kolben. Sidearmen port hældes er forbundet med produktionen af luft regulator som angivet. Den fusionerede ethanoldamp og luft forbindes derefter til indløbet af kammeret ethanoldamp. De udløbsrørene (ikke vist) er forbundet til en ventilationsudgangen i rummet.
3.. Test Vapor Chambers og justere Ethanol Niveauer
- Tilsættes 600 ml 190 proof ethanol til hældes indsætte beluftning sten, og krog op til indløbsrøret til sidearmen af kolben.
- Luk kammer døre og tænde luftpumpe.
- Juster luftmængde regulatorer, således at omtrent halvt så meget luft strømmer gennem den flydende alkohol som den luft, det er blandet med. Adjust luften kun luftstrømmen til den kombinerede strøm af alkohol og luft i ethanol kammeret.
- Tillad kamre at ækvilibrere i mindst 30 minutter før måling af luft ethanolkoncentration.
- Luftens ethanolkoncentration ved at ekstrahere 5 ml luft med en 18G nål og en 60 ml sprøjte gennem skillevæggen. At Fortynd prøven med rumluft ved at trække stemplet tilbage til 60 ml (1:12 fortynding). Mål luft ethanol niveau ved hjælp af et alkometer i overensstemmelse med producentens anvisninger. Den fortynding af det luftkammer er nødvendig for at opnå alkohol damp niveauer inden for afsløring rækkevidde af alkometer.
BEMÆRK: Hvis du bruger forskellige niveauer af alkohol eksponering fortyndingen skal muligvis justeres. - Som udgangspunkt, justere luftmængde regulatorer som nødvendig for at opnå en koncentration på ca 4,5-5 g / dl (g fordampet alkohol pr dl luft) luft alkohol.
4.. Husdyravl
- Gruppe hus hunner C578BL / 6 mus (2-3 måneder gamle) i mindst 1 uge til at synkronisere ovariecykler.
- Individuelt hus mandlige C57BL / 6 mus (2-5 måneder gamle) i mindst 2 uger.
- Efter synkroniseringen sætte en enkelt kvinde i med en enkelt han i 5 dage for at give mulighed for parring.
- Efter parring, fjerne hanner og individuelt hus hunner og placere dem i kamre.
5.. Præ-og postnatale Ethanol Vapor Eksponering
- Expose drægtige moderdyr til ethanol damp i 4 timer per dag med start klokken 10 i lyset cyklus (lys på fra 06:00 til 18:00), bortset fra dagen for fødslen for at forhindre hvalp død.
- Dæmninger vejes på gestationel dag (G) 5, G13-G14, og G18-G20 til at overvåge graviditeter; strøelse blev ændret på dage, at kvinder blev vejet for at minimere håndtering.
- Hver dag vil erstatte mad til ethanol udsatte grupper til at undgå forbrug af træpiller med nogen ethanol absorberet i dem.
- På dagen forfødsel ikke udsætter dyrene. Efter fødslen udsætte dæmninger og unger i 4 timer per dag med start klokken 10 fra P1-P12.
- Hvalpe på P2, P8, P12 og P25 afvejes; og ændre strøelse på P8 og P12 for at minimere yderligere håndtering.
- Umiddelbart efter den sidste eksponering (P12), overføre bure til en standard stalde værelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2A viser, at både gravide mus og neonatal afkom blev udsat for relativt stabile ethanoldamp koncentrationer i kamrene. Disse varierede mellem 4-6 g / dl. Figur 2B viser BECs opnået i drægtige mus som en funktion af tiden. BEC blev målt ved hjælp af en standard alkoholdehydrogenase baseret assay 48.. På G5 BECs steg hurtigt til ~ 60 mM 2 timer efter start af eksponering og toppede i slutningen af 4 hr eksponeringsperioden. BECs gradvist faldet til ~ 12 mM efter yderligere 4 timer efter afslutningen af eksponeringen. Ved G13-14, var der en dramatisk nedgang i BECs til ca 60% af niveauerne detekteret på G5. Desuden BECs niveauer steg mere langsomt og faldet hurtigere, hvilket resulterer i en kortere nærvær af ethanol i blodet af de gravide mus. På kort sigt (G18-20) blev BECs yderligere reduceret til omkring 30% af niveauet detekteret på G5. Disse resultater er i overensstemmelse med development hurtig metabolisk tolerance over for ethanol i den drægtige mus. Figur 2C viser, at neonatal afkom blev udsat for BECs nær 30 mM. BEC efterhånden steg i disse dyr, nåede et højdepunkt i slutningen af den 4 timers udsættelse periode og gradvist aftagende til baseline niveau 8 timer efter afslutningen af de 4 timers udsættelse paradigme. I modsætning til de drægtige moderdyr, var der ingen forskel mellem BEC målt hos nyfødte, der blev udsat tidligt (P2) vs sent (P7-P12) i den neonatale periode. Disse resultater indikerer, at den neonatale mus ikke udvikle metabolisk tolerance over for ethanol.
Figur 2.. Karakterisering af ethanol niveauer. A) Ethanol damp kammer niveauer forblev relativt konstant gennem de svangerskabsuge og postnatale faser af eksponering paradigm. For at måle disse niveauer blev kammer luft trækkes med en sprøjte gennem gummimembranen, fortyndes med den omgivende luft, og udvist til indgangsporten af et alkometer (se video for detaljer). Værdier blev opnået fra 5 og 4 forskellige eksponering runder for svangerskabsuge og postnatale faser, hhv. B) Blod ethanol niveauer, der måles på forskellige tidspunkter for de angivne skønnede svangerskabsuge dage i drægtige moderdyr (n = 5-7 dæmninger). Den juridiske forgiftning grænse (17,4 mm eller 0,08 g / dl) er angivet ved den stiplede linje. Den grå bar angiver den tid, dæmningerne blev udsat for ethanol. C) Samme som i B, men til neonatal mus (n = 5-9 unger fra forskellige kuld).
Figur 3 viser, at eksponeringen paradigme ikke påvirker vægtøgning hos moderdyrene og hvalpene betydeligt. Tabel 2 viser, at ethanol eksponering ikke signifikant påvirke antallet af levedygtige fetuSES, antal resorberet fostre, foster vægt og placenta vægt (målt på kort sigt). Tabel 2 viser også, at antallet af unger per kuld og unger dødelighed blev ikke påvirket signifikant af ethanol eksponering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3.. Manglende effekt af ethanol eksponering på Dam og fødselsvægt. A) Dam vægtøgning som en funktion af den anslåede drægtighedsdag (n = 8-12). Vægten til skønnet gestationel dag 5 svarer til den vægt, målt på den første dag i eksponering. B) Pup vægtøgning som funktion af alder (n = 7-9). For begge paneler fejllinjerne er mindre end symbolerne. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51839/51839fig3highres.jpg" target = "_blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
| Dimensioner (inches) | Højde | Bredde |
| Top | 32 | 22 |
| Bund | 32 | 22 |
| Front | 32 | 14 |
| Tilbage | 32 | 14 |
| Side 1 | 21.5 | 14 |
| Side 2 | 21.5 | 14 |
| Dør | 18 | 10 |
Tabel 1.. Dimensioner af polycarbonat ark.
| Air | EtOH | |
| 7,50 ± 1,08, n = 6 | 7,33 ± 1,52, n = 6 | |
| Gennemsnitlig Fetus Vægt (g): ~ E18 | 1,04 ± 0,09, n = 6 | 0,82 ± 0,09, n = 6 |
| Gennemsnitlig Placenta Vægt (g): ~ E18 | 0,12 ± 0,003, n = 6 | 0,14 ± 0,01, n = 6 |
| Antal reabsorberes Fostre: ~ E18 | 0,50 ± 0,34, n = 6 | 0,50 ± 0,50, n = 6 |
| Antal unger / kuld | 7,11 ± 0,67, n = 9 | 6,89 ± 0,42, n = 9 |
| Antallet af døde unger / kuld | 0,11 ± 0,11, n = 9 | 0,66 ± 0,24, n = 9 |
Tabel 2.. Præ-og postnatal karakterisering af muse-eksponering damp paradigme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi i detaljer metoder til konstruktion af damp indånding kamre. De materialer og redskaber, der er nødvendige for at opbygge kamrene er let tilgængelige fra en række kommercielle leverandører, og de skridt til opførelse af kamrene er forholdsvis ligetil. Det system, vi beskriver her ikke indeholder in-line kontraventiler til at forhindre tilbage strømning og blanding. Vi var i stand til at måle nogen påviselig ethanol i luften kun kamre tyder på, at vi ikke har nogen blanding eller tilbagestrømning af ethanol i luften kun kamre. Luften kun kamre skal kontrolleres for ethanoldamp periodisk (det skal bemærkes, at luftkammeret altid skal afprøves før ethanol kammer for at undgå afsløring af resterende ethanoldamp stede i spiritusballon og / eller sprøjte). Ideelt set bør kamrene placeres i dedikerede værelser på dyrets pleje facilitet, hvor mus bure løbende kan opstaldet for varigheden af eXposure paradigme, hvilket eliminerer behovet for at transportere musene, og derved reducere stress. Et standard værelse med en ventilation stikkontakt er alle, der er nødvendig for dette paradigme. Men hvis rummet deles med andre forskere, kan det være nødvendigt at placere kamrene i et værelse med adskilte sengebåse for at minimere eksponeringen af andre dyr til ethanol lugt. Hvert kammer kan rumme op til 6 standard mus bure, hvilket gør det en mindre arbejdskrævende metode til eksponering end for eksempel intragastrisk sondeernæring.
Eksponeringen paradigme kan let ændres i overensstemmelse med kravet om en bestemt eksperiment. Dyr kan blive udsat for ethanol under den svarer til alle trimester af graviditet. Det skal bemærkes, at gnaver udviklingsmæssige svarende til human udvikling kan variere afhængigt af, hvad hjerne region betragtning, og hvilken udviklingsproces man er interesseret i (neurogenese, synaptisk integration osv.). I denne undersøgelse har vi defineret tredje triMester-ækvivalent som hjerne vækst Spurt periode. Forskere opfordres til at konsultere hjemmesiden oversætte tid 49. Baseret på resultaterne vist i figur 2B, anbefaler vi at eksponering startes ved en lavere ethanoldamp (f.eks ~ 3 g / dl) og gradvist øges for at kompensere for udvikling af metabolisk tolerance. Under gennemførelsen af proceduren bør efterforskerne nøje overvåge BEC på forskellige svangerskabsuge dage til at afgøre, om dette resulterer i mere stabile niveauer i gravide dæmninger. En inhibitor af alkohol-dehydrogenase er blevet anvendt til at forebygge udviklingen af tolerance i mus udsat for ethanol i damp kamre 50. Det anbefales dog ikke, at dette middel kan anvendes i gravide mus, fordi undersøgelser tyder på, det har potentielt teratogene virkninger, som kan komplicere fortolkningen af resultaterne 51,52. Desuden vil injektioner af enhver form forårsage yderligere stress til drægtige moderdyr,potentielt confounding eksperimentet 53..
I modsætning til drægtige moderdyr, var damp kammer eksponering under den neonatale periode ikke resultere i udvikling af metabolisk tolerance. BECs var ikke forskellig mellem P2 og P7-12 mus. Peak BECs svarede til dem fundet i dæmninger på G13-14 og lidt højere end detekteret ved G18-20. Men BECs tog længere tid at vende tilbage til baseline i hvalpene. Det er endnu ikke fastslået, hvis ethanol eksponering i damp kamre i den gestational periode ændrer kapacitet neonatal afkom til at metabolisere ethanol. Men baseret på den litteratur, det ville forventes for unger, der blev udsat i drægtighedsperioden til ethanol at udvise en lidt nedsat eller uforandret kapacitet til at metabolisere ethanol 54,55. I vores undersøgelser har vi ikke observere en forskel i den gennemsnitlige fødselsvægt, og vores data viser, at ved udgangen af drægtighedsperioden, moderen BECs næppe stige over den juridiske forgiftning uden more end 2 timer. Disse data tyder på, at mødrene ikke væsentligt påvirket af den eksponering alkohol under den postnatale periode. Ikke desto mindre bør dette undersøges nærmere, især hvis dyrene udsat for højere ethanol niveauer.
Denne eksponering paradigme har nogle begrænsninger. Hunmus blev ikke eksponeret i løbet af de første fem dage af graviditeten, fordi de er avlet med hannerne i denne periode. En kortere avl interval kan forsøges (fx 2-3 dage), men det kan resultere i en reduktion i antallet af kvinder, der bliver gravide. Alternativt kan dyr avlet til en kortere tid og hunner kontrolleret for samleje stik. En anden begrænsning er, at alle mus i en given kammeret, kan være udsat for en enkelt koncentration af ethanol damp. Desuden er nogle aspekter af ethanol damp kammer eksponering paradigme er stressende, som det faktum, at dæmninger enkeltvis er opstaldet i hele størstedelen af drægtighedsperioden og er udsatstærk ethanol lugt. Det er også muligt, at eksponering ethanoldamp bevirker nogle ændringer i luftvejene af dæmninger og / eller unger. Desuden udsættelse for neonatale rotter er ikke en perfekt model af menneskers udsættelse i tredje trimester (f.eks placenta-føtal enhed ikke er til stede i denne model). Ikke desto mindre argumenterer vi for, at fordelene ved dette paradigme opvejer dens svagheder, og at det kan være en nyttig model til at karakterisere de mekanismer involveret i patofysiologien af FASDs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Understøttet af National Institutes of Health tilskud R01-AA015614, R01-AA014973, T32-AA014127 og K12-GM088021. Forfatterne takker Samantha L. Blomquist for teknisk assistance og Drs. Kevin Caldwell og Donald Partridge for kritisk evaluering af manuskriptet og video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycarbonate 1/4" clear 48" x 24" | McMaster-Carr | 8574K23 | 10 |
| Foam Rubber bulb seal 3/8"w x 7/32"h | McMaster-Carr | 93085K67 | 10 ft |
| Weld-on #16 | McMaster-Carr | 7515A11 | 3 |
| Piano hinge 12" long | McMaster-Carr | 1658A11 | 2 x 1 ft |
| Hold-down toggle clamps standard | McMaster-Carr | 5126A26 | 8 |
| PEX tubing 1/2" | McMaster-Carr | 51275K88 | 10 ft |
| Barbed Tee tube fitting (Black) Pkg 10 | McMaster-Carr | 5463K608 | 1 |
| Barbed plug fitting (Black) Pkg 10 | McMaster-Carr | 5462K79 | 1 |
| Barbed Elbow tube fitting (Black) Pkg 10 | McMaster-Carr | 5463K596 | 1 |
| 3/8" Through-Wall Adapters, Tube to Threaded Pipe | McMaster-Carr | 5463K851 | 1 |
| Phillips Machine screw 4-40 | McMaster-Carr | 91772A112 | 1 |
| Machine screw hex nut 4-40 | McMaster-Carr | 90480A005 | 1 |
| Panel-mount flowmeter 2-20 | McMaster-Carr | 41945K76 | 3 |
| FLASK, FILTER 1,000 ml 6/PACK | VWR | 89001-800 | 2 |
| Precision Seal Septa | VWR | 89084-490 | 1 |
| VWR Black Rubber Stopper #8 1-hole | VWR | 59581-367 | 1 |
| TUBE TYGON R3603 3/8X9/16 50' | VWR | 89068-556 | 1 |
| TUBE TYGON R3603 1/4X11/16 50' | VWR | 89068-502 | 1 |
| Aerator Stone P2120 | VWR | 32573-007 | 1 |
| 3/8" T-connectors Pk of 20 | VWR | 46600-060 | 1 |
| VWR Disconnectors tapered Pk of 10 | VWR | 46600-110 | 1 |
| 3/8 Hose Barb valved in-line coupling | Colder Products Company | HFCD17612 | 1 |
| Air pump medium capacity | LMI Manufacturers | DB60L | 1 |
| Nexelate Wire Shelving 36"W X 24"D X 63"H | Global industrial | T9A990135 | 1 |
| Stem Casters Set of (4) 5" Polyurethane Wheel | Global industrial | T9A500591 | 1 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). World Health Organization Who. Alcohol use and binge drinking among women of childbearing age--United States. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 61 (28), 534-538 (2012).
- Ethen, M. K., et al. Alcohol consumption by women before and during pregnancy. Matern Child Health J. 13, 274-285 (2009).
- May, P. A., et al. Prevalence and epidemiologic characteristics of FASD from various research methods with an emphasis on recent in-school studies. Dev Disabil Res Rev. 15, 176-192 (2009).
- Wendell, A. D. Overview and epidemiology of substance abuse in pregnancy. Clin Obstet Gynecol. 56, 91-96 (2013).
- Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Exp Biol Med (Maywood. 230, 389-393 (2005).
- Valenzuela, C. F., Morton, R. A., Diaz, M. R., Topper, L. Does moderate drinking harm the fetal brain? Insights from animal models). Trends Neurosci. 35, 284-292 (2012).
- Sliwowska, J. H., Song, H. J., Bodnar, T., Weinberg, J. Prenatal Alcohol Exposure Results in Long-Term Serotonin Neuron Deficits in Female Rats: Modulatory Role of Ovarian Steroids. Alcohol Clin. Exp. Res. 10, (2013).
- Sutherland, R. J., McDonald, R. J., Savage, D. D. Prenatal exposure to moderate levels of ethanol can have long-lasting effects on hippocampal synaptic plasticity in adult offspring. Hippocampus. 7, 232-238 (1997).
- Naassila, M., Daoust, M. Effect of prenatal and postnatal ethanol exposure on the developmental profile of mRNAs encoding NMDA receptor subunits in rat hippocampus. J Neurochem. 80, 850-860 (2002).
- Servais, L., et al. Purkinje cell dysfunction and alteration of long-term synaptic plasticity in fetal alcohol syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9858-9863 (2007).
- Brady, M. L., Allan, A. M., Caldwell, K. K. A limited access mouse model of prenatal alcohol exposure that produces long-lasting deficits in hippocampal-dependent learning and memory. Alcohol Clin Exp Res. 36, 457-466 (2012).
- Bake, S., Tingling, J. D., Miranda, R. C. Ethanol exposure during pregnancy persistently attenuates cranially directed blood flow in the developing fetus: evidence from ultrasound imaging in a murine second trimester equivalent model. Alcohol Clin Exp Res. 36, 748-758 (2012).
- Cuzon, V. C., Yeh, P. W., Yanagawa, Y., Obata, K., Yeh, H. H. Ethanol consumption during early pregnancy alters the disposition of tangentially migrating GABAergic interneurons in the fetal cortex. J Neurosci. 28, 1854-1864 (2008).
- Godin, E. A., et al. Magnetic resonance microscopy defines ethanol-induced brain abnormalities in prenatal mice: effects of acute insult on gestational day 7. Alcohol Clin Exp Res. 34, 98-111 (2010).
- Gil-Mohapel, J., Boehme, F., Kainer, L., Christie, B. R. Hippocampal cell loss and neurogenesis after fetal alcohol exposure: insights from different rodent models. Brain Res Rev. 64, 283-303 (2010).
- Diaz, J., Samson, H. H. Impaired brain growth in neonatal rats exposed to ethanol. Science. 208, 751-753 (1980).
- Stanton, M. E., Goodlett, C. R. Neonatal ethanol exposure impairs eyeblink conditioning in weanling rats. Alcohol Clin Exp Res. 22, 270-275 (1998).
- West, J. R., Hamre, K. M., Pierce, D. R. Delay in brain growth induced by alcohol in artificially reared rat pups. Alcohol. 1, 213-222 (1984).
- Tran, T. D., Stanton, M. E., Goodlett, C. R. Binge-like ethanol exposure during the early postnatal period impairs eyeblink conditioning at short and long CS-US intervals in rats. Dev Psychobiol. 49, 589-605 (2007).
- Ikonomidou, C., et al. Ethanol-induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome. Science. 287, 1056-1060 (2000).
- Heaton, M. B., Paiva, M., Madorsky, I., Siler-Marsiglio, K., Shaw, G. Effect of bax deletion on ethanol sensitivity in the neonatal rat cerebellum. J Neurobiol. 66, 95-101 (2006).
- Ryabinin, A. E., Cole, M., Bloom, F. E., Wilson, M. C. Exposure of neonatal rats to alcohol by vapor inhalation demonstrates specificity of microcephaly and Purkinje cell loss but not astrogliosis. Alcohol Clin Exp Res. 19, 784-791 (1995).
- Kraemer, G. W., Moore, C. F., Newman, T. K., Barr, C. S., Schneider, M. L. Moderate level fetal alcohol exposure and serotonin transporter gene promoter polymorphism affect neonatal temperament and limbic-hypothalamic-pituitary-adrenal axis regulation in monkeys. Biol Psychiatry. 63, 317-324 (2008).
- Schneider, M. L., et al. Moderate-level prenatal alcohol exposure alters striatal dopamine system function in rhesus monkeys. Alcohol Clin Exp Res. 29, 1685-1697 (2005).
- Ramadoss, J., Hogan, H. A., Given, J. C., West, J. R., Cudd, T. A. Binge alcohol exposure during all three trimesters alters bone strength and growth in fetal sheep. Alcohol. 38, 185-192 (2006).
- Ramadoss, J., Lunde, E. R., Pina, K. B., Chen, W. J., Cudd, T. A. All three trimester binge alcohol exposure causes fetal cerebellar purkinje cell loss in the presence of maternal hypercapnea, acidemia, and normoxemia: ovine model. Alcohol Clin Exp Res. 31, 1252-1258 (2007).
- Ramadoss, J., Tress, U., Chen, W. J., Cudd, T. A. Maternal adrenocorticotropin, cortisol, and thyroid hormone responses to all three-trimester equivalent repeated binge alcohol exposure: ovine model. Alcohol. 42, 199-205 (2008).
- Byrnes, M. L., Reynolds, J. N., Brien, J. F. Brain growth spurt-prenatal ethanol exposure and the guinea pig hippocampal glutamate signaling system. Neurotoxicol Teratol. 25, 303-310 (2003).
- Catlin, M. C., Abdollah, S., Brien, J. F. Dose-dependent effects of prenatal ethanol exposure in the guinea pig. Alcohol. 10, 109-115 (1993).
- Phillips, D. E., Krueger, S. K. Effects of combined pre- and postnatal ethanol exposure (three trimester equivalency) on glial cell development in rat optic nerve. Int J Dev Neurosci. 10, 197-206 (1992).
- Phillips, D. E., Krueger, S. K., Rydquist, J. E. S. hort- Short- and long-term effects of combined pre- and postnatal ethanol exposure (three trimester equivalency) on the development of myelin and axons in rat optic nerve. Int J Dev Neurosci. 9, 631-647 (1991).
- Shetty, A. K., Burrows, R. C., Wall, K. A., Phillips, D. E. Combined pre- and postnatal ethanol exposure alters the development of Bergmann glia in rat cerebellum. Int J Dev Neurosci. 12, 641-649 (1994).
- Maier, S. E., Chen, W. J., Miller, J. A., West, J. R. Fetal alcohol exposure and temporal vulnerability regional differences in alcohol-induced microencephaly as a function of the timing of binge-like alcohol exposure during rat brain development. Alcohol Clin Exp Res. 21, 1418-1428 (1997).
- Maier, S. E., Miller, J. A., Blackwell, J. M., West, J. R. Fetal alcohol exposure and temporal vulnerability: regional differences in cell loss as a function of the timing of binge-like alcohol exposure during brain development. Alcohol Clin Exp Res. 23, 726-734 (1999).
- Livy, D. J., Miller, E. K., Maier, S. E., West, J. R. Fetal alcohol exposure and temporal vulnerability: effects of binge-like alcohol exposure on the developing rat hippocampus. Neurotoxicol Teratol. 25, 447-458 (2003).
- Kelly, S. J., Lawrence, C. R. Intragastric intubation of alcohol during the perinatal period. Methods Mol Biol. 447, 101-110 (2008).
- Perkins, A., Lehmann, C., Lawrence, R. C., Kelly, S. J. Alcohol exposure during development: Impact on the epigenome. Int J Dev Neurosci. 31, 391-397 (2013).
- Tran, T. D., Kelly, S. J. Alterations in hippocampal and hypothalamic monoaminergic neurotransmitter systems after alcohol exposure during all three trimester equivalents in adult rats. J Neural Transm. 106, 773-786 (1999).
- Gil-Mohapel, J., et al. Altered adult hippocampal neuronal maturation in a rat model of fetal alcohol syndrome. Brain Res. 1384, 29-41 (2011).
- Popovic, M., Caballero-Bleda, M., Guerri, C. Adult rat's offspring of alcoholic mothers are impaired on spatial learning and object recognition in the Can test. Behav Brain Res. 174, 101-111 (2006).
- Guerri, C., Sanchis, R. Alcohol and acetaldehyde in rat's milk following ethanol administration. Life Sci. 38, 1543-1556 (1986).
- Matta, S. G., Elberger, A. J. Combined exposure to nicotine and ethanol throughout full gestation results in enhanced acquisition of nicotine self-administration in young adult rat offspring. Psychopharmacology (Berl. 193, 199-213 (2007).
- Olney, J. W. Fetal alcohol syndrome at the cellular level). Addict Biol. 9, 137-149 (2004).
- Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Exp Biol Med (Maywood). 230, 366-375 (2005).
- Lewis, S. M., et al. Modifying a displacement pump for oral gavage dosing of solution and suspension preparations to adult and neonatal mice). Lab Anim (NY). 39, 149-154 (2010).
- Cebolla, A. M., et al. Effects of maternal alcohol consumption during breastfeeding on motor and cerebellar Purkinje cells behavior in mice. Neurosci Lett. 455, 4-7 (2009).
- Becker, H. C., Hale, R. L. Repeated episodes of ethanol withdrawal potentiate the severity of subsequent withdrawal seizures: an animal model of alcohol withdrawal "kindling". Alcohol Clin. Exp. Res. 17, 94-98 (1993).
- Galindo, R., Valenzuela, C. F. Immature hippocampal neuronal networks do not develop tolerance to the excitatory actions of ethanol. Alcohol. 40, 111-118 (2006).
- Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33, 7368-7383 (2013).
- Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Weathersby, R. T. Repeated ethanol withdrawal experience increases the severity and duration of subsequent withdrawal seizures in mice. Alcohol. 14, 319-326 (1997).
- Ukita, K., Fukui, Y., Shiota, K. Effects of prenatal alcohol exposure in mice: influence of an ADH inhibitor and a chronic inhalation study. Reprod Toxicol. 7, 273-281 (1993).
- Varma, P. K., Persaud, T. V. Influence of pyrazole, an inhibitor of alcohol dehydrogenase on the prenatal toxicity of ethanol in the rat. Res Commun Chem Pathol Pharmacol. 26, 65-73 (1979).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemp Top Lab Anim Sci. 43, 42-51 (2004).
- Arias, C., Molina, J. C., Mlewski, E. C., Pautassi, R. M., Spear, N. Acute sensitivity and acute tolerance to ethanol in preweanling rats with or without prenatal experience with the drug. Pharmacol Biochem Behav. 89, 608-622 (2008).
- Nizhnikov, M. E., Molina, J. C., Varlinskaya, E. I., Spear, N. E. Prenatal ethanol exposure increases ethanol reinforcement in neonatal rats. Alcohol Clin Exp Res. 30, 34-45 (2006).
