Summary
Nós demonstramos a construção de câmaras de vapor de álcool, utilizando materiais facilmente disponíveis que abrigam simultaneamente seis gaiolas de rato. Descrevemos ainda mais a sua utilização em um modelo do rato de exposição fetal ao álcool equivalente a todos os 3 trimestres de gestação humana. Este paradigma expõe animais durante a gestação e pós-natal dias 1-12.
Abstract
A exposição ao álcool durante o desenvolvimento pode resultar em uma constelação de anormalidades morfológicas e comportamentais que são conhecidos coletivamente como Transtornos do Espectro Fetal Álcool (FASDs). No final mais grave do espectro é a Síndrome Alcoólica Fetal (SAF), caracterizada por retardo de crescimento, dysmorphology craniofacial e déficits neurocomportamentais. Os estudos com modelos animais, incluindo os roedores, elucidaram muitos mecanismos celulares e moleculares envolvidas na patofisiologia da FASDs. Administração de etanol para roedores grávidas tem sido utilizado para modelar a exposição humana durante os primeiros e segundo trimestres da gravidez. Terceiro trimestre o consumo de etanol em humanos foi modelado usando roedores neonatais. No entanto, alguns estudos com roedores têm caracterizado o efeito da exposição ao etanol durante o equivalente a todos os três trimestres da gravidez humana, um padrão de exposição que é comum em mulheres grávidas. Aqui, vamos mostrar como construir câmaras de vapor a partir prontamente omateriais btainable que podem acomodar até seis gaiolas mouse padrão. Descrevemos um paradigma de câmara de vapor que pode ser utilizado para modelar a exposição ao etanol, com uma manipulação mínima, durante todos os três trimestres. Os nossos estudos demonstraram que vacas prenhes desenvolveu tolerância metabólica significativa de etanol. No entanto, os ratos neonatal não desenvolveram tolerância metabólica e do número de fetos, peso do feto, placenta peso, número de filhotes / ninhada, número de mortos filhotes / ninhada e peso das crias não foram significativamente afetadas pela exposição ao etanol. Uma vantagem importante deste paradigma é a sua aplicabilidade para estudos com ratinhos geneticamente modificados. Além disso, este paradigma minimiza o manuseio de animais, um grande confundir na pesquisa do alcoolismo fetal.
Introduction
Beber durante a gravidez pode prejudicar o feto, causando alterações persistentes em muitos órgãos e sistemas que diminuem significativamente a qualidade de vida para os indivíduos afetados e suas famílias. Estima-se que aproximadamente 10-30% das mulheres bebem durante a gravidez em os EUA, com 1-8% de beber em padrão binge 1,2. A gama de efeitos produzidos pela exposição ao etanol durante o desenvolvimento fetal é coletivamente conhecido como transtornos do espectro do álcool fetal (FASDs). Estimativas recentes indicam que FASDs são um importante problema de saúde pública, com uma prevalência tão alta quanto 2-5% em os EUA 3. O mais grave manifestação de FASDs é Síndrome Alcoólica Fetal (SAF), a qual é caracterizada por retardo de crescimento, anormalidades craniofaciais, e os déficits neurocomportamentais, incluindo dificuldades de aprendizagem. A prevalência da FAS foi estimada em 0,2-0,7% em os EUA 3. Os tratamentos atualmente disponíveis para FASDs são apenas parcialmente eficazese desenvolvimento de tratamentos mais eficazes é limitado pela má compreensão das bases celulares e moleculares do complexo espectro de transtornos.
Os dados dos defeitos congénitos Nacionais Prevention Study (NBDPS) indicam que as mulheres grávidas mais comumente beber durante o 1 º trimestre, antes de ter sido detectado a gravidez, seguido de abstinência durante as fases posteriores de gestação 2. O NBDPS também descobriram que o segundo padrão mais comum de consumo de etanol durante a gestação envolve beber em todos os trimestres da gravidez 2. As razões para isso incluem a falta de conhecimento sobre os efeitos potencialmente nocivos da exposição fetal etanol (mesmo em doses baixas), o acesso limitado a cuidados de pré-natal, história positiva para transtornos neuropsiquiátricos e abuso ou dependência de álcool 4. Curiosamente, o NBDPS relatado que o terceiro padrão mais comum de consumo envolvido abstinência durante a 1
Numa tentativa de modelar os diferentes padrões de consumo de etanol observados em mulheres grávidas, um número de paradigmas de exposição etanol desenvolvimento têm sido estabelecida utilizando diversas espécies de animais, com ratos e ratinhos, sendo 5,6 o mais comum. A duração da gestação nesses animais tipicamente lasst cerca de 3 semanas, o que corresponde à 1 ª e 2 ª trimestres de gravidez humana. Muitos estudos com roedores têm avaliado o impacto de várias doses e padrões de exposição ao etanol durante este período. Exemplos dos métodos frequentemente utilizados para administrar o etanol para ratinhos e ratos fêmeas grávidas incluem a administração através de dietas líquidas 7,8, adição de etanol para a água potável 9,10, a ingestão voluntária de soluções adoçadas com sacarina 11, sonda gástrica 12, a inalação do vapor 13 , e subcutânea ou intraperitoneal 14. Os resultados destes estudos foram recapitulado vários dos défices observados em humanos com FASDs, demonstrando que a exposição durante as fases iniciais da gravidez é suficiente para danificar os circuitos neuronais em todo o cérebro (revisão em 6,15).
As experiências com roedores também têm demonstrado que a exposição durante o equivalente a 3 ª 16-18, intubação intragástrica 19, a injecção subcutânea de 20, e a inalação do vapor 21,22. Estes estudos demonstraram de forma convincente que o crescimento do cérebro jorro é um período de elevada vulnerabilidade para os efeitos no desenvolvimento de etanol 6.
Como mencionado acima, beber durante todos os trimestres da gravidez é um padrão comum de consumo de etanol em mulheres 2. No entanto, comparativamente, poucos estudos avaliaram o impacto deste padrão de exposição utilizando modelos animais. Alguns destes estudos tomaram advantage de animais de grande porte, onde o 3 rd trimestre equivalente ocorre no útero, em vez de o período neonatal, como no caso de ratazanas e ratos. Estes modelos animais incluem primatas não humanos, ovelhas 23,24 25-27. No entanto, estes modelos animais, não têm sido amplamente utilizados em FASDs pesquisa, em parte, por causa do custo elevado e a necessidade de instalações de cuidados especializados. Roedores têm sido mais comumente usado para caracterizar o efeito da exposição ao etanol tudo trimestre sobre o desenvolvimento fetal 5. As cobaias foram particularmente vantajosa a este respeito dado o seu amplo desenvolvimento pré-natal e semelhanças na maturação do cérebro ao dos humanos 28,29. Com cobaias, foi possível caracterizar o efeito da exposição ao etanol, no útero, que inclui o período de desenvolvimento equivalente ao humano 3o trimestre. O custo relativamente alto destes animais, bem como a duração relativamente longa da gravidez(~ 67 dias), tem limitado o seu uso a poucos laboratórios que trabalham com FASDs pesquisa.
Devido ao seu uso custo-eficácia e ampla na pesquisa biomédica, os pesquisadores usaram ratos para modelar a exposição ao etanol durante todos os trimestres da gravidez. Em estudos iniciais, os ratos foram expostos durante a gravidez através de dietas líquidas, seguido por administração de etanol através de gastrotomia para criados artificialmente recém-nascidos (dia pós-natal (P) 1-10), resultando em níveis de etanol no sangue de pico (BEC) nas barragens de 0,08 g / dl e em que os filhotes de 0,16 g / dl. Este paradigma causou alterações duradouras na mielinização do nervo óptico e redução do número de fibras de glia Bergmann no cerebelo 30-32. Da mesma forma, Maier e colaboradores usando condições de criação artificiais administrados etanol para barragens de ratos grávidas de forma binge-como via intubação intragástrica seguido por administração neonatal durante parte do 3 º trimestre equivalente (P4-9) 33,34. PEAK BECs maternos e filhote foram de 0,3 g / dl, tanto gestacional dia 20 e P6. Este paradigma exposição todos trimestre resultou em atraso de crescimento, que foi significativamente maior do que a observada nos filhotes expostos durante períodos determinados de gestação 33. Além disso, os ratos expostos a etanol durante o equivalente para todos os trimestres exibiram uma redução no número de Purkinje do cerebelo e células de grânulos que era maior do que o observado em animais expostos durante outros períodos de 34. As reduções no número de células do hipocampo também foram relatados com esse paradigma, mas esses efeitos parecem ser principalmente uma conseqüência da exposição durante o 3 º trimestre equivalente 35. Um método que envolve a administração de etanol via intragástrica gavagem para ambas as ratas grávidas e ratinhos neonatais também tem sido usado para modelar toda a exposição trimestre 36. Este método, o qual originou CEBs de 0,13 g / dl nas barragens (dia 17 de gestação) e 0,24 g / dl em crias de P6, lon induzidaalterações duração g nos níveis de neurotransmissores monoamina no hipocampo e no hipotálamo, e aumento da expressão de DNA metiltransferases e metil CpG proteína 2 de ligação no hipocampo 37,38. Usando um paradigma de exposição semelhantes (BEC = 0,14-0,2 g / dl em barragens e 0,2 g / dl em crias), Gil-Mohapel et al. 39 detectado um aumento no número de novos neurónios imaturos no giro dentado de ratos adultos que pode representar um mecanismo compensatório a lesão neuronal induzida por etanol ou uma alteração na maturação dos neurónios adultos nascidos. Os investigadores também têm tentado modelar toda a exposição ao etanol trimestre expondo barragens via dietas líquidas ou água potável durante a gravidez e lactação 9,40. No entanto, a utilidade de expor os filhotes através do leite da mãe é limitado porque normalmente resulta em baixos BECs filhote (por exemplo, ,002-,05 g / dl; 41,42).
Os ratinhos foram também utilizados extensvamente para caracterizar os efeitos da exposição ao etanol de desenvolvimento. Este modelo animal compartilha muitos dos pontos fortes descritos acima para o modelo animal de ratos, com a vantagem adicional de que muitas linhagens de camundongos geneticamente modificados estão disponíveis 5. Ratos têm sido usados com sucesso para caracterizar os efeitos do etanol durante o 1 º, 2 º ou 3 º trimestres de gestação 43,44. No entanto, o impacto de qualquer exposição trimestre nestes animais não foi bem caracterizado por ser tecnicamente mais difícil para expor os ratos durante o equivalente a todos os trimestres da gravidez humana. Por exemplo, a criação e artificial por sonda gástrica, que têm sido utilizados com sucesso em ratos, requerem procedimentos mais especializados em ratos 45. Ao melhor de nosso conhecimento, apenas um estudo até à data tem tentado estudar o efeito de qualquer exposição etanol trimestre utilizando camundongos; esses animais foram expostos a solução de etanol em água potável during gravidez e lactação 46. BECs maternas foram 0,07 g / dl e filhote BECs não foram determinadas, mas espera que seja uma fração daqueles em barragens.
Aqui, descrevemos um novo modelo de exposição ao etanol tudo trimestre de ratos onde o álcool é administrada aos dois barragens grávidas e recém-nascidos através de câmaras de inalação de vapor. Câmaras de vapor foram construídos com base em um projeto anterior 47. Nós fornecemos instruções detalhadas sobre como construir as câmaras de inalação e executar os procedimentos de exposição. Nós também fornecemos informações sobre as CEBs que podem ser alcançados e do impacto da exposição na sobrevivência das crias e crescimento.
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Protocol
Todos os procedimentos com animais foram aprovados pela Universidade do Novo México de Ciências da Saúde-Centro Animal Care Institucional e Comitê de uso.
1. Montagem de câmara de vapor
- Corte as folhas de policarbonato com uma serra circular ou quebra-cabeças para as dimensões fornecidas no vídeo para a parte superior, inferior, frontal, traseira, laterais e porta (Figura 1 e Tabela 1).
- Com uma serra circular ou de serra de vaivém, cortada uma abertura de 8 polegadas de altura por 16 cm de largura no centro do painel da frente.
- Meça e marque os furos para a dobradiça do piano para o de 18 polegadas por 10 polegadas folha de policarbonato que se tornará a porta da câmara.
- Na porta, perfurar buracos balcão de pia com um pouco 5/16 broca polegadas, e com um pouco de 3/16 polegadas broca, fazer o furo para os parafusos. Certifique-se para perfurar buracos balcão de pia no interior da porta para as cabeças dos parafusos.
- Prepare as chapas de policarbonato para a soldagem.
- Montar front, painéis traseiros e laterais para o painel de fundo usando Weld-on # 16.
- Vede todas as aberturas entre os painéis com Weld-on # 16.
- Prenda o painel superior com Weld-on # 16.
- Use grampos de barras ou livros pesados para manter tudo no lugar, enquanto as soldas curar.
- Anexar um 1 polegada por uma peça de policarbonato de 12 polegadas para o painel frontal 1 polegada abaixo da abertura para a fixação da dobradiça da porta.
- Deixe pelo menos 24 horas para Weld-on para a cura.
- Corte 2 pedaços de tubulação PEX de 12 centímetros de comprimento e 1 pedaço de 1 polegada tubulação PEX longo.
- Com um pouco de 5/16 perfuração, perfuração de um buraco em cada um dos tubos PEX 12 polegadas a cerca de 1 a 2 polegadas de uma extremidade.
- Anexar 2 x 12 polegadas tubo PEX a um conector em T 3/8 de polegada, com os orifícios localizados fora do conector.
- Tapar as extremidades abertas dos tubos PEX com 3/8 de polegada tampões.
- Fixe a dobradiça de piano para o painel frontal e porta usando 4-40 parafusos e porcas.
- Usando a porta como um guia, mark os furos necessários para a dobradiça de piano sobre o espaçador 1 polegada no painel frontal da câmara.
- Com um pouco de 3/16 polegadas broca, faça os furos no painel frontal para a dobradiça piano.
- Fixe a porta e dobradiça de piano ao painel frontal usando 4-40 parafusos e porcas.
- Montar os grampos articulados, como mostrado no vídeo com uma anilha e uma porca em cada lado do braço lateral.
- Mark e broca de 3/16 polegada buracos para a alternância grampos no painel frontal e anexar alternância braçadeiras com 4-40 parafusos e porcas.
- Adiciona-se 3/8 de polegada selos bulbo de borracha para o interior da porta.
- Com uma perfuração da broca de 5/8 de polegada, fazer um furo no centro do painel de topo para o orifício de entrada.
- Faça um furo de 1/2 polegada de fundo / centro do painel de volta para a porta de saída.
- Montar a porta de saída, empurrando a parte com rosca de 3/8 de polegada na parede por meio de adaptadores, através da parede de trás da câmara de vapor, no furo de passagem de saída. Prenda a porca dainterior da câmara para manter no lugar.
- Retire a cobertura protetora de chapas de policarbonato.
- Anexar o pedaço de tubo PEX 1 polegada para o conector em T e forçar o tubo PEX, através do orifício na parte superior da câmara a partir do interior.
- Encaixe de 3/8 de polegada de cotovelo 90 para o topo do tubo PEX uma polegada a partir do exterior.
NOTA: Faça um furo de 1/2 polegada na porta e inserir um septos selo 1/2 polegada para o buraco. - Repita os passos 1-22 para o ar apenas controlar câmara.
2. Rack e Assembléia Air Entrega
- Se colocar as câmaras no carrinho / cremalheira mencionado na lista de materiais, montar o carrinho de acordo com as instruções do fabricante.
- Com nozes peças e parafusos, coloque um pedaço de policarbonato para o rack para manter os reguladores de fluxo de ar.
- Em qualquer lugar do pedaço de policarbonato, marca e broca de 3/4 polegada buracos para os reguladores de fluxo de ar e anexar os reguladores com as porcasfornecida.
- Encaixe de 3/8 polegadas através da parede do adaptador para as portas de entrada e de saída dos reguladores de fluxo de ar.
- Monte o frasco de etanol com a pedra de aeração, # 8 rolha e liberação rápida na linha de conectores.
- Usando 3/8 de polegada tubagem TYGON, ligar os reguladores de fluxo para a bomba de ar e um balão de etanol, como mostrado na Figura 1.
- Para o ar de câmara única, prender a porta de saída do regulador de fluxo de ar para a entrada de 3/8 de polegada de cotovelo 90 com um tubo TYGON 3/8 de polegada, conforme mostrado na Figura 1.
Representação Figura 1. Esquemática da configuração das câmaras de vapor. Um conector em T é ligado a uma bomba de ar de baixo ruído. Um dos lados do conector T está diretamente ligado a um regulador de fluxo de ar para a única câmara de vapor do ar. Os outros side é dividida outra vez e ligado a dois reguladores de fluxo de ar diferentes, uma para o ar e uma para o etanol. A câmara de ar está diretamente ligado ao regulador, como mostrado. Para a câmara de vapor de etanol, um regulador de fluxo de ar está ligado à pedra arejador imerso em etanol líquido no frasco de filtração. A porta de braço lateral do balão do filtro está ligado com a saída do regulador de ar, tal como indicado. O vapor de etanol fundiu e o ar é então ligado à entrada da câmara de vapor de etanol. Os tubos de saída (não mostrados) estão ligados a uma saída de ventilação na sala.
3. Teste Vapor Chambers e ajuste os níveis de etanol
- Adicionar 600 ml de etanol prova 190 para o balão de filtração, inserir a pedra de arejamento, e ligar a entrada do tubo para o braço lateral do balão.
- Feche as portas da câmara e ligue a bomba de ar.
- Ajustar os reguladores de fluxo de ar de modo a que cerca de metade da quantidade de ar que flui através do álcool líquido, o ar é misturado com. Ajustt o ar apenas o fluxo de ar para o escoamento combinado de álcool e ar da câmara de etanol.
- Permitir que as câmaras a equilibrar durante pelo menos 30 min antes de se medir a concentração de etanol do ar.
- Medir a concentração de etanol do ar por meio da extração de 5 ml de ar com uma agulha de 18G e uma seringa de 60 ml através do septo. Diluir essa amostra com ar ambiente puxando o êmbolo de volta para 60 ml (01:12 diluição). Medir o nível de álcool do ar usando um bafômetro, de acordo com as instruções do fabricante. A diluição do ar da câmara é necessário para alcançar o nível de vapor de álcool dentro da faixa de detecção do bafômetro.
NOTA: Se utilizando diferentes níveis de exposição do álcool a diluição pode ter de ser ajustada. - Como ponto de partida, ajuste os reguladores de fluxo de ar conforme necessário para atingir uma concentração de álcool no ar de aproximadamente 4,5-5 g / dl (g de álcool vaporizado por dl de ar).
4. Criação de Animais
- Fêmeas casa grupo C578BL / 6 ratinhos (2-3 meses de idade) durante pelo menos uma semana para sincronizar os ciclos ovarianos.
- Individualmente abrigar machos C57BL / 6 (2-5 meses de idade) por pelo menos 2 semanas.
- Após a sincronização, coloque uma única fêmea com um único macho para 5 dias para permitir o acasalamento.
- Após o acasalamento, os machos e remover individualmente fêmeas casa e colocá-los em câmaras.
5. Pré e pós-natal Etanol Vapor exposição
- Expor vacas prenhes ao vapor de etanol, durante 4 horas por dia começando às 10 horas, durante o ciclo de luz (luzes acesas a partir de seis horas - seis horas), exceto o dia do nascimento para evitar a morte filhote.
- Pesar barragens no dia gestacional (G) 5, G13-G14, G18 e G20-para monitorar a gravidez; cama foi alterado nos dias em que as fêmeas foram pesadas para minimizar o manuseio.
- Cada dia substituir o alimento para os grupos de etanol expostos para evitar o consumo de peletes com qualquer etanol absorvido nelas.
- No dia danascimento não expor os animais. Após o nascimento expor as barragens e os filhotes de 4 horas por dia começando às 10 horas a partir de P1-P12.
- Pesar os filhotes no P2, P8, P12, P25 e; e mudar de cama em P8 e P12 para minimizar a manipulação adicional.
- Imediatamente após a última exposição (P12), transfira as gaiolas a um animal sala habitação standard.
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Representative Results
Figura 2A mostra que ambos os ratos grávidas e filhos neonatal foram expostos a concentrações de vapor de etanol relativamente estáveis nas câmaras. Estas variaram entre 4-6 g / dl. Figura 2B mostra as CEBs obtidos nas ratas grávidas como uma função do tempo. CEBs foram medidos usando uma enzima álcool desidrogenase padrão baseado ensaio 48. No G5, BEC rapidamente aumentou para ~ 60 mM de 2 horas após o início da exposição e atingiu um pico no final do período de exposição de 4 horas. BECs diminuiu gradualmente para ~ 12 mM após 4 horas adicionais após o final da exposição. Por G13-14, houve uma diminuição dramática em CEBs para aproximadamente 60% dos níveis detectados no G5. Além disso, os níveis de CEBs subiu mais lentamente e diminuíram mais rapidamente, resultando numa menor presença de etanol no sangue dos ratos gestantes. No curto prazo (G18-20), BEC foram adicionalmente reduzido para cerca de 30% dos níveis detectados no G5. Estes resultados são consistentes com o desenvolviment de rápida tolerância metabólica para etanol nos ratos grávidas. Figura 2C mostra que prole neonatal foram expostos a BECs perto de 30 mM. CEBs aumentou gradualmente nestes animais, atingindo um pico no final do período de exposição de 4 horas e diminuindo gradualmente para níveis de linha de base 8 horas após o fim do paradigma de exposição 4 h. Em contraste com as vacas prenhes, não houve diferença entre CEBs medidos em recém-nascidos que foram expostos precoce (P2) vs tardia (P7-P12) no período neonatal. Estes resultados indicam que os ratos recém-nascidos não se desenvolveu tolerância metabólica de etanol.
Figura 2. Caracterização dos níveis de etanol. A) Os níveis de câmara de vapor de etanol manteve-se relativamente constante ao longo das fases de gestação e pós-natal da paradigmática exposiçãom. Para medir esses níveis, o ar da câmara foi retirada com uma seringa através da rolha de borracha, diluídos com ar ambiente, e expulso na porta de entrada de um bafômetro (veja o vídeo para mais detalhes). Os valores foram obtidos a partir de 5 e 4 rodadas de exposição diferentes para as fases de gestação e pós-natal, respectivamente. B) os níveis de etanol sangue medidos em diferentes pontos do tempo para os dias de gestação indicados estimadas em fêmeas gestantes (n = 5-7 barragens). O limite legal intoxicação (17,4 mM ou 0,08 g / dl) é indicado pela linha a tracejado. A barra cinza indica o tempo das barragens foram expostos ao etanol. C) O mesmo que em B, mas para os ratos neonatal (n = 5-9 filhotes de ninhadas diferentes).
A Figura 3 mostra que o paradigma de exposição não afectou significativamente o ganho de peso em barragens ou as crias. Tabela 2 mostra que a exposição de etanol não afectou significativamente o número de Fetu viávelses, número de fetos reabsorvidos, o peso do feto, placenta e peso (medido a curto prazo). Tabela 2 mostra também que o número de filhotes por ninhada e da mortalidade das crias não foram significativamente afetadas pela exposição ao etanol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Falta de um efeito da exposição ao etanol em barragens e filhote pesos. A) o ganho de peso da represa em função do dia de gestação estimada (n = 8-12). O peso estimado no dia de gestação 5 corresponde ao peso medido no primeiro dia de exposição B) o ganho de peso Pup. Como uma função da idade (n = 7-9). Para ambos os painéis, as barras de erro são mais pequenos do que os símbolos. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51839/51839fig3highres.jpg" target = "_blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Dimensões (polegadas) | Altura | Largura |
| Topo | 32 | 22 |
| Inferior | 32 | 22 |
| Frente | 32 | 14 |
| De volta | 32 | 14 |
| Lado 1 | 21,5 | 14 |
| Lado 2 | 21,5 | 14 |
| Porta | 18 | 10 |
Tabela 1. Dimensões de chapas de policarbonato.
| Ar | EtOH | |
| 7,50 ± 1,08, n = 6 | 7,33 ± 1,52, n = 6 | |
| Média Fetus Peso (g): ~ E18 | 1,04 ± 0,09, n = 6 | 0,82 ± 0,09, n = 6 |
| Média Placenta Peso (g): ~ E18 | 0,12 ± 0,003, n = 6 | 0,14 ± 0,01, n = 6 |
| Número de fetos reabsorvido: ~ E18 | 0,50 ± 0,34, n = 6 | 0,50 ± 0,50, n = 6 |
| Número de filhotes / ninhada | 7,11 ± 0,67, n = 9 | 6,89 ± 0,42, n = 9 |
| Número de mortos filhotes / ninhada | 0,11 ± 0,11, n = 9 | 0,66 ± 0,24, n = 9 |
Tabela 2. Pré-e caracterização pós-natal do rato paradigma exposição vapor.
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Discussion
Aqui, descrevemos em detalhes os métodos para a construção de câmaras de inalação de vapor. Os materiais e as ferramentas necessárias para a construção das câmaras estão prontamente disponíveis a partir de uma série de fornecedores comerciais e os passos para a construção das câmaras são relativamente simples. O sistema que nós descrevemos aqui não contém válvulas de retenção em linha para evitar o refluxo e mixagem. Não fomos capazes de medir qualquer etanol detectáveis no ar apenas câmaras sugerindo que não temos qualquer mistura ou refluxo de etanol no ar apenas câmaras. O ar apenas as câmaras devem ser verificados para o vapor de etanol periodicamente (deve notar-se que a câmara de ar deve ser sempre testada antes da câmara de etanol para evitar a detecção de vapor de etanol residual presente no bafômetro e / ou seringa). Idealmente, as câmaras devem ser colocadas em salas dedicadas na unidade de cuidados com os animais em que as gaiolas de rato pode ser continuamente alojados durante a duração do eparadigma xposure, eliminando a necessidade de transportar os ratos, reduzindo desse modo o esforço. Um quarto standard com uma saída de ventilação é tudo o que é necessário para este paradigma. No entanto, se o quarto é compartilhada com outros investigadores, que pode ser necessário para colocar as câmaras numa sala com cubículos separados para minimizar a exposição de outros animais para o odor de etanol. Cada câmara pode acomodar até 6 gaiolas mouse padrão, tornando-se um método menos trabalhoso de exposição do que, por exemplo, por sonda intragástrica.
O paradigma de exposição pode ser facilmente modificada de acordo com a exigência de uma experiência específica. Os animais podem ser expostos a etanol durante o equivalente para todos os trimestres da gravidez humana. Deve notar-se que o roedor equivalente de desenvolvimento para o desenvolvimento humano pode variar dependendo de qual região do cérebro e é considerado o processo de desenvolvimento se está interessado em (neurogénese, a integração sináptica, etc.) No presente estudo, nós definimos o terceiro trimester equivalente como o período de surto de crescimento cerebral. Os pesquisadores são incentivados a consultar o website tempo 49 traduzir. Com base nos resultados apresentados na Figura 2B, recomendamos que exposição ser iniciada a um nível inferior de vapor de etanol (por exemplo, ~ 3 g / dl) e gradualmente aumentada para compensar o desenvolvimento de tolerância metabólica. Durante a aplicação do procedimento, os investigadores devem acompanhar de perto BECs em diferentes dias de gestação para determinar se isso resulta em níveis mais estáveis nas vacas prenhes. Um inibidor de desidrogenase de álcool foi usado para prevenir o desenvolvimento de tolerância em ratos expostos a etanol em câmaras de vapor 50. No entanto, não é recomendado que este agente ser usada em camundongos grávidas porque os estudos sugerem que ele tem efeitos potencialmente teratogênicos que poderiam complicar a interpretação dos resultados 51,52. Além disso, injeções de qualquer forma irá causar estresse adicional para a barragem de gravidez,potencialmente confundir o experimento 53.
Em contraste com fêmeas prenhes, a exposição da câmara de vapor durante o período neonatal, não resultou no desenvolvimento de tolerância metabólica. BEC não foram diferentes entre P2 e P7-12 camundongos. CEBs de pico foram semelhantes aos observados nos barragens em G13-14 e ligeiramente maior do que os detectados em G18-20. No entanto, BECs levou mais tempo para retornar à linha de base nos filhotes. Ele continua a ser determinado se a exposição ao etanol em câmaras de vapor durante o período gestacional altera a capacidade da prole neonatal para metabolizar o etanol. No entanto, com base na literatura, que seria de esperar para crias que foram expostas durante a gestação em etanol para expor uma ou diminuiu ligeiramente a capacidade de metabolizar inalterada etanol 54,55. Em nossos estudos, não foi observada uma diferença no peso médio filhote, e nossos dados mostram que até o final da gestação, as CEBs maternos mal subir acima da intoxicação legal para não more do que 2 horas. Estes dados sugerem que as mães não são afetados significativamente a partir da exposição ao álcool durante o período pós-natal. No entanto, isso deve ser mais explorada, especialmente se os animais estão expostos a níveis mais altos de etanol.
Este paradigma exposição tem algumas limitações. Camundongos fêmeas não foram expostos durante os primeiros cinco dias de gestação, porque eles são criados com os machos durante este período. Um intervalo curto de reprodução pode ser tentada (por exemplo, 2-3 dias), mas isto pode conduzir a uma redução do número de fêmeas que ficam grávidas. Alternativamente, os animais podem ser criados para um tempo mais curto e as fêmeas marcada para plugs cópula. Outra limitação é que todos os ratinhos num dado câmara só pode ser exposto a uma única concentração de vapor de etanol. Além disso, alguns aspectos do vapor de etanol paradigma de exposição da câmara é fatigante, tais como o facto de que os reservatórios são alojados individualmente durante a maior parte da gestação e são expostosa forte odor de etanol. É também possível que a exposição ao vapor de etanol provoca algumas alterações no sistema respiratório de barragens e / ou crias. Além disso, a exposição a ratos recém-nascidos não é um modelo perfeito de exposição humana durante o terceiro trimestre (por exemplo, a unidade placentário-fetal não está presente neste modelo). No entanto, argumenta-se que as vantagens deste paradigma superam suas fraquezas, e que ele pode ser um modelo útil para caracterizar os mecanismos envolvidos na fisiopatologia da FASDs.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Apoiado por Institutos Nacionais de Saúde concede R01-AA015614, R01-AA014973, AA014127 e T32-K12-GM088021. Os autores agradecem a Samantha L. Blomquist para a assistência técnica e as Dras. Kevin Caldwell e Donald Partridge para avaliar criticamente o manuscrito e vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycarbonate 1/4" clear 48" x 24" | McMaster-Carr | 8574K23 | 10 |
| Foam Rubber bulb seal 3/8"w x 7/32"h | McMaster-Carr | 93085K67 | 10 ft |
| Weld-on #16 | McMaster-Carr | 7515A11 | 3 |
| Piano hinge 12" long | McMaster-Carr | 1658A11 | 2 x 1 ft |
| Hold-down toggle clamps standard | McMaster-Carr | 5126A26 | 8 |
| PEX tubing 1/2" | McMaster-Carr | 51275K88 | 10 ft |
| Barbed Tee tube fitting (Black) Pkg 10 | McMaster-Carr | 5463K608 | 1 |
| Barbed plug fitting (Black) Pkg 10 | McMaster-Carr | 5462K79 | 1 |
| Barbed Elbow tube fitting (Black) Pkg 10 | McMaster-Carr | 5463K596 | 1 |
| 3/8" Through-Wall Adapters, Tube to Threaded Pipe | McMaster-Carr | 5463K851 | 1 |
| Phillips Machine screw 4-40 | McMaster-Carr | 91772A112 | 1 |
| Machine screw hex nut 4-40 | McMaster-Carr | 90480A005 | 1 |
| Panel-mount flowmeter 2-20 | McMaster-Carr | 41945K76 | 3 |
| FLASK, FILTER 1,000 ml 6/PACK | VWR | 89001-800 | 2 |
| Precision Seal Septa | VWR | 89084-490 | 1 |
| VWR Black Rubber Stopper #8 1-hole | VWR | 59581-367 | 1 |
| TUBE TYGON R3603 3/8X9/16 50' | VWR | 89068-556 | 1 |
| TUBE TYGON R3603 1/4X11/16 50' | VWR | 89068-502 | 1 |
| Aerator Stone P2120 | VWR | 32573-007 | 1 |
| 3/8" T-connectors Pk of 20 | VWR | 46600-060 | 1 |
| VWR Disconnectors tapered Pk of 10 | VWR | 46600-110 | 1 |
| 3/8 Hose Barb valved in-line coupling | Colder Products Company | HFCD17612 | 1 |
| Air pump medium capacity | LMI Manufacturers | DB60L | 1 |
| Nexelate Wire Shelving 36"W X 24"D X 63"H | Global industrial | T9A990135 | 1 |
| Stem Casters Set of (4) 5" Polyurethane Wheel | Global industrial | T9A500591 | 1 |
References
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