Summary
Dimostriamo la costruzione di camere di vapori dell'alcol utilizzando materiali facilmente reperibili che ospitano contemporaneamente 6 gabbie del mouse. Descriviamo ulteriormente il loro utilizzo in un modello murino di esposizione fetale da alcol equivalente a tutti i 3 trimestri di gravidanza umana. Questo paradigma espone gli animali durante la gestazione e giorni postnatali 1-12.
Abstract
L'esposizione all'alcol durante lo sviluppo può risultare in una costellazione di anomalie morfologiche e comportamentali che sono collettivamente noti come Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASDs). Alla fine più grave dello spettro è la sindrome alcolica fetale (FAS), caratterizzata da ritardo di crescita, dismorfismi cranio-facciale, e deficit neurocomportamentali. Studi con modelli animali, tra cui roditori, hanno chiarito molti meccanismi molecolari e cellulari coinvolti nella fisiopatologia di FASDs. Somministrazione di etanolo per roditori gravidanza è stato usato per modellare esposizione umana durante il primo e secondo trimestre di gravidanza. Terzo trimestre il consumo di etanolo negli esseri umani è stato modellato utilizzando roditori neonatali. Tuttavia, pochi studi sui roditori hanno caratterizzato l'effetto dell'esposizione all'etanolo durante l'equivalente di tutti e tre i trimestri di gravidanza umana, un modello di esposizione che è comune nelle donne in gravidanza. Qui vi mostriamo come costruire camere di vapore da subito omateriali btainable che possono ciascuno ospitare fino a sei gabbie standard del mouse. Descriviamo un paradigma camera di vapore che può essere utilizzato per modellare l'esposizione a etanolo, con una minima manipolazione, durante tutte tre trimestri. I nostri studi dimostrano che le dighe in gravidanza hanno sviluppato notevole tolleranza metabolica all'etanolo. Tuttavia, i topi neonatale non hanno sviluppato la tolleranza metabolica e il numero di feti, il peso del feto, il peso della placenta, il numero di cuccioli / figliata, il numero di morti cuccioli / figliata, e il peso dei cuccioli non è risultata significativamente influenzata dall'esposizione etanolo. Un importante vantaggio di questo paradigma è la sua applicabilità a studi con topi geneticamente modificati. Inoltre, questo paradigma riduce al minimo la manipolazione degli animali, un importante confondere nella ricerca alcolica fetale.
Introduction
Bere durante la gravidanza può danneggiare il feto, causando alterazioni persistenti in molti organi e sistemi che riducono in modo significativo la qualità della vita per le persone colpite e delle loro famiglie. Si stima che circa il 10-30% delle donne beve durante la gravidanza negli Stati Uniti, con il 1-8% di bere in un modello di 1,2 binge. La gamma di effetti prodotti dall'esposizione etanolo durante lo sviluppo fetale è collettivamente noti come disturbi dello spettro fetale alcolica (FASDs). Stime recenti indicano che FASDs sono un problema di salute pubblica con una prevalenza fino al 2-5% negli USA 3. Il più grave manifestazione di FASDs è la sindrome alcolica fetale (FAS), che è caratterizzata da ritardo di crescita, anomalie cranio-facciali, e deficit neurocomportamentali, tra cui difficoltà di apprendimento. La prevalenza di FAS è stata stimata essere 0,2-0,7% negli Stati Uniti 3. I trattamenti attualmente disponibili per FASDs sono solo parzialmente efficacie sviluppo di trattamenti più efficaci è limitata dalla scarsa comprensione delle basi cellulari e molecolari di questo complesso spettro di disturbi.
I dati dei Birth Defects Prevention Study nazionali (NBDPS) indicano che le donne incinte più frequentemente bevono durante il 1 ° trimestre, prima della gravidanza è stato rilevato, seguita da astinenza durante le fasi successive della gestazione 2. Il NBDPS anche scoperto che il secondo modello più comune del consumo di etanolo durante la gestazione comporta potabile in tutte le trimestri di gravidanza 2. Le ragioni di questo sono la mancanza di consapevolezza circa gli effetti potenzialmente nocivi di esposizione fetale etanolo (anche a basse dosi), accesso limitato alle cure prenatali, anamnesi positiva per disturbi neuropsichiatrici, e l'abuso o dipendenza da etanolo 4. È interessante notare che il NBDPS riferito che il terzo modello più comune di consumo coinvolto astinenza durante la 1
Nel tentativo di modellare i diversi modelli di consumo di etanolo osservati in donne in gravidanza, un numero di sviluppo paradigmi esposizione etanolo sono state definite utilizzando diverse specie animali, ratti e topi essendo 5,6 più comune. La durata della gravidanza in questi animali tipicamente lasts circa 3 settimane, che corrisponde al 1 ° e 2 nd trimestre di gravidanza umana. Molti studi sui roditori hanno valutato l'impatto di varie dosi e modelli di esposizione all'etanolo durante questo periodo. Esempi dei metodi frequentemente utilizzati per amministrare etanolo per topi e ratti in gravidanza includono la somministrazione tramite diete liquide 7,8, aggiunta di etanolo all'acqua potabile 9,10, bere volontaria di soluzioni saccarina dolcificata 11, sonda gastrica gastrica 12, l'inalazione dei vapori 13 e iniezione sottocutanea o intraperitoneale 14. I risultati di questi studi hanno ricapitolato molti dei deficit riscontrati negli esseri umani con FASDs, dimostrando che l'esposizione durante le prime fasi della gravidanza è sufficiente a danneggiare i circuiti neuronali attraverso il cervello (recensito in 6,15).
Esperimenti con roditori hanno dimostrato che l'esposizione durante la equivalente al 3 16-18, intubazione intragastrica 19, iniezione sottocutanea 20 e vapore inalazione 21,22. Questi studi hanno dimostrato in modo convincente che la crescita scatto cervello è un periodo di elevata vulnerabilità agli effetti sullo sviluppo di etanolo 6.
Come accennato in precedenza, potabile durante tutte trimestre di gravidanza è un modello comune di consumo di etanolo in donne 2. Tuttavia, relativamente pochi studi hanno valutato l'impatto di questo modello di esposizione utilizzando modelli animali. Alcuni di questi studi hanno preso advantage di grandi animali dove avviene il 3 ° trimestre equivalente in utero piuttosto che il periodo neonatale come nel caso di ratti e topi. Questi modelli animali sono primati non umani 23,24 e le pecore 25-27. Tuttavia, questi modelli animali non sono stati ampiamente utilizzato nella ricerca FASDs, in parte, a causa del costo elevato e la necessità di strutture di cura specializzati. Roditori sono stati più comunemente usati per caratterizzare l'effetto di tutto trimestre etanolo esposizione sullo sviluppo fetale 5. Le cavie sono state particolarmente vantaggiosa in questo senso dato il loro ampio sviluppo prenatale e similarità nella maturazione del cervello a quello umano 28,29. Con cavie, è stato possibile caratterizzare l'effetto di etanolo esposizione in utero che comprende il periodo di sviluppo equivalente della umana 3 ° trimestre. Il costo relativamente elevato di questi animali, così come la durata relativamente lunga della gravidanza(~ 67 giorni), ha limitato il loro utilizzo per un paio di laboratori che lavorano sulla ricerca FASDs.
A causa del loro utilizzo costo-efficacia e in largo nella ricerca biomedica, i ricercatori hanno usato topi per modellare l'esposizione all'etanolo durante tutti i trimestri di gravidanza. Negli studi iniziali, i ratti sono stati esposti durante la gravidanza attraverso diete liquide seguita dalla somministrazione di etanolo tramite gastrostomia per allevati artificialmente neonati (giorni postnatali (P) 1-10) con conseguente picco dei livelli di etanolo nel sangue (BEC) nelle dighe di 0,08 g / dl e nei cuccioli 0.16 g / dl. Questo paradigma ha causato alterazioni duraturi in ottica mielinizzazione del nervo e ha ridotto il numero di fibre glia Bergmann nel cervelletto 30-32. Allo stesso modo, Maier e collaboratori con condizioni di allevamento artificiali somministrati etanolo per le dighe di ratto in gravidanza in modo binge-like tramite intubazione intragastrica seguita dalla somministrazione neonatale durante parte del 3 ° trimestre equivalente (P4-9) 33,34. PEAK BEC materne e pup erano 0,3 g / dl sia giorno di gestazione 20 e P6. Questo paradigma esposizione all-trimestre ha provocato un ritardo di crescita che era significativamente maggiore rispetto a quella osservata in cuccioli esposti durante i periodi selezionati di gestazione 33. Inoltre, ratti esposti a etanolo durante l'equivalente di tutti trimestre mostravano una riduzione del numero di cerebellare Purkinje e granuli che era maggiore di quello osservato in animali esposti durante altri periodi 34. Riduzione del numero delle cellule dell'ippocampo sono stati segnalati anche con questo paradigma, ma questi effetti sembrano essere principalmente a seguito di esposizione durante il 3 ° trimestre equivalente 35. Un metodo che prevede la somministrazione di etanolo via intragastrica sonda gastrica per entrambe le ratte gravide e topi neonatale è stato utilizzato anche per modellare tutti trimestre l'esposizione 36. Questo metodo, che ha prodotto BECs di 0,13 g / dl nelle femmine (giorno di gestazione 17) e 0,24 g / dl in cuccioli P6, lon indottadella durata di g-alterazioni nei livelli dei neurotrasmettitori monoamine nell'ippocampo e nell'ipotalamo, e una maggiore espressione di DNA metiltransferasi e metil CpG proteine 2 vincolanti nell'ippocampo 37,38. Utilizzando un paradigma simile esposizione (BEC = 0,14-0,2 g / dl nelle dighe e 0,2 g / dl nei cuccioli), Gil-Mohapel et al. 39 rilevato un aumento del numero di nuovi neuroni immaturi nel giro dentato di ratti adulti che può rappresentare un meccanismo di compensazione per il danno neuronale indotta da etanolo o un'alterazione nella maturazione dei neuroni adulti nati. Gli investigatori hanno anche tentato di modellare qualsiasi esposizione trimestre etanolo esponendo dighe via diete liquide o l'acqua potabile sia durante la gravidanza e l'allattamento 9,40. Tuttavia, l'utilità di esporre i cuccioli attraverso il latte materno è limitata, perché in genere si traduce in BECs bassa pup (ad esempio, ,002-,05 g / dl; 41,42).
I topi sono stati utilizzati anche extenstivamente per caratterizzare gli effetti dell'esposizione etanolo sviluppo. Questo modello animale condivide molte delle forze sopra descritti per il modello animale di ratto, con il vantaggio aggiuntivo che molti ceppi di topi geneticamente modificati sono disponibili 5. I topi sono stati utilizzati con successo per caratterizzare gli effetti di etanolo durante il 1 °, 2 ° o 3 trimestri di gravidanza rd 43,44. Tuttavia, l'impatto di una esposizione trimestre su questi animali non è stato ben caratterizzato perché è tecnicamente più difficile da esporre topi durante l'equivalente di tutti trimestre di gravidanza umana. Ad esempio, l'allevamento artificiale e gavage gastrica, che sono stati utilizzati con successo nei ratti, richiedono procedure più specializzati nei topi 45. Per quanto a nostra conoscenza, solo uno studio finora ha cercato di studiare l'effetto di una esposizione trimestre etanolo utilizzando topi; questi animali sono stati esposti a soluzione di etanolo in acqua potabile during gravidanza e allattamento 46. BEC materni erano 0,07 g / dl e pup BEC non sono stati determinati, ma dovrebbero essere una frazione di quelli in dighe.
Qui, descriviamo un nuovo modello per l'esposizione tutti trimestre etanolo di topi in cui l'alcol viene somministrato ad entrambi dighe e neonati in stato di gravidanza attraverso le camere di inalazione di vapori. Camere di vapore sono state costruite sulla base di un progetto precedente 47. Noi forniamo istruzioni dettagliate su come costruire le camere di inalazione ed eseguire le procedure di esposizione. Forniamo anche informazioni sui BECs che possono essere raggiunti e l'impatto dell'esposizione sulla sopravvivenza della prole e la crescita.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure di animali sono state approvate dalla University of New Mexico Scienze della Salute-Centro Institutional Animal Care ed uso comitato.
1. Vapor Chamber Assembly
- Tagliare i fogli di policarbonato con una sega circolare o seghetto alle dimensioni previste nel video per la parte superiore, inferiore, anteriore, posteriore, lati e porta (Figura 1 e Tabella 1).
- Con una sega circolare o seghetto, tagliare un'apertura alta 8 pollici da 16 pollici di larghezza nel mezzo del pannello frontale.
- Misurare e segnare i fori per la cerniera pianoforte sul 18 pollici da 10 pollici foglio di policarbonato che diventerà la porta della camera.
- Nella porta, fori lavello contatore con un bit 5/16 di pollice trapano, e con un bit 3/16 di pollice trapano, praticare il foro per le viti. Assicurarsi praticare fori lavello contatore sulla parte interna della porta per le teste delle viti.
- Preparare le lastre in policarbonato per la saldatura.
- Montare front, pannelli posteriori e laterali sul pannello inferiore utilizzando saldare # 16.
- Sigillare eventuali lacune tra i pannelli con Weld-on # 16.
- Fissare il pannello superiore con saldare # 16.
- Utilizzare pinze a barre o libri di testo pesanti per tenere tutto a posto, mentre le saldature cura.
- Attaccare un 1 pollice da un pezzo 12 pollici di policarbonato sulla parte anteriore del pannello 1 pollice sotto l'apertura per il fissaggio della cerniera della porta.
- Lasciare almeno 24 ore per saldare per curare.
- Tagliate due pezzi di tubo PEX 12 centimetri di lunghezza e 1 pezzo di tubo PEX lungo 1 pollice.
- Con un bit 5/16 trapano, praticare un foro in ciascuno dei tubi PEX 12 pollici circa 1 a 2 pollici da un'estremità.
- Collegare il tubo PEX 2 x 12 pollici a un connettore a T 3/8 pollici con i fori situati lontano dal connettore.
- Tappare le estremità aperte dei tubi PEX con tappi da 3/8 di pollice.
- Fissare la cerniera pianoforte al pannello frontale e porta con 4-40 viti e dadi macchina.
- Utilizzando la porta come guida, marca i fori necessari per la cerniera del piano sul distanziale 1 pollice sul pannello anteriore della camera.
- Con un po '3/16 di pollice trapano, praticare i fori nel pannello frontale per la cerniera pianoforte.
- Fissare la porta e pianoforte cerniera al pannello frontale con 4-40 viti e dadi macchina.
- Assemblare i morsetti a ginocchiera come mostrato nel video con una rondella e dado su entrambi i lati del braccio laterale.
- Marco e trapano 3/16 fori pollici per l'interruttore morsetti sul pannello frontale e allegare Morsetti a ginocchiera con 4-40 viti e dadi macchina.
- Aggiungere guarnizioni gommino 3/8 pollici per l'interno della porta.
- Con un noioso punta 5/8 di pollice, praticare un foro al centro del pannello superiore della porta di ingresso.
- Praticare un foro di 1/2 pollice in basso / centro del pannello posteriore per la porta di uscita.
- Montare la porta di uscita spingendo la parte filettata del 3/8 di pollice attraverso parete adattatori attraverso la parete di fondo della camera di vapore nel foro porta di uscita. Fissare il dado dalinterno della camera per tenere in posizione.
- Rimuovere la copertura di protezione da lastre in policarbonato.
- Fissare il pezzo 1 pollice di tubo PEX al connettore a T e forzare il tubo PEX attraverso il foro nella parte superiore della camera dall'interno.
- Attaccare a 3/8 di pollice 90 gomito all'inizio del tubo PEX 1 pollice dall'esterno.
NOTA: Praticare un foro da 1/2 pollice nella porta e inserire una setti di tenuta 1/2 pollice nel foro. - Ripetere i passaggi 1-22 per l'aria di controllo unico da camera.
2. Rack e all'Assemblea Air consegna
- Se il posizionamento delle camere sul carrello / cremagliera menzionato nell'elenco materiale, montare il carrello secondo le istruzioni del produttore.
- Con i dadi e bulloni di ricambio, allegare un pezzo pezzo di policarbonato al rack per contenere i regolatori di flusso d'aria.
- Ovunque sul pezzo pezzo di policarbonato, marchio e trapano 3/4 di pollice di buchi per i regolatori di flusso d'aria e attaccare i regolatori con i dadidisponibile.
- Attaccare 3/8 di pollice attraverso parete adattatore per le porte di ingresso e di uscita dei regolatori di flusso d'aria.
- Montare il pallone etanolo con la pietra di aerazione, # 8 tappo e sgancio rapido in linea connettori.
- Uso 3/8 di pollice tubi TYGON, collegare i regolatori di flusso per la pompa dell'aria e pallone etanolo come mostrato in Figura 1.
- Per l'unica camera d'aria, collegare la porta di uscita del regolatore di flusso d'aria verso l'ingresso 3/8 di pollice 90 gomito con tubo TYGON 3/8 di pollice, come mostrato nella Figura 1.
Figura 1. Rappresentazione schematica della configurazione delle camere di vapore. Un connettore a T è collegato alla pompa di aria a basso rumore. Un lato del connettore a T è direttamente collegato ad un regolatore di flusso d'aria per il solo aria camera vapore. Gli altri side è diviso di nuovo e collegato a due diversi regolatori di flusso d'aria, uno per l'aria e uno per l'etanolo. La camera d'aria è direttamente collegato al regolatore come mostrato. Per la camera di vapore etanolo, un regolatore di flusso d'aria è collegata alla pietra aeratore immerso in etanolo liquido nel pallone filtro. Il braccio porta laterale del pallone filtro è collegato con l'uscita del regolatore dell'aria come indicato. Il vapore etanolo fuse e aria viene poi collegata all'ingresso della camera di vapore etanolo. I tubi di scarico (non mostrati) sono collegati ad una presa di ventilazione nella stanza.
3. Prova Vapor Chambers e regolare i livelli Etanolo
- Aggiungere 600 ml di etanolo 190 prova al pallone filtro, inserire la pietra aerazione, e collegare a Ingresso di tubo al braccio laterale del pallone.
- Chiudere porte delle camere e accendere la pompa di aria.
- Regolare regolatori di flusso d'aria in modo che circa la metà di quanto l'aria passa attraverso l'alcol liquido come l'aria viene miscelata con. Adjust l'aria solo flusso d'aria al flusso combinato di alcol e l'aria della camera di etanolo.
- Consentire camere equilibrare per almeno 30 minuti prima di misurare la concentrazione di etanolo aria.
- Misurare la concentrazione di etanolo aria estraendo 5 ml di aria con un ago 18G e una siringa da 60 ml attraverso il setto. Diluire il campione con aria ambiente disegnando lo stantuffo per 60 ml (01:12 diluizione). Misurare il livello di etanolo aria usando un etilometro secondo le istruzioni del produttore. È necessaria la diluizione dell'aria della camera di raggiungere livelli di vapore di alcol nel campo di rilevamento del etilometro.
NOTA: Se si utilizza diversi livelli di esposizione alcol diluizione potrebbe essere necessario modificare. - Come punto di partenza, regolare i regolatori di flusso d'aria in modo da ottenere una concentrazione di alcol aria di circa 4,5-5 g / dl (g di alcol vaporizzato per dl di aria).
4. Allevamento di animali
- Femmine House Group C578BL / 6 topi (2-3 mesi) per almeno 1 settimana per sincronizzare i cicli ovarici.
- Ospitare autonomamente maschio topi C57BL / 6 (2-5 mesi) per almeno 2 settimane.
- Dopo la sincronizzazione, mettere una donna sola con un singolo maschio per 5 giorni per consentire l'accoppiamento.
- Dopo l'accoppiamento, rimuovere maschi e femmine singolarmente casa e metterli nelle camere.
5. Pre-e post-natale Etanolo Vapor Esposizione
- Esporre dighe gravidanza di vapori di etanolo per 4 ore al giorno a partire dalle 10:00 durante il ciclo di luce (luci a partire da 06:00-18:00), tranne il giorno della nascita per prevenire la morte dei cuccioli.
- Pesare dighe giorno di gestazione (G) 5, G13-G14 e G18-G20 per monitorare le gravidanze; biancheria da letto era cambiato nei giorni in cui le femmine sono stati pesati per ridurre al minimo la manipolazione.
- Ogni giorno sostituire il cibo per i gruppi etanolo esposto evitare il consumo di pellets con qualsiasi etanolo assorbito in loro.
- Il giorno dellala nascita non esporre gli animali. Dopo la nascita esporre le dighe ei cuccioli per 4 ore al giorno a partire dalle 10:00 da P1-P12.
- Pesare cuccioli su P2, P8, P12, e P25; e cambiare la biancheria da letto su P8 e P12 per ridurre al minimo la movimentazione aggiuntiva.
- Subito dopo l'ultima esposizione (P12), trasferire le gabbie di un animale stanza custodia standard.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figura 2A mostra che sia i topi in gravidanza e prole neonatale sono stati esposti a concentrazioni di vapori di etanolo relativamente stabili nelle camere. Questi variavano tra 4-6 g / dl. Figura 2B mostra i BECs conseguiti nei topi in gravidanza in funzione del tempo. BEC sono stati misurati utilizzando un alcool deidrogenasi standard basato dosaggio 48. A G5, BECs rapidamente salito a ~ 60 mM 2 ore dopo l'inizio dell'esposizione e ha raggiunto la fine del periodo di esposizione 4 hr. BEC gradualmente diminuito a ~ 12 mm dopo un ulteriore 4 ore dopo la fine dell'esposizione. Con G13-14, c'è stata una diminuzione drastica del BEC a circa il 60% dei livelli rilevati al G5. Inoltre, i livelli BECs aumentati più lentamente e diminuite più rapidamente, con un conseguente minore presenza di etanolo nel sangue dei topi in gravidanza. A breve termine (G18-20), BEC sono stati ulteriormente ridotti a circa il 30% dei livelli rilevati al G5. Questi risultati sono coerenti con il developmento di una rapida tolleranza metabolica all'etanolo nei topi in gravidanza. figura 2C mostra che la prole neonatale sono stati esposti a BECs vicino a 30 mm. BECs gradualmente aumentato in questi animali, con un picco al termine del periodo di esposizione 4 ore e diminuendo gradualmente ai livelli basali 8 ore dopo la fine del paradigma un'esposizione di 4 ore. In contrasto con le dighe in gravidanza, non c'era differenza tra BECs misurati nei neonati che sono stati esposti precoce (P2) vs tardiva (P7-P12) nel periodo neonatale. Questi risultati indicano che i topi neonatale non ha sviluppato tolleranza metabolica all'etanolo.
Figura 2. Caratterizzazione dei livelli di etanolo. A) i livelli di camera di vapore di etanolo è rimasto relativamente costante durante le fasi di gestazione e postnatali del paradig dell'esposizionem. Per misurare questi livelli, l'aria della camera è stato ritirato con una siringa attraverso il setto di gomma, diluito con aria ambiente, ed espulso nella porta di ingresso di un etilometro (vedi video per i dettagli). I valori sono stati ottenuti da 5 e 4 diversi turni di esposizione per le fasi di gestazione e postnatale, rispettivamente. B) i livelli di etanolo nel sangue misurati in diversi momenti per i giorni gestazionale indicati stimati in dighe in gravidanza (n = 5-7 dighe). Il limite intossicazione legale (17.4 mM o 0,08 g / dl) è indicato dalla linea tratteggiata. La barra grigia indica il tempo le dighe sono stati esposti a etanolo. C) Uguale in B, ma per topi neonati (n = 5-9 cuccioli provenienti da diverse cucciolate).
La Figura 3 mostra che il paradigma esposizione non ha influenzato significativamente l'aumento di peso in dighe o cuccioli. Tabella 2 mostra che l'esposizione etanolo non ha influenzato significativamente il numero di Fetu praticabileses, numero di feti riassorbimento, il peso del feto, e il peso della placenta (misurata a breve termine). Tabella 2 mostra anche che il numero di cuccioli per figliata e mortalità dei cuccioli non è risultata significativamente influenzata dall'esposizione etanolo. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Mancanza di un effetto di etanolo esposizione sulla diga e pup pesi. A) Dam aumento di peso in funzione del giorno di gestazione stimato (n = 8-12). Il peso al presumibile giorno gestazionale 5 corrisponde al peso misurata sul primo giorno di esposizione B) Pup guadagno. Peso in funzione dell'età (n = 7-9). Per entrambi i pannelli, le barre di errore sono inferiori ai simboli. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51839/51839fig3highres.jpg" target = "_blank"> Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Dimensioni (cm) | Altezza | Larghezza |
| Superiore | 32 | 22 |
| Fondo | 32 | 22 |
| Anteriore | 32 | 14 |
| Indietro | 32 | 14 |
| Side 1 | 21.5 | 14 |
| Side 2 | 21.5 | 14 |
| Porta | 18 | 10 |
Tabella 1. Misure di lastre in policarbonato.
| Aria | EtOH | |
| 7.50 ± 1.08, n = 6 | 7.33 ± 1.52, n = 6 | |
| Media Feto Peso (g): ~ E18 | 1.04 ± 0.09, n = 6 | 0.82 ± 0.09, n = 6 |
| Media Placenta Peso (g): ~ E18 | 0.12 ± 0.003, n = 6 | 0,14 ± 0,01, n = 6 |
| Numero di feti Re-assorbite: ~ E18 | 0,50 ± 0,34, n = 6 | 0.50 ± 0.50, n = 6 |
| Numero di cuccioli / figliata | 7.11 ± 0.67, n = 9 | 6.89 ± 0.42, n = 9 |
| Numero di morti cuccioli / figliata | 0.11 ± 0.11, n = 9 | 0,66 ± 0,24, n = 9 |
Tabella 2. Pre-e caratterizzazione post-natale del mouse del paradigma di esposizione al vapore.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Qui, descriviamo in dettaglio i metodi per la costruzione delle camere di inalazione di vapori. I materiali e gli strumenti necessari per costruire le camere sono prontamente disponibili un certo numero di fornitori commerciali e la procedura per la costruzione delle camere sono relativamente semplici. Il sistema che descriviamo qui non contiene valvole di ritegno in linea per impedire il riflusso e la miscelazione. Siamo stati in grado di misurare qualsiasi etanolo rilevabile in aria solo camere che suggeriscono che non abbiamo alcuna miscelazione o riflusso di etanolo in aria solo camere. L'aria solo camere devono essere controllati al vapore etanolo periodicamente (occorre notare che la camera d'aria deve sempre essere testato prima camera di etanolo per evitare il rilevamento di vapore etanolo residuo presente nel etilometro e / o siringa). Idealmente, le camere devono essere collocati in ambienti dedicati alla funzione di cura degli animali dove gabbie mouse possono essere alloggiati in continuo per tutta la durata della eparadigma Xposure, eliminando la necessità di trasportare i topi, riducendo così lo stress. Una camera standard con una presa di ventilazione è tutto ciò che è necessario per questo paradigma. Tuttavia, se la camera è condiviso con altri ricercatori, può essere necessario collocare le camere in una camera con cabine separate per ridurre al minimo l'esposizione di altri animali di etanolo odore. Ogni camera può ospitare fino a 6 gabbie standard del mouse, rendendolo un metodo meno lavoro intensivo di esposizione rispetto, per esempio, sonda gastrica intragastrico.
Il paradigma esposizione può essere facilmente modificato secondo il requisito di un esperimento specifico. Gli animali possono essere esposti a etanolo durante l'equivalente di tutti trimestre di gravidanza umana. Va notato che l'equivalente sviluppo roditore allo sviluppo umano può variare a seconda di ciò regione del cervello è considerato e quello dello sviluppo processo si è interessati (neurogenesi, integrazione sinaptica, etc). In questo studio, abbiamo definito il terzo triMester equivalente come il periodo di picco di crescita del cervello. I ricercatori sono invitati a consultare il sito tempo 49 traducendo. Sulla base dei risultati mostrati in Figura 2B, si raccomanda che l'esposizione essere avviato ad un livello inferiore di vapore etanolo (ad esempio, ~ 3 g / dl) e gradualmente aumentata per compensare lo sviluppo di tolleranza metabolica. Durante l'esecuzione della procedura, gli investigatori dovrebbero monitorare attentamente BECs a diversi giorni di gestazione per determinare se questo si traduce in livelli più stabili nelle dighe in gravidanza. Un inibitore di alcol deidrogenasi è stato usato per prevenire lo sviluppo di tolleranza in topi esposti a etanolo in camere di vapore 50. Tuttavia, non è consigliabile che questo agente essere utilizzato in topi incinta, perché gli studi suggeriscono che ha effetti potenzialmente teratogeni che potrebbero complicare l'interpretazione dei risultati 51,52. Inoltre, le iniezioni di qualsiasi forma causerà ulteriore stress alla diga di gravidanza,potenzialmente confondere l'esperimento 53.
A differenza di dighe in gravidanza, l'esposizione della camera di vapore nel periodo neonatale non ha comportato lo sviluppo di tolleranza metabolica. BEC non erano diversi tra P2 e P7-12 topi. BEC picco erano simili a quelli rilevati nelle dighe di G13-14 e leggermente più alti di quelli rilevati a G18-20. Tuttavia, BEC ha richiesto più tempo per tornare alla linea di base nei cuccioli. Resta da stabilire se l'esposizione di etanolo nelle camere di vapore durante il periodo gestazionale altera la capacità della prole neonatale di metabolizzare l'etanolo. Tuttavia, sulla base della letteratura, ci si aspetterebbe per cuccioli che sono stati esposti durante la gestazione in etanolo per esibire una leggera diminuzione o immutata capacità di metabolizzare l'etanolo 54,55. Nei nostri studi non abbiamo osservato una differenza di peso medio dei cuccioli, ei nostri dati mostrano che entro la fine della gestazione, le BECs materni appena salgono al di sopra della intossicazione legale per nessun more di 2 ore. Questi dati suggeriscono che le madri non è significativamente influenzata dalla esposizione all'alcol durante il periodo post-natale. Tuttavia, questo dovrebbe essere esplorato ulteriormente, soprattutto se gli animali sono esposti a livelli elevati di etanolo.
Questo paradigma esposizione presenta alcune limitazioni. Topi femmina non sono stati esposti durante i primi cinque giorni di gravidanza perché sono allevati con i maschi in questo periodo. Un intervallo di allevamento più breve può essere tentata (es. 2-3 giorni) ma puo causare una riduzione del numero di femmine che diventano incinta. In alternativa, gli animali possono essere allevati per un tempo più breve e femmine controllato per spine copulazione. Un'altra limitazione è che tutti i topi in un determinato camera possono essere esposti ad una sola concentrazione di vapore di etanolo. Inoltre, alcuni aspetti del vapore etanolo paradigma esposizione camera sono stressanti, come il fatto che le dighe sono alloggiati singolarmente durante la maggior parte gestazione e sono espostia forte odore di etanolo. E 'anche possibile che l'esposizione al vapore di etanolo provoca alcune alterazioni nel sistema respiratorio di dighe e / o cuccioli. Inoltre, l'esposizione di ratti neonati non è un modello ideale di esposizione umana durante il terzo trimestre (ad esempio, l'unità placentare-fetale non è presente in questo modello). Tuttavia, riteniamo che i vantaggi di questo paradigma superano i suoi punti deboli, e che può essere un modello utile per caratterizzare i meccanismi coinvolti nella fisiopatologia di FASDs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Sostenuto dal National Institutes of Health concede R01-AA015614, R01-AA014973, T32-AA014127 e K12-GM088021. Gli autori ringraziano Samantha L. Blomquist per l'assistenza tecnica e Drs. Kevin Caldwell e Donald Partridge per valutare criticamente il manoscritto e video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycarbonate 1/4" clear 48" x 24" | McMaster-Carr | 8574K23 | 10 |
| Foam Rubber bulb seal 3/8"w x 7/32"h | McMaster-Carr | 93085K67 | 10 ft |
| Weld-on #16 | McMaster-Carr | 7515A11 | 3 |
| Piano hinge 12" long | McMaster-Carr | 1658A11 | 2 x 1 ft |
| Hold-down toggle clamps standard | McMaster-Carr | 5126A26 | 8 |
| PEX tubing 1/2" | McMaster-Carr | 51275K88 | 10 ft |
| Barbed Tee tube fitting (Black) Pkg 10 | McMaster-Carr | 5463K608 | 1 |
| Barbed plug fitting (Black) Pkg 10 | McMaster-Carr | 5462K79 | 1 |
| Barbed Elbow tube fitting (Black) Pkg 10 | McMaster-Carr | 5463K596 | 1 |
| 3/8" Through-Wall Adapters, Tube to Threaded Pipe | McMaster-Carr | 5463K851 | 1 |
| Phillips Machine screw 4-40 | McMaster-Carr | 91772A112 | 1 |
| Machine screw hex nut 4-40 | McMaster-Carr | 90480A005 | 1 |
| Panel-mount flowmeter 2-20 | McMaster-Carr | 41945K76 | 3 |
| FLASK, FILTER 1,000 ml 6/PACK | VWR | 89001-800 | 2 |
| Precision Seal Septa | VWR | 89084-490 | 1 |
| VWR Black Rubber Stopper #8 1-hole | VWR | 59581-367 | 1 |
| TUBE TYGON R3603 3/8X9/16 50' | VWR | 89068-556 | 1 |
| TUBE TYGON R3603 1/4X11/16 50' | VWR | 89068-502 | 1 |
| Aerator Stone P2120 | VWR | 32573-007 | 1 |
| 3/8" T-connectors Pk of 20 | VWR | 46600-060 | 1 |
| VWR Disconnectors tapered Pk of 10 | VWR | 46600-110 | 1 |
| 3/8 Hose Barb valved in-line coupling | Colder Products Company | HFCD17612 | 1 |
| Air pump medium capacity | LMI Manufacturers | DB60L | 1 |
| Nexelate Wire Shelving 36"W X 24"D X 63"H | Global industrial | T9A990135 | 1 |
| Stem Casters Set of (4) 5" Polyurethane Wheel | Global industrial | T9A500591 | 1 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). World Health Organization Who. Alcohol use and binge drinking among women of childbearing age--United States. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 61 (28), 534-538 (2012).
- Ethen, M. K., et al. Alcohol consumption by women before and during pregnancy. Matern Child Health J. 13, 274-285 (2009).
- May, P. A., et al. Prevalence and epidemiologic characteristics of FASD from various research methods with an emphasis on recent in-school studies. Dev Disabil Res Rev. 15, 176-192 (2009).
- Wendell, A. D. Overview and epidemiology of substance abuse in pregnancy. Clin Obstet Gynecol. 56, 91-96 (2013).
- Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Exp Biol Med (Maywood. 230, 389-393 (2005).
- Valenzuela, C. F., Morton, R. A., Diaz, M. R., Topper, L. Does moderate drinking harm the fetal brain? Insights from animal models). Trends Neurosci. 35, 284-292 (2012).
- Sliwowska, J. H., Song, H. J., Bodnar, T., Weinberg, J. Prenatal Alcohol Exposure Results in Long-Term Serotonin Neuron Deficits in Female Rats: Modulatory Role of Ovarian Steroids. Alcohol Clin. Exp. Res. 10, (2013).
- Sutherland, R. J., McDonald, R. J., Savage, D. D. Prenatal exposure to moderate levels of ethanol can have long-lasting effects on hippocampal synaptic plasticity in adult offspring. Hippocampus. 7, 232-238 (1997).
- Naassila, M., Daoust, M. Effect of prenatal and postnatal ethanol exposure on the developmental profile of mRNAs encoding NMDA receptor subunits in rat hippocampus. J Neurochem. 80, 850-860 (2002).
- Servais, L., et al. Purkinje cell dysfunction and alteration of long-term synaptic plasticity in fetal alcohol syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9858-9863 (2007).
- Brady, M. L., Allan, A. M., Caldwell, K. K. A limited access mouse model of prenatal alcohol exposure that produces long-lasting deficits in hippocampal-dependent learning and memory. Alcohol Clin Exp Res. 36, 457-466 (2012).
- Bake, S., Tingling, J. D., Miranda, R. C. Ethanol exposure during pregnancy persistently attenuates cranially directed blood flow in the developing fetus: evidence from ultrasound imaging in a murine second trimester equivalent model. Alcohol Clin Exp Res. 36, 748-758 (2012).
- Cuzon, V. C., Yeh, P. W., Yanagawa, Y., Obata, K., Yeh, H. H. Ethanol consumption during early pregnancy alters the disposition of tangentially migrating GABAergic interneurons in the fetal cortex. J Neurosci. 28, 1854-1864 (2008).
- Godin, E. A., et al. Magnetic resonance microscopy defines ethanol-induced brain abnormalities in prenatal mice: effects of acute insult on gestational day 7. Alcohol Clin Exp Res. 34, 98-111 (2010).
- Gil-Mohapel, J., Boehme, F., Kainer, L., Christie, B. R. Hippocampal cell loss and neurogenesis after fetal alcohol exposure: insights from different rodent models. Brain Res Rev. 64, 283-303 (2010).
- Diaz, J., Samson, H. H. Impaired brain growth in neonatal rats exposed to ethanol. Science. 208, 751-753 (1980).
- Stanton, M. E., Goodlett, C. R. Neonatal ethanol exposure impairs eyeblink conditioning in weanling rats. Alcohol Clin Exp Res. 22, 270-275 (1998).
- West, J. R., Hamre, K. M., Pierce, D. R. Delay in brain growth induced by alcohol in artificially reared rat pups. Alcohol. 1, 213-222 (1984).
- Tran, T. D., Stanton, M. E., Goodlett, C. R. Binge-like ethanol exposure during the early postnatal period impairs eyeblink conditioning at short and long CS-US intervals in rats. Dev Psychobiol. 49, 589-605 (2007).
- Ikonomidou, C., et al. Ethanol-induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome. Science. 287, 1056-1060 (2000).
- Heaton, M. B., Paiva, M., Madorsky, I., Siler-Marsiglio, K., Shaw, G. Effect of bax deletion on ethanol sensitivity in the neonatal rat cerebellum. J Neurobiol. 66, 95-101 (2006).
- Ryabinin, A. E., Cole, M., Bloom, F. E., Wilson, M. C. Exposure of neonatal rats to alcohol by vapor inhalation demonstrates specificity of microcephaly and Purkinje cell loss but not astrogliosis. Alcohol Clin Exp Res. 19, 784-791 (1995).
- Kraemer, G. W., Moore, C. F., Newman, T. K., Barr, C. S., Schneider, M. L. Moderate level fetal alcohol exposure and serotonin transporter gene promoter polymorphism affect neonatal temperament and limbic-hypothalamic-pituitary-adrenal axis regulation in monkeys. Biol Psychiatry. 63, 317-324 (2008).
- Schneider, M. L., et al. Moderate-level prenatal alcohol exposure alters striatal dopamine system function in rhesus monkeys. Alcohol Clin Exp Res. 29, 1685-1697 (2005).
- Ramadoss, J., Hogan, H. A., Given, J. C., West, J. R., Cudd, T. A. Binge alcohol exposure during all three trimesters alters bone strength and growth in fetal sheep. Alcohol. 38, 185-192 (2006).
- Ramadoss, J., Lunde, E. R., Pina, K. B., Chen, W. J., Cudd, T. A. All three trimester binge alcohol exposure causes fetal cerebellar purkinje cell loss in the presence of maternal hypercapnea, acidemia, and normoxemia: ovine model. Alcohol Clin Exp Res. 31, 1252-1258 (2007).
- Ramadoss, J., Tress, U., Chen, W. J., Cudd, T. A. Maternal adrenocorticotropin, cortisol, and thyroid hormone responses to all three-trimester equivalent repeated binge alcohol exposure: ovine model. Alcohol. 42, 199-205 (2008).
- Byrnes, M. L., Reynolds, J. N., Brien, J. F. Brain growth spurt-prenatal ethanol exposure and the guinea pig hippocampal glutamate signaling system. Neurotoxicol Teratol. 25, 303-310 (2003).
- Catlin, M. C., Abdollah, S., Brien, J. F. Dose-dependent effects of prenatal ethanol exposure in the guinea pig. Alcohol. 10, 109-115 (1993).
- Phillips, D. E., Krueger, S. K. Effects of combined pre- and postnatal ethanol exposure (three trimester equivalency) on glial cell development in rat optic nerve. Int J Dev Neurosci. 10, 197-206 (1992).
- Phillips, D. E., Krueger, S. K., Rydquist, J. E. S. hort- Short- and long-term effects of combined pre- and postnatal ethanol exposure (three trimester equivalency) on the development of myelin and axons in rat optic nerve. Int J Dev Neurosci. 9, 631-647 (1991).
- Shetty, A. K., Burrows, R. C., Wall, K. A., Phillips, D. E. Combined pre- and postnatal ethanol exposure alters the development of Bergmann glia in rat cerebellum. Int J Dev Neurosci. 12, 641-649 (1994).
- Maier, S. E., Chen, W. J., Miller, J. A., West, J. R. Fetal alcohol exposure and temporal vulnerability regional differences in alcohol-induced microencephaly as a function of the timing of binge-like alcohol exposure during rat brain development. Alcohol Clin Exp Res. 21, 1418-1428 (1997).
- Maier, S. E., Miller, J. A., Blackwell, J. M., West, J. R. Fetal alcohol exposure and temporal vulnerability: regional differences in cell loss as a function of the timing of binge-like alcohol exposure during brain development. Alcohol Clin Exp Res. 23, 726-734 (1999).
- Livy, D. J., Miller, E. K., Maier, S. E., West, J. R. Fetal alcohol exposure and temporal vulnerability: effects of binge-like alcohol exposure on the developing rat hippocampus. Neurotoxicol Teratol. 25, 447-458 (2003).
- Kelly, S. J., Lawrence, C. R. Intragastric intubation of alcohol during the perinatal period. Methods Mol Biol. 447, 101-110 (2008).
- Perkins, A., Lehmann, C., Lawrence, R. C., Kelly, S. J. Alcohol exposure during development: Impact on the epigenome. Int J Dev Neurosci. 31, 391-397 (2013).
- Tran, T. D., Kelly, S. J. Alterations in hippocampal and hypothalamic monoaminergic neurotransmitter systems after alcohol exposure during all three trimester equivalents in adult rats. J Neural Transm. 106, 773-786 (1999).
- Gil-Mohapel, J., et al. Altered adult hippocampal neuronal maturation in a rat model of fetal alcohol syndrome. Brain Res. 1384, 29-41 (2011).
- Popovic, M., Caballero-Bleda, M., Guerri, C. Adult rat's offspring of alcoholic mothers are impaired on spatial learning and object recognition in the Can test. Behav Brain Res. 174, 101-111 (2006).
- Guerri, C., Sanchis, R. Alcohol and acetaldehyde in rat's milk following ethanol administration. Life Sci. 38, 1543-1556 (1986).
- Matta, S. G., Elberger, A. J. Combined exposure to nicotine and ethanol throughout full gestation results in enhanced acquisition of nicotine self-administration in young adult rat offspring. Psychopharmacology (Berl. 193, 199-213 (2007).
- Olney, J. W. Fetal alcohol syndrome at the cellular level). Addict Biol. 9, 137-149 (2004).
- Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Exp Biol Med (Maywood). 230, 366-375 (2005).
- Lewis, S. M., et al. Modifying a displacement pump for oral gavage dosing of solution and suspension preparations to adult and neonatal mice). Lab Anim (NY). 39, 149-154 (2010).
- Cebolla, A. M., et al. Effects of maternal alcohol consumption during breastfeeding on motor and cerebellar Purkinje cells behavior in mice. Neurosci Lett. 455, 4-7 (2009).
- Becker, H. C., Hale, R. L. Repeated episodes of ethanol withdrawal potentiate the severity of subsequent withdrawal seizures: an animal model of alcohol withdrawal "kindling". Alcohol Clin. Exp. Res. 17, 94-98 (1993).
- Galindo, R., Valenzuela, C. F. Immature hippocampal neuronal networks do not develop tolerance to the excitatory actions of ethanol. Alcohol. 40, 111-118 (2006).
- Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33, 7368-7383 (2013).
- Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Weathersby, R. T. Repeated ethanol withdrawal experience increases the severity and duration of subsequent withdrawal seizures in mice. Alcohol. 14, 319-326 (1997).
- Ukita, K., Fukui, Y., Shiota, K. Effects of prenatal alcohol exposure in mice: influence of an ADH inhibitor and a chronic inhalation study. Reprod Toxicol. 7, 273-281 (1993).
- Varma, P. K., Persaud, T. V. Influence of pyrazole, an inhibitor of alcohol dehydrogenase on the prenatal toxicity of ethanol in the rat. Res Commun Chem Pathol Pharmacol. 26, 65-73 (1979).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemp Top Lab Anim Sci. 43, 42-51 (2004).
- Arias, C., Molina, J. C., Mlewski, E. C., Pautassi, R. M., Spear, N. Acute sensitivity and acute tolerance to ethanol in preweanling rats with or without prenatal experience with the drug. Pharmacol Biochem Behav. 89, 608-622 (2008).
- Nizhnikov, M. E., Molina, J. C., Varlinskaya, E. I., Spear, N. E. Prenatal ethanol exposure increases ethanol reinforcement in neonatal rats. Alcohol Clin Exp Res. 30, 34-45 (2006).
