Summary
Se demuestra la construcción de cámaras de vapor de alcohol utilizando materiales fácilmente disponibles que albergan simultáneamente 6 jaulas de ratón. Se describe aún más su uso en un modelo de ratón de la exposición fetal de alcohol equivalente a los 3 trimestres del embarazo humano. Este paradigma expone los animales durante la gestación y después del parto 1-12 días.
Abstract
La exposición al alcohol durante el desarrollo puede dar lugar a una constelación de anormalidades morfológicas y de comportamiento que se conocen colectivamente como trastornos del espectro alcohólico fetal (TEAF). En el extremo más grave del espectro es el síndrome de alcoholismo fetal (FAS), que se caracteriza por retraso del crecimiento, dismorfología craneofacial, y los déficits neuroconductuales. Los estudios con modelos animales, incluidos los roedores, se han dilucidado muchos mecanismos moleculares y celulares implicados en la fisiopatología de los FASD. Administración de etanol a los roedores gestantes se ha utilizado para modelar la exposición humana durante el primer y segundo trimestres del embarazo. Tercer trimestre el consumo de etanol en los seres humanos ha sido modelado usando roedores neonatales. Sin embargo, son pocos los estudios en roedores han caracterizado el efecto de la exposición de etanol durante el equivalente a los tres trimestres del embarazo humano, un patrón de exposición que es común en las mujeres embarazadas. Aquí, se muestra cómo construir cámaras de vapor de fácil omateriales btainable que cada uno puede alojar hasta seis jaulas de ratón estándar. Se describe un paradigma cámara de vapor que puede ser utilizado para modelar la exposición al etanol, con una mínima manipulación, durante los tres trimestres. Nuestros estudios demuestran que las presas embarazadas desarrollaron tolerancia metabólica significativa a etanol. Sin embargo, los ratones recién nacidos no se desarrolló tolerancia metabólica y el número de fetos, el peso del feto, el peso de la placenta, el número de crías / camada, número de crías muertas / camada, y peso de las crías no se vieron afectados significativamente por la exposición de etanol. Una ventaja importante de este paradigma es su aplicabilidad a estudios con ratones genéticamente modificados-. Además, este paradigma minimiza la manipulación de los animales, un factor de confusión importante en la investigación del alcoholismo fetal.
Introduction
Beber alcohol durante el embarazo puede dañar al feto, causando alteraciones persistentes en muchos órganos y sistemas que disminuyen significativamente la calidad de vida de las personas afectadas y sus familias. Se estima que aproximadamente el 10-30% de las mujeres beben durante el embarazo en los EE.UU., con 1-8% de beber en un 1,2 patrón de atracones. El rango de los efectos producidos por la exposición al etanol durante el desarrollo fetal se conoce colectivamente como trastornos del espectro alcohólico fetal (TEAF). Estimaciones recientes indican que TEAF son un importante problema de salud pública con una prevalencia de hasta el 2-5% en los EE.UU. 3. Cuanto más grave manifestación de TEAF es el Síndrome de Alcohol Fetal (FAS), que se caracteriza por retraso del crecimiento, anomalías craneofaciales, y los déficits neuroconductuales, incluyendo problemas de aprendizaje. La prevalencia de la FAS ha sido estimada en 0,2-0,7% en los EE.UU. 3. Los tratamientos actualmente disponibles para los FASD son sólo parcialmente eficacesy el desarrollo de tratamientos más eficaces se ve limitada por la falta de comprensión de las bases celulares y moleculares de este complejo espectro de trastornos.
Datos de los Defectos de Nacimiento Nacionales Prevention Study (NBDPS) indican que las mujeres embarazadas con más frecuencia beben durante el 1 º trimestre del embarazo, antes de que el embarazo ha sido detectado, seguido de la abstinencia durante las últimas etapas de gestación 2. El NBDPS también encontró que el segundo patrón más común de consumo de etanol durante la gestación implica beber a través de todos los trimestres del embarazo 2. Las razones de esto son la falta de conciencia acerca de los efectos potencialmente nocivos de la exposición fetal etanol (incluso a dosis bajas), el acceso limitado a la atención prenatal, la historia positiva de los trastornos neuropsiquiátricos, y abuso o dependencia de etanol 4. Curiosamente, el NBDPS informó de que el tercer patrón más común de consumo involucrado abstinencia durante la 1
En un intento de modelar los diferentes patrones de consumo de etanol observados en mujeres embarazadas, un número de paradigmas de desarrollo de exposición etanol haber establecido mediante diversas especies animales, con ratas y ratones que son 5,6 más común. La duración de la gestación en estos animales normalmente lasct aproximadamente 3 semanas, lo que corresponde a la 1 ª y 2 ª trimestre del embarazo humano. Muchos estudios en roedores han evaluado el impacto de diferentes dosis y pautas de exposición a etanol durante este período. Los ejemplos de los métodos utilizados frecuentemente para administrar etanol a ratones y ratas preñadas incluyen la administración a través de dietas líquidas 7,8, adición de etanol al agua de bebida 9,10, beber voluntaria de soluciones sacarina endulzadas con 11, sonda gástrica 12, la inhalación de vapor 13 , y la inyección subcutánea o intraperitoneal 14. Los resultados de estos estudios han recapitulado varias de las deficiencias observadas en los seres humanos con TEAF, lo que demuestra que la exposición durante las primeras etapas del embarazo es suficiente para dañar los circuitos neuronales a través del cerebro (revisado en 6,15).
Los experimentos con roedores también han demostrado que la exposición durante el equivalente a la 3 ª artificialmente-16-18, intubación intragástrica 19, la inyección subcutánea 20, y la inhalación de vapor de 21,22. Estos estudios han demostrado de forma convincente que la aceleración del crecimiento del cerebro es un período de gran vulnerabilidad a los efectos del desarrollo de etanol 6.
Como se mencionó anteriormente, el consumo durante todos los trimestres del embarazo es un patrón común de consumo de etanol en las mujeres 2. Sin embargo, relativamente pocos estudios han evaluado el impacto de este modelo de exposición utilizando modelos animales. Algunos de estos estudios han tenido advantagE de grandes animales donde se produce la 3 ª trimestre equivalente en el útero en lugar de el período neonatal como en el caso de ratas y ratones. Estos modelos animales incluyen primates no humanos 23,24 y ovejas 25-27. Sin embargo, estos modelos animales no han sido ampliamente utilizado en la investigación FASD, en parte, debido al alto costo y la necesidad de instalaciones de atención especializada. Los roedores se han utilizado más comúnmente para caracterizar el efecto de la exposición de etanol todos trimestre sobre el desarrollo fetal 5. Los conejillos de indias han sido particularmente ventajoso a este respecto dado su desarrollo prenatal extensa y similitudes en la maduración del cerebro a la de los seres humanos 28,29. Con los conejillos de indias, que ha sido posible caracterizar el efecto de la exposición de etanol en el útero que incluye el período de desarrollo equivalente de la humana 3 ª trimestre. El comparativamente alto coste de estos animales, así como la duración relativamente larga de su embarazo(~ 67 días), ha limitado su uso a unos pocos laboratorios que trabajan en la investigación TEAF.
Debido a su uso rentabilidad y amplia en la investigación biomédica, los investigadores han utilizado ratas para modelar la exposición al etanol durante todos los trimestres del embarazo. En los estudios iniciales, las ratas fueron expuestas durante el embarazo a través de dietas líquidas seguidas por la administración de etanol a través de gastrostomía para criar artificialmente a los recién nacidos (día postnatal (P) 1-10) resulta en niveles de etanol en sangre de pico (BEC) en los embalses de 0,08 g / dl y en las crías de 0,16 g / dl. Este paradigma causó alteraciones duraderas en la mielinización del nervio óptico y redujo el número de fibras de glía de Bergmann en el cerebelo 30-32. Del mismo modo, Maier y colaboradores utilizando condiciones de cría artificial administrados etanol para ratas madres embarazadas de manera compulsiva, como a través de la intubación intragástrica seguido de la administración neonatal durante parte del 3er trimestre equivalente (P4-9) 33,34. PBEC maternas y las crías EAK fueron 0,3 g / dl en dos días de gestación 20 y P6. Este paradigma de la exposición todos trimestre resultó en el retraso del crecimiento que fue significativamente mayor que la observada en cachorros expuestos durante períodos seleccionados de gestación 33. Además, las ratas expuestas a etanol durante el equivalente a todos los trimestres mostraron una reducción en el número de células granulares que fue mayor que el observado en los animales expuestos durante otros períodos 34 de Purkinje del cerebelo y. Las reducciones en el número de células del hipocampo También se informó con este paradigma, pero estos efectos parecen ser principalmente una consecuencia de la exposición durante el tercer trimestre 3-equivalente 35. Un método que consiste en la administración de etanol a través de sonda intragástrica a ratas embarazadas y ratones recién nacidos también se ha utilizado para modelar toda la exposición trimestre 36. Este método, que cedió BEC de 0,13 g / dl en los embalses (día gestacional 17) y 0,24 g / dl en las crías P6, lon inducidaalteraciones g duración de los niveles de neurotransmisores de monoamina en el hipocampo y el hipotálamo, y el aumento de expresión de DNA methyltransferases y metil CpG proteína 2 de unión en el hipocampo 37,38. El uso de un paradigma exposición similar (BEC = 0,14 a 0,2 g / dl en presas y 0,2 g / dl en cachorros), Gil-Mohapel et al. 39 detecta un aumento en el número de nuevas neuronas inmaduras en el giro dentado de ratas adultas que puede representar un mecanismo compensatorio al daño neuronal inducido por etanol o una alteración en la maduración de las neuronas adultas-nacido. Asimismo, los investigadores han tratado de modelar toda la exposición de etanol trimestre mediante la exposición de las presas a través de dietas líquidas o agua potable durante el embarazo y la lactancia 9,40. Sin embargo, la utilidad de la exposición de las crías a través de la leche de su madre es limitada, ya que normalmente se traduce en BEC bajos cachorros (por ejemplo, ,002-,05 g / dl; 41,42).
Los ratones también se han utilizado extensIVELY para caracterizar los efectos de la exposición del desarrollo de etanol. Este modelo animal comparte muchas de las ventajas descritas anteriormente para el modelo animal de rata, con la ventaja adicional de que muchas cepas de ratón genéticamente modificados están disponibles 5. Los ratones se han utilizado con éxito para caracterizar los efectos del etanol durante la 1 ª, 2 ª o 3 ª trimestre del embarazo 43,44. Sin embargo, el impacto de toda la exposición trimestre en estos animales no ha sido bien caracterizado porque es técnicamente más difícil de exponer a los ratones durante el equivalente a todos los trimestres de embarazo humano. Por ejemplo, la cría artificial y sonda gástrica, que se han utilizado con éxito en ratas, requieren procedimientos más especializados en ratones 45. A lo mejor de nuestro conocimiento, sólo un estudio hasta la fecha ha tratado de estudiar el efecto de toda la exposición de etanol trimestre utilizando ratones; estos animales fueron expuestos a una solución de etanol en agua potable during embarazo y la lactancia 46. BEC maternas fueron 0,07 g / dl y las crías BEC no fueron determinadas, pero espera que sea una fracción de los de las presas.
Aquí se describe un nuevo modelo para la exposición de etanol toda trimestre de los ratones en el que se administró alcohol a ambas presas embarazadas y los recién nacidos a través de cámaras de inhalación de vapores. Cámaras de vapor fueron construidas sobre la base de un diseño previo 47. Proporcionamos instrucciones detalladas sobre la forma de construir las cámaras de inhalación y llevar a cabo los procedimientos de exposición. También ofrecemos información sobre las CEBs que se pueden lograr y los efectos de la exposición sobre la supervivencia de las crías y el crecimiento.
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Protocol
Todos los animales procedimientos fueron aprobados por la Universidad de Nuevo México-Ciencias de la Salud Animal del Centro de Atención Institucional y el empleo Comisión.
1. Vapor Asamblea Cámara
- Hojas de corte de policarbonato con una sierra circular o sierra de calar a las dimensiones previstas en el video de arriba, abajo, delante, detrás, a los lados, y la puerta (Figura 1 y Tabla 1).
- Con una sierra circular o sierra de calar, cortar una abertura 8 pulgadas de alto por 16 pulgadas de ancho en el medio del panel frontal.
- Mida y marque los agujeros para la bisagra de piano en el de 18 pulgadas por 10 pulgadas de hoja de policarbonato que se convertirá en la puerta de la cámara.
- En la puerta, taladre agujeros del fregadero del contador con un poco de 5/16 de pulgada de perforación, y con un poco de 3/16 de pulgada de perforación, perforar el agujero para los tornillos. Asegúrese de perforar agujeros del fregadero de venta libre en el interior de la puerta para que las cabezas de los tornillos.
- Preparar las láminas de policarbonato para la soldadura.
- Ensamble front, paneles traseros y laterales en el panel inferior utilizando para soldar # 16.
- Selle todos los espacios entre los paneles con autógena-en # 16.
- Coloque el panel superior con autógena-en # 16.
- Utilice abrazaderas de barra o libros de texto pesados para mantener todo en su lugar, mientras que las soldaduras curan.
- Adjuntar un 1 pulgada de una pieza de 12 pulgadas de policarbonato en la parte frontal del panel 1 pulgada por debajo de la abertura para la fijación de la bisagra de la puerta.
- Deje por lo menos 24 horas para soldar de curar.
- Corte 2 pedazos de tubería PEX 12 pulgadas de largo y 1 trozo de tubo PEX largo de 1 pulgada.
- Con una broca de 5/16, perforar un agujero en cada uno de la tubería de PEX 12 pulgadas aproximadamente 1 a 2 pulgadas de un extremo.
- Adjuntar 2 x 12 pulgadas tubería de PEX a un conector en T 3/8 pulgadas con los agujeros situados fuera del conector.
- Tape los extremos abiertos de la tubería de PEX con 3/8 pulgadas tapones.
- Fije la bisagra al panel frontal y la puerta usando tornillos 4-40 y tuercas.
- Uso de la puerta como una guía, marca de los agujeros necesarios para la bisagra de piano sobre el espaciador de 1 pulgada en el panel frontal de la cámara.
- Con una broca de 3/16 pulg pulgadas, perfore los agujeros en el panel frontal de la bisagra de piano.
- Coloque la puerta y bisagra al panel frontal mediante tornillos 4-40 y tuercas.
- Montar las abrazaderas de palanca como se muestra en el vídeo con una arandela y una tuerca en cada lado del brazo lateral.
- Marque y perfore orificios de 3/16 pulgadas para el SUJETADORES en el panel frontal y se adhieren basculante abrazaderas con tornillos 4-40 y tuercas.
- Añadir juntas de bulbo de caucho de 3/8 pulgadas a la parte interior de la puerta.
- Con una broca de perforación 5/8 de pulgada, perforar un agujero en el centro del panel superior para el puerto de entrada.
- Perforar un agujero de 1/2 pulgada de la parte inferior / centro del panel posterior de la boca de salida.
- Montar el puerto de salida empujando la parte roscada de 3/8 pulgadas a través de la pared a través de los adaptadores de la pared posterior de la cámara de vapor en el orificio del puerto de salida. Coloque la tuerca delinterior de la cámara para mantenerlo en su lugar.
- Quite la cubierta protectora de láminas de policarbonato.
- Coloque la pieza de 1 pulgada de tubería PEX para el conector en T y forzar la tubería PEX a través del agujero en la parte superior de la cámara desde el interior.
- Adjuntar un 3/8 pulgadas 90 codazo en la parte superior de la tubería PEX de 1 pulgada desde el exterior.
NOTA: Realice un orificio de 1/2 pulgada de la puerta e inserte un sello septos 1/2 pulgada en el agujero. - Repita los pasos 1 a 22 para el aire de control sólo de la cámara.
2. Bastidor y Asamblea Air Delivery
- Si la colocación de las cámaras en la cesta / bastidor mencionado en la lista de materiales, montar la cesta de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Con tuercas y tornillos de repuesto, coloque un trozo de policarbonato a la cremallera para sujetar los reguladores de flujo de aire.
- En cualquier lugar en el trozo de policarbonato, marque y taladre agujeros de 3/4 pulgadas para los reguladores de flujo de aire y conecte los reguladores con las tuercasproporcionado.
- Adjuntar 3/8 pulgadas a través de la pared del adaptador a los puertos de entrada y salida de los reguladores de flujo de aire.
- Montar el frasco de etanol con la piedra de aireación, # 8 tapón y cierre rápido en la línea de conectores.
- Uso de tubo Tygon de 3/8 pulgadas, conectar los reguladores de flujo a la bomba de aire y matraz de etanol como se muestra en la Figura 1.
- Para la única cámara de aire, conectar el puerto de salida del regulador de flujo de aire a la entrada 3/8 de pulgada 90 codo con tubo Tygon de 3/8 pulgadas, como se muestra en la Figura 1.
Figura 1. Representación esquemática de la configuración de las cámaras de vapor. Un conector en T está unido a la bomba de aire de bajo ruido. Un lado del conector en T está conectado directamente a un regulador de flujo de aire para la única cámara de vapor de aire. Los otros sIDE se divide de nuevo y se fija a 2 reguladores de flujo de aire diferentes, una para el aire y uno para el etanol. La cámara de aire está conectado directamente al regulador como se muestra. Para la cámara de vapor de etanol, un regulador de flujo de aire está conectado a la piedra aireador sumergido en etanol líquido en el matraz de filtración. El puerto de brazo lateral del matraz de filtro se conecta con la salida del regulador de aire, como se indica. El vapor de etanol fusionado y aire se conecta entonces a la entrada de la cámara de vapor de etanol. Los tubos de salida (no mostrados) están conectados a una salida de ventilación en la sala.
3. Prueba de Cámaras y ajustar los niveles de vapor de etanol
- Añadir 600 ml de 190 pruebas de etanol al matraz de filtro, inserte la piedra de aireación, y conectar a la entrada del tubo al brazo lateral del matraz.
- Cierre las puertas de la cámara y encienda la bomba de aire.
- Ajuste los reguladores de flujo de aire de manera que aproximadamente la mitad de la cantidad de aire fluye a través del líquido de alcohol como el aire que se mezcla con. Adjust el aire sólo el flujo de aire para el flujo combinado del alcohol y el aire de la cámara de etanol.
- Permitir a cámaras de equilibrar durante al menos 30 min antes de medir la concentración de etanol de aire.
- Medir la concentración de etanol de aire mediante la extracción de 5 ml de aire con una aguja 18G y una jeringa de 60 ml a través del septo. Diluir la muestra con el aire de la habitación dibujando el émbolo hacia atrás hasta 60 ml (dilución 1:12). Mida el nivel de etanol aire utilizando un alcoholímetro de conformidad con las instrucciones del fabricante. Es necesaria la dilución de la cámara de aire para lograr los niveles de vapor de alcohol dentro del rango de detección del alcoholímetro.
NOTA: Si utiliza diferentes niveles de la exposición al alcohol puede necesitar la dilución que ser ajustada. - Como punto de partida, ajuste los reguladores de flujo de aire según sea necesario para lograr una concentración de alcohol de aire de aproximadamente 4,5 a 5 g / dl (gramos de alcohol vaporizado por dl de aire).
4. Reproducción Animal
- Las mujeres de la casa Grupo C578BL / 6 ratones (2-3 meses de edad) durante al menos 1 semana para sincronizar los ciclos ováricos.
- Albergar Individualmente masculinos C57BL / 6 ratones (2-5 meses de edad) durante al menos 2 semanas.
- Después de sincronizar, colocar una sola hembra con un macho durante 5 días para permitir el apareamiento.
- Después del apareamiento, los machos y eliminar de forma individual las hembras de las casas y colocarlos en cámaras.
5. Pre y post-natal Exposición Ethanol Vapor
- La exposicion presas embarazadas a vapor de etanol durante 4 horas al día, comenzando a las 10 horas durante el ciclo de luz (luces de 06 a.m.-6 p.m.), excepto el día del nacimiento para prevenir la muerte cachorro.
- Pesar represas en días de gestación (G) 5, G13-G14, y G18-G20 para vigilar embarazos; ropa de cama fue cambiado el día que las hembras se pesaron para reducir al mínimo la manipulación.
- Cada día reemplazar la comida para los grupos de etanol expuesta para evitar el consumo de gránulos con cualquier etanol absorbido en ellos.
- En el día denacimiento no exponga animales. Después del nacimiento exponer las presas y cachorros durante 4 horas al día, comenzando a las 10 am de P1-P12.
- Pesar cachorros en P2, P8, P12, y P25; y cambiar la ropa de cama en P8 y P12 a minimizar la manipulación adicional.
- Inmediatamente después de la última exposición (P12), la transferencia de las jaulas a una habitación estándar albergar a los animales.
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Representative Results
Figura 2A muestra que tanto en ratones embarazadas y los hijos recién nacidos fueron expuestos a concentraciones de vapores de etanol relativamente estables en las cámaras. Estos variaron entre 4-6 g / dl. Figura 2B muestra las BEC obtenidos en los ratones embarazadas como una función del tiempo. BEC se midieron usando un alcohol deshidrogenasa estándar basado ensayo 48. En G5, las BEC se elevó rápidamente a ~ 60 mM de 2 h después del inicio de la exposición y alcanzó su punto máximo al final del período de exposición de 4 horas. BEC disminuyó gradualmente a ~ 12 mM después de una 4 horas más después del final de la exposición. Por G13-14, hubo una disminución dramática en las BEC a aproximadamente el 60% de los niveles detectados en G5. Además, los niveles de BEC subieron más lentamente y disminuyó más rápidamente, lo que resulta en un más corto presencia de etanol en la sangre de los ratones embarazadas. A corto plazo (G18-20), BEC se redujeron aún más a aproximadamente 30% de los niveles detectados en el G5. Estos hallazgos son consistentes con el de sarrolloent de rápida tolerancia metabólica para etanol en los ratones preñados. Figura 2C muestra que la descendencia neonatal fueron expuestos a las BEC cerca de 30 mM. BEC subió gradualmente en estos animales, alcanzando un pico al final del período de exposición de 4 horas y disminuyendo gradualmente a los niveles de línea de base 8 horas después del final de la exposición paradigma 4 h. En contraste con las presas embarazadas, no había ninguna diferencia entre las BEC medidos en los recién nacidos que fueron expuestos temprana (P2) versus tardía (P7-P12) en el período neonatal. Estos hallazgos indican que los ratones recién nacidos no se desarrolló tolerancia metabólica a etanol.
Figura 2. Caracterización de los niveles de etanol. A) los niveles de la cámara de vapor de etanol se mantuvieron relativamente constantes a lo largo de las fases de gestación y después del parto de la paradigmática la exposiciónm. Para medir estos niveles, aire de la cámara se retiró con una jeringa a través del tapón de goma, se diluye con el aire ambiente, y expulsó a los puertos de entrada de un alcoholímetro (ver video para más detalles). Los valores se obtuvieron de 5 y 4 rondas de exposición diferentes para las fases de gestación y postnatales, respectivamente. B) los niveles de etanol en sangre medida en diferentes puntos de tiempo para los días de gestación indicados en la presas embarazadas (n = 5-7 presas). El límite de intoxicación legal (17,4 mM o 0,08 g / dl) se indica mediante la línea de puntos. La barra gris indica el tiempo de las presas fueron expuestos a etanol. C) Lo mismo que en B, pero para ratones recién nacidos (n = 5-9 cachorros de diferentes camadas).
La Figura 3 muestra que el paradigma de la exposición no afectó significativamente el aumento de peso en las presas o las crías. Tabla 2 muestra que la exposición de etanol no afectó significativamente el número de FETU viablesses, el número de fetos reabsorbidas, el peso del feto, y el peso de la placenta (medida a corto plazo). Tabla 2 también muestra que el número de crías por camada y mortalidad de las crías no se vieron afectados significativamente por la exposición de etanol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 3. La falta de un efecto de la exposición al etanol sobre las represas y las crías pesos. A) el aumento de peso de la presa como una función del día de gestación estimado (n = 8-12). El peso en el día gestacional estimada 5 se corresponde con el peso medido en el primer día de la exposición. B) Ganancia de peso de las crías en función de la edad (n = 7-9). Para ambos paneles, las barras de error son más pequeñas que los símbolos. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51839/51839fig3highres.jpg" target = "_blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Dimensiones (pulgadas) | Altura | Ancho |
| Superior | 32 | 22 |
| Fondo | 32 | 22 |
| Frente | 32 | 14 |
| Espalda | 32 | 14 |
| Side 1 | 21.5 | 14 |
| Side 2 | 21.5 | 14 |
| Puerta | 18 | 10 |
Tabla 1. Dimensiones de láminas de policarbonato.
| Aire | EtOH | |
| 7,50 ± 1,08, n = 6 | 7,33 ± 1,52, n = 6 | |
| Promedio Feto Peso (g): ~ E18 | 1,04 ± 0,09, n = 6 | 0,82 ± 0,09, n = 6 |
| Promedio Placenta Peso (g): ~ E18 | 0,12 ± 0,003, n = 6 | 0,14 ± 0,01, n = 6 |
| Número de fetos Re absorbidas: ~ E18 | 0.50 ± 0.34, n = 6 | 0,50 ± 0,50, n = 6 |
| Número de crías / camada | 7.11 ± 0.67, n = 9 | 6.89 ± 0.42, n = 9 |
| Número de cachorros muertos / camada | 0,11 ± 0,11, n = 9 | 0,66 ± 0,24, n = 9 |
Tabla 2. Pre-y caracterización post-natal de ratón paradigma exposición al vapor.
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Discussion
A continuación, describimos en detalle los métodos para la construcción de cámaras de inhalación de vapores. Los materiales y las herramientas requeridas para construir las cámaras están fácilmente disponibles a partir de un número de proveedores comerciales y los pasos para la construcción de las cámaras son relativamente sencillos. El sistema que se describe aquí no contiene válvulas de retención en línea para evitar el reflujo y la mezcla. No fue posible medir cualquier etanol detectable en el aire sólo cámaras que sugieren que no tenemos ninguna mezcla o reflujo de etanol en el aire sólo cámaras. El aire sólo cámaras deben ser revisados periódicamente para el vapor de etanol (debe tenerse en cuenta que la cámara de aire siempre debe ser probado antes de la cámara de etanol para evitar la detección de vapor de etanol residual presente en el alcoholímetro y / o jeringa). Lo ideal sería que las cámaras deben ser colocados en salas dedicadas a la instalación de cuidado de animales donde las jaulas de ratones pueden ser alojados de forma continua durante la duración de la eparadigma Xposure, eliminando la necesidad de transportar los ratones, reduciendo así el estrés. Una habitación estándar con una salida de ventilación es todo lo que se necesita para este paradigma. Sin embargo, si la habitación se comparte con otros investigadores, puede ser necesario para colocar las cámaras en una habitación con cubículos separados para minimizar la exposición de otros animales al olor de etanol. Cada cámara tiene capacidad para 6 jaulas estándar de ratón, por lo que es un método menos laborioso de la exposición que, por ejemplo, alimentación por sonda intragástrica.
El paradigma de la exposición se puede modificar fácilmente de acuerdo con el requisito de un experimento específico. Los animales pueden ser expuestos a etanol durante el equivalente a todos los trimestres de embarazo humano. Cabe señalar que el equivalente del desarrollo de roedores para el desarrollo humano puede variar dependiendo de qué región del cerebro se considera y qué proceso de desarrollo se está interesado en (neurogénesis, la integración sináptica, etc). En este estudio, se definió el tercer tri-mester equivalente como el período estirón cerebro. Se anima a los investigadores a consultar la página web de tiempo 49 traduciendo. Sobre la base de los resultados que se muestran en la Figura 2B, se recomienda que se inició la exposición a un nivel inferior de vapor de etanol (por ejemplo, ~ 3 g / dl) y se incrementa gradualmente para compensar el desarrollo de tolerancia metabólica. Durante la aplicación del procedimiento, los investigadores deben seguir de cerca las BEC en diferentes días de gestación para determinar si esto se traduce en niveles más estables en las presas embarazadas. Un inhibidor de la alcohol deshidrogenasa se ha utilizado para prevenir el desarrollo de tolerancia en ratones expuestos a etanol en cámaras de vapor 50. Sin embargo, no se recomienda que este agente puede utilizar en ratones embarazadas porque los estudios sugieren que tiene efectos potencialmente teratogénicos que podrían complicar la interpretación de los resultados 51,52. Además, las inyecciones de cualquier formulario provocar una carga adicional a la presa embarazada,potencialmente de confusión el experimento 53.
En contraste con las presas embarazadas, la exposición cámara de vapor durante el período neonatal no resultó en el desarrollo de la tolerancia metabólica. BEC no fueron diferentes entre P2 y P7-12 ratones. BEC pico fueron similares a los detectados en las presas en el G13-14 y ligeramente más altos que los detectados en G18-20. Sin embargo, las BEC tomó más tiempo para volver a la línea de base en los cachorros. Queda por determinar si la exposición de etanol en cámaras de vapor durante el período de gestación altera la capacidad de la descendencia neonatal para metabolizar etanol. Sin embargo, con base en la literatura, se esperaría para los perritos que fueron expuestos durante la gestación a etanol para exhibir una ligera reducción en la capacidad o sin cambios de metabolizar el etanol 54,55. En nuestros estudios no se observó una diferencia en la media de peso de las crías, y nuestros datos muestran que a finales de la gestación, las CEBs materna apenas se elevan por encima de la intoxicación legal para no morE que 2 horas. Estos datos sugieren que las madres no se vean afectados significativamente por la exposición al alcohol durante el período posterior al parto. No obstante, esto debe estudiarse más a fondo, especialmente si los animales están expuestos a niveles más altos de etanol.
Este paradigma de la exposición presenta algunas limitaciones. Los ratones hembra que no fueron expuestos durante los cinco primeros días del embarazo, ya que son criados con los machos durante este período. Un intervalo más corto de cría se puede intentar (por ejemplo, 2-3 días), pero esto puede resultar en una reducción en el número de hembras que quedan embarazadas. Alternativamente, los animales pueden ser criados durante un tiempo más corto y las hembras comprobado para tapones de copulación. Otra limitación es que todos los ratones en una cámara dada sólo pueden estar expuestos a una sola concentración de vapor de etanol. Por otra parte, algunos aspectos del paradigma de la exposición cámara de vapor de etanol son estresantes, como el hecho de que las represas están alojados individualmente a lo largo de la mayor parte de la gestación y se exponenfuerte olor a etanol. También es posible que la exposición vapor de etanol hace que algunas alteraciones en el sistema respiratorio de presas y / o cachorros. Además, la exposición a ratas neonatales no es un modelo perfecto de la exposición humana durante el tercer trimestre del embarazo (por ejemplo, la unidad-placentaria fetal no está presente en este modelo). Sin embargo, sostenemos que las ventajas de este paradigma son mayores que sus debilidades, y que puede ser un modelo útil para caracterizar los mecanismos implicados en la fisiopatología de TEAF.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Apoyada por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R01-AA015614, R01-AA014973, AA014127 y T32-K12-GM088021. Los autores agradecen a Samantha L. Blomquist para la asistencia técnica y los Dres. Kevin Caldwell y Donald Partridge para evaluar críticamente el manuscrito y video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycarbonate 1/4" clear 48" x 24" | McMaster-Carr | 8574K23 | 10 |
| Foam Rubber bulb seal 3/8"w x 7/32"h | McMaster-Carr | 93085K67 | 10 ft |
| Weld-on #16 | McMaster-Carr | 7515A11 | 3 |
| Piano hinge 12" long | McMaster-Carr | 1658A11 | 2 x 1 ft |
| Hold-down toggle clamps standard | McMaster-Carr | 5126A26 | 8 |
| PEX tubing 1/2" | McMaster-Carr | 51275K88 | 10 ft |
| Barbed Tee tube fitting (Black) Pkg 10 | McMaster-Carr | 5463K608 | 1 |
| Barbed plug fitting (Black) Pkg 10 | McMaster-Carr | 5462K79 | 1 |
| Barbed Elbow tube fitting (Black) Pkg 10 | McMaster-Carr | 5463K596 | 1 |
| 3/8" Through-Wall Adapters, Tube to Threaded Pipe | McMaster-Carr | 5463K851 | 1 |
| Phillips Machine screw 4-40 | McMaster-Carr | 91772A112 | 1 |
| Machine screw hex nut 4-40 | McMaster-Carr | 90480A005 | 1 |
| Panel-mount flowmeter 2-20 | McMaster-Carr | 41945K76 | 3 |
| FLASK, FILTER 1,000 ml 6/PACK | VWR | 89001-800 | 2 |
| Precision Seal Septa | VWR | 89084-490 | 1 |
| VWR Black Rubber Stopper #8 1-hole | VWR | 59581-367 | 1 |
| TUBE TYGON R3603 3/8X9/16 50' | VWR | 89068-556 | 1 |
| TUBE TYGON R3603 1/4X11/16 50' | VWR | 89068-502 | 1 |
| Aerator Stone P2120 | VWR | 32573-007 | 1 |
| 3/8" T-connectors Pk of 20 | VWR | 46600-060 | 1 |
| VWR Disconnectors tapered Pk of 10 | VWR | 46600-110 | 1 |
| 3/8 Hose Barb valved in-line coupling | Colder Products Company | HFCD17612 | 1 |
| Air pump medium capacity | LMI Manufacturers | DB60L | 1 |
| Nexelate Wire Shelving 36"W X 24"D X 63"H | Global industrial | T9A990135 | 1 |
| Stem Casters Set of (4) 5" Polyurethane Wheel | Global industrial | T9A500591 | 1 |
References
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