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Medicine

Bau von Dampfkammern verwendet, um Mäuse zu Alkohol Expose Während der Equivalent aller drei Trimester der Human Development

Published: July 13, 2014 doi: 10.3791/51839
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Neurosciences, School of Medicine, University of New Mexico Health Sciences Center

Summary

Wir zeigen den Aufbau der Alkoholdampf Kammern mit leicht verfügbaren Materialien, die gleichzeitig beherbergen 6 Mäusekäfige. Wir beschreiben weiter ihre Verwendung in einem Mausmodell der fetalen Alkohol-Exposition entspricht allen 3 Trimester der Schwangerschaft beim Menschen. Dieses Paradigma macht Tieren während der Trächtigkeit und postnatalen Tag 1-12.

Abstract

Alkoholexposition in der Entwicklung kann in einer Konstellation von morphologischen und Verhaltensauffälligkeiten, die kollektiv als Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASDs) bekannt sind, führen. Am schwersten Ende des Spektrums ist Fetale Alkoholsyndrom (FAS), gekennzeichnet durch Wachstumsverzögerung, kraniofaziale Dysmorphien und Neuropsychologische Defizite. Studien mit Tiermodellen, einschließlich Nagetiere, haben viele molekularen und zellulären Mechanismen in der Pathophysiologie beteiligt FASDs erläutert. Ethanol Verwaltung, schwanger zu Nagetieren wurde verwendet, um die Exposition des Menschen während der ersten und zweiten Trimester der Schwangerschaft zu modellieren. Dritten Trimester Ethanolkonsum bei Menschen wurde mit neonatalen Nagern modelliert. Allerdings haben einige Studien an Nagetieren die Wirkung der Ethanolexposition während der äquivalent zu allen drei Trimester der Schwangerschaft beim Menschen, ein Muster der Exposition, die häufig bei schwangeren Frauen aus. Hier zeigen wir, wie man Dampfkammern aus leicht zu bauen obtainable Materialien, die jeweils Platz für bis zu sechs Standard-Maus-Käfigen. Wir beschreiben eine Dampfkammer Paradigma, das verwendet werden kann, um Muster der Exposition gegenüber Ethanol bei minimaler Handhabung während aller drei Trimester. Unsere Studien zeigen, dass schwangere Dämme entwickelt signifikante metabolische Toleranz zu Ethanol. Allerdings hat neugeborenen Mäusen nicht entwickeln metabolischen Toleranz und die Anzahl der Föten, Gewicht Fötus, der Plazenta Gewicht, Anzahl der Jungtiere / Wurf, die Anzahl der toten Welpen / Wurf Welpen und Gewicht wurden durch Ethanolexposition nicht signifikant beeinflusst. Ein wichtiger Vorteil dieses Paradigma ist die Anwendbarkeit auf Studien mit genetisch modifizierten Mäusen. Zusätzlich minimiert dieses Paradigma Umgang mit den Tieren, eine große verwechseln in fetalen Alkohol-Forschung.

Introduction

Trinken während der Schwangerschaft kann den Fötus schädigen, was zu anhaltenden Veränderungen in vielen Organen und Systemen, die die Lebensqualität für die betroffenen Menschen und ihre Familien deutlich verringern. Es wird geschätzt, dass ca. 10-30% der Frauen trinken während der Schwangerschaft in den USA, mit 1-8% in einer Binge drinking Muster 1,2. Die Palette der Wirkungen von Ethanolexposition während der fetalen Entwicklung hergestellt wird kollektiv als fetale Alkohol-Spektrum-Störungen (FASDs) bekannt. Aktuelle Schätzungen zeigen, dass FASDs sind ein großes Gesundheitsproblem mit einer Prävalenz so hoch wie 2-5% in den USA drei. Je schwerer Manifestation FASDs ist Fetale Alkoholsyndrom (FAS), die durch Wachstumsverzögerung, kraniofaziale Anomalien, neurologisch und Defizite, einschließlich Lernschwierigkeiten gekennzeichnet ist. Die Prävalenz von FAS wurde geschätzt, 0,2-0,7% in der US 3 sein. Die derzeit verfügbaren Behandlungen für FASDs sind nur teilweise wirksamund Entwicklung von effektiveren Behandlungen wird durch die schlechte Verständnis der zellulären und molekularen Grundlagen dieses komplexen Spektrum von Erkrankungen beschränkt.

Daten aus dem National Birth Defects Prevention Study (NBDPS) zeigen, dass schwangere Frauen am häufigsten während des 1. Trimesters trinken, vor der Schwangerschaft festgestellt worden ist, gefolgt von der Abstinenz während der späteren Stadien der Schwangerschaft 2. Die NBDPS auch festgestellt, dass die zweithäufigste Muster von Ethanolkonsum während der Schwangerschaft trinken geht durch alle Trimester der Schwangerschaft 2. Die Gründe dafür sind mangelnde Bewusstsein über die potenziell schädlichen Auswirkungen von Ethanol fetalen Exposition (selbst bei niedriger Dosierung), begrenzter Zugang zu Schwangerschaftsvorsorge, positive Geschichte für neuropsychiatrische Störungen und Missbrauch oder Abhängigkeit von Ethanol 4. Interessanterweise berichtete die NBDPS, dass die dritthäufigste Konsummuster beteiligt Abstinenz während der 1 2. Trimester während des 3. Trimesters, wenn es oft angenommen wird, dass das Trinken ist sicher, weil Organogenese wurde größtenteils abgeschlossen, gefolgt von Verbrauch. Allerdings ist das 3. Trimester eine Zeit der hohen Anfälligkeit für Ethanol-induzierten Schäden des Nervensystems, denn dies ist eine Zeit, in neuronalen Schaltkreisen zu unterziehen tiefe Verfeinerung 2. Die NBDPS identifiziert andere, weniger häufige Muster des Alkoholkonsums während der Schwangerschaft auftreten, einschließlich Verbrauch während der 1. und 2. Trimester, gefolgt von Enthaltsamkeit während des 3. Trimenon 2.

In einem Versuch, die verschiedene Muster von Ethanolkonsum bei schwangeren Frauen beobachtet Modell, eine Anzahl von Entwicklungsethanolexposition Paradigmen wurden mit verschiedenen Tierarten festgelegt, an Ratten und Mäusen am üblichsten 5,6. Die Dauer der Schwangerschaft bei diesen Tieren in der Regel lasts ca. 3 Wochen, die an der 1. und 2. Trimester der Schwangerschaft beim Menschen entspricht. Viele Nager Studien haben die Auswirkungen der verschiedenen Dosen und Muster der Ethanolexposition während dieser Zeit bewertet. Beispiele für die Verfahren und Ratten häufig verwendet, um Ethanol zu verwalten schwangeren Mäusen die Verabreichung über flüssige Ernährung 7,8, Zugabe von Ethanol zum Trinkwasser 9,10, freiwillige Trink von Saccharin gesüßt Lösungen 11, 12 Magensonde, Dampf Inhalation 13 und subkutane oder intraperitoneale Injektion 14. Die Ergebnisse dieser Studien haben mehrere der in den Menschen mit FASDs beobachteten Defizite rekapituliert, was zeigt, dass die Exposition während der frühen Stadien der Schwangerschaft ist ausreichend, um über neuronale Schaltkreise des Gehirns (in 6,15 bewertet) beschädigen.

Versuche mit Nagetieren haben auch gezeigt, daß während der Belichtung entspricht der 3. 16-18, intragastrischen Intubation 19, 20 subkutane Injektion, Inhalation und Dampf 21,22 verabreicht. Diese Studien haben überzeugend gezeigt, dass das Gehirn Wachstumsschub ist eine Zeit der hohen Anfälligkeit für die Auswirkungen auf die Entwicklung von Ethanol 6.

Wie oben erwähnt, trinken während aller Trimester der Schwangerschaft ist ein häufiges Muster von Ethanolkonsum bei Frauen zwei. Allerdings haben vergleichsweise wenige Studien die Auswirkungen dieser Expositionsmuster anhand von Tiermodellen untersucht. Einige dieser Studien haben advantag genommene von großen Tieren, wo das 3. Trimester-Äquivalent tritt in utero nicht der neonatalen Periode wie in dem Fall von Ratten und Mäusen. Diese Tiermodelle sind nicht-menschlichen Primaten 23,24 und Schafe 25-27. Allerdings sind diese Tiermodellen nicht weit verbreitet in FASDs Forschung, teilweise wegen der hohen Kosten und die Notwendigkeit für spezialisierte Einrichtungen. Nagetiere wurden häufiger verwendet, um die Wirkung von all-Trimester Ethanolexposition auf die fetale Entwicklung 5 charakterisieren. Meerschweinchen haben in dieser Hinsicht aufgrund ihrer umfassenden pränatalen Entwicklung und Gemeinsamkeiten in der Hirnreifung dem des Menschen besonders vorteilhaft 28,29 gewesen. Mit Meerschweinchen, war es möglich, die Wirkung von Ethanol Exposition in utero, die das Äquivalent Entwicklungszeit des menschlichen 3. Trimester umfasst charakterisieren. Die vergleichsweise hohen Kosten dieser Tiere sowie die relativ lange Dauer der Schwangerschaft(~ 67 Tage), ihre Verwendung zu einigen Laboratorien, die auf FASDs Forschung beschränkt.

Wegen ihrer Wirtschaftlichkeit und den breiten Einsatz in der biomedizinischen Forschung, haben Forscher Ratten verwendet, um die Exposition zu Ethanol in allen Trimester der Schwangerschaft zu modellieren. In ersten Studien wurden die Ratten während der Schwangerschaft über flüssige Ernährung gefolgt von der Verabreichung von Ethanol über Gastrostomie künstlich aufgezogen Neugeborenen (postnatalen Tag (P) 10.1), was zu Spitzenblutethanolkonzentrationen (BEC) in den Staudämmen von 0,08 g / dl ausgesetzt und in der Welpen 0,16 g / dl. Dieses Paradigma verursacht dauerhafte Veränderungen im Sehnerv Myelinisierung und die Zahl der Bergmann Gliazellen Fasern im Kleinhirn 30-32 reduziert. Ebenso Maier und Mitarbeiter mit künstlichen Haltungsbedingungen über intragastrischen Intubation, gefolgt von Neugeborenen-Verwaltung während eines Teils des 3. Trimesters Äquivalent (P4-9) 33,34 verabreicht Ethanol, schwanger zu Ratten-Muttertiere in einer Binge artig. PEAK Mutter und Welpen BECs waren 0,3 g / dl bei beiden Schwangerschafts Tag 20 und P6. Das All-Trimester Exposition Paradigma führte zu Wachstumsverzögerungen, die deutlich größer ist als bei Jungtieren während ausgewählter Perioden der Schwangerschaft ausgesetzt 33 beobachtet wurde. Zusätzlich Ratten zu Ethanol während des gleichen für alle Trimester ausgesetzt zeigte eine Reduktion in der Anzahl der Purkinje und Granulatzellen, die größer ist als die bei Tieren während anderer Perioden 34 ausgesetzt wurde beobachtet. Ermäßigungen in Hippocampus-Zellzahlen wurden auch mit diesem Paradigma berichtet, aber diese Effekte scheinen eine Folge der Exposition während des 3. Trimester-Äquivalent 35 in erster Linie sein. Eine Methode, die Ethanol-Verwaltung beinhaltet über intragastrischen Magensonde zu beiden trächtigen Ratten und neugeborenen Mäusen wurde auch verwendet, um alle Trimester Exposition 36 modellieren. Diese Methode, die BECs von 0,13 g / dl bei den Muttertieren (Schwangerschafts Tag 17) und 0,24 g / dl bei P6 Welpen, induziert lon ergabg anhaltende Veränderungen in der Monoamin-Neurotransmitter-Spiegel im Hippocampus und Hypothalamus, und erhöhten Expression der DNA-Methyltransferasen und Methyl-CpG-Bindungsprotein 2 im Hippocampus 37,38. Mit einer ähnlichen Exposition Paradigma (BEC = 0,14 bis 0,2 g / dl bei Dämmen und 0,2 g / dl bei Jungtieren), 39 wurde eine Zunahme der Zahl der neuen unreifen Nervenzellen im Gyrus dentatus von erwachsenen Ratten Gil-Mohapel et al., Dass kann ein Ausgleichsmechanismus, um Ethanol-induzierten neuronalen Schäden oder eine Änderung bei der Reifung von Erwachsenen geboren Neuronen darstellen. Die Ermittler haben auch versucht, alle Trimester Ethanolexposition zu modellieren, indem Dämme über flüssige Nahrung oder Wasser sowohl während der Schwangerschaft und Stillzeit 9,40 trinken. Allerdings ist der Nutzen der Freilegung der Welpen über die Muttermilch begrenzt, weil es typischerweise zu niedrig pup BECs (zB 0,002 bis 0,05 g / dl, 41,42).

Mäuse wurden auch verwendet extensively um die Wirkungen der Entwicklungsethanolexposition zu charakterisieren. Dieses Tiermodell teilt viele der oben für die Ratten-Tiermodell beschrieben, mit dem zusätzlichen Vorteil, die viele Stärken genetisch veränderte Mausstämme sind vorhanden 5. Mäuse wurden erfolgreich eingesetzt, um die Auswirkungen von Ethanol in der 1., 2. oder 3. Trimester der Schwangerschaft 43,44 charakterisieren. Doch die Auswirkungen der Exposition auf alle Trimester diesen Tieren nicht gut aus, da es technisch schwieriger zu Mäusen während der äquivalent zu allen Trimestern der Schwangerschaft aussetzen. Zum Beispiel künstliche Aufzucht und Magensonde, die in Ratten erfolgreich eingesetzt wurden, erfordern spezielle Verfahren bei Mäusen 45. Nach bestem Wissen unseren Erkenntnissen nur eine Studie hat bisher versucht, die Wirkung aller Trimester Ethanolexposition mit Mäusen zu studieren; Diese Tiere wurden zu Ethanol-Lösung im Trinkwasser ausgesetzt During Schwangerschaft und Stillzeit 46. Maternal BECs waren 0,07 g / dl und Welpen BECs wurden nicht bestimmt, aber erwartet, dass ein Bruchteil der in Dämmen sein.

Hier beschreiben wir ein neues Modell für alle Trimenon Ethanol Exposition von Mäusen, wo Alkohol an beide schwanger Dämme und Neugeborenen über Dampfinhalationskammern verabreicht. Dampfkammern wurden auf der Grundlage einer früheren Design-47 gebaut. Wir bieten detaillierte Anleitung, wie man die Inhalation Kammern zu bauen und führen Sie die Belichtungsverfahren. Wir bieten auch Informationen über die BECs, die erreicht werden können und die Auswirkungen der Exposition auf pup Überleben und Wachstum.

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Protocol

Alle Tier-Verfahren wurden von der Universität von New Mexico-Health Sciences Center Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

1. Vapor Chamber Versammlung

  1. Cut Polycarbonat-Platten mit einer Kreissäge oder Stichsäge auf die Abmessungen in dem Video für oben, unten, vorne, hinten, seitlich und Tür (Abbildung 1 und Tabelle 1).
  2. Mit einer Kreissäge oder Stichsäge, schneiden Sie eine Öffnung 8 cm hoch und 16 cm breit in der Mitte der Frontplatte.
  3. Messen und markieren Sie die Löcher für die Klavierband auf die 18-Zoll von 10-Zoll-Polycarbonatplatten, die die Tür der Kammer werden wird.
  4. In der Tür bohren Gegenwanne Löcher mit einem 5/16 Zoll-Bohrer, und mit einem 3/16 Zoll-Bohrer, bohren Sie das Loch für die Schrauben. Achten Sie darauf, Gegenkörper Löcher auf der Innenseite der Tür für die Schraubenköpfe zu bohren.
  5. Bereiten Sie die Polycarbonat-Platten für das Schweißen.
  6. Montieren hernt, Rücken und Seitenteile auf der Bodenplatte mit Weld-on # 16.
  7. Verschließen Sie alle Lücken zwischen den Platten mit Weld-on # 16.
  8. Bringen Sie die obere Panel mit Weld-on # 16.
  9. Verwenden Sie Schraubzwingen oder Schwer Text Bücher, alles an Ort und Stelle zu halten, während die Schweißnähte zu heilen.
  10. Befestigen eines 1 Zoll durch eine 12-Zoll-Stück Polycarbonat auf der Frontplatte 1 Inch unterhalb der Öffnung für die Befestigung des Türscharniers.
  11. Lassen Sie mindestens 24 Stunden für Weld-on zu heilen.
  12. Schneiden Sie zwei Stücke von PEX-Schlauch 12 cm lang und 1 Stück 1 Zoll langen PEX-Schlauch.
  13. Mit einer 5/16 Bohrer ein Loch bohren, in jeder der 12-Zoll-PEX-Schlauch ca. 1 bis 2 cm von einem Ende.
  14. Befestigen 2 x 12 Zoll PEX Schlauch mit einer 3/8 Zoll-T-Stück mit den Löchern von dem Stecker.
  15. Verschließe die offenen Enden des PEX Schläuche mit 3/8 inch-Stecker.
  16. Befestigen Sie den Klavierband an der Frontplatte und Tür mit 4-40 Maschinenschrauben und Muttern.
  17. Mit der Tür als ein Führer, marche die Löcher für die Klavierband erforderlich auf die 1 inch-Abstandshalter auf der Vorderseite der Kammer.
  18. Mit einem 3/16 Zoll-Bohrer, bohren die Löcher in der Frontplatte für den Klavierband.
  19. Schließen Sie die Tür und Klavierband an der Frontplatte mit 4-40 Maschinenschrauben und Muttern.
  20. Bauen Sie die Schnellspanner nach dem Video mit einer Unterlegscheibe und Mutter auf jeder Seite des Auslegers angezeigt.
  21. Mark und Bohrer 3/16 Zoll Löcher für den Schnellspannern auf der Frontplatte und befestigen Knebelklemmen mit 4-40 Maschinenschrauben und Muttern.
  22. Add 3/8 Zoll Gummidichtungslippendichtungen an der Innenseite der Tür.
  23. Mit einer 5/8 Zoll langweilig Bohrer, bohren Sie ein Loch in der Mitte der oberen Platte für die Einlassöffnung.
  24. Bohren Sie ein 1/2 Zoll Loch im Boden / Mitte der Rückwand für die Austrittsöffnung.
  25. Montieren Sie die Austrittsöffnung, indem Sie den Gewindeteil des 3/8 Zoll Wanddurch Adapter durch die Rückwand der Dampfkammer, in der Austrittsöffnung Loch. Bringen Sie die Mutter von derinnerhalb der Kammer in Position zu halten.
  26. Entfernen Sie die Schutzabdeckung aus Polycarbonat-Platten.
  27. Befestigen Sie die 1-Zoll-Stück von PEX-Schlauch an den T-Verbinder und die Kraft der PEX-Schlauch durch das Loch in der Decke der Kammer von innen.
  28. Bringen Sie ein 3/8 Zoll 90 Ellenbogen an die Spitze der 1-Zoll-PEX-Schlauch von außen.
    HINWEIS: Bohren Sie ein 1/2 Zoll Loch in der Tür und legen Sie eine 1/2 Zoll Dichtung Septen in das Loch.
  29. Wiederholen Sie die Schritte 1 bis 22 für die Luftkammer nur steuern.

2. Rack und Luftzufuhranordnung

  1. Wenn Platzierung der Kammern auf der in der Materialliste genannten Warenkorb / Rack, montieren den Wagen nach den Anweisungen des Herstellers.
  2. Mit Ersatz Muttern und Schrauben, befestigen ein Reststück von Polycarbonat mit der Zahnstange, um die Volumenstromregler halten.
  3. Überall auf dem Schrott Stück Polycarbonat, markieren und Bohrer 3/4 Zoll Löcher für die Luftaufsichtsbehörden und Regulatoren zu befestigen mit den Mutternzur Verfügung gestellt.
  4. Befestigen 3/8 Zoll Wanddurch Adapter an den Eintritts-und Austrittsöffnungen der Luftmengenregler.
  5. Montieren Sie den Ethanol-Kolben mit Belüftungsstein, # 8 Stopper und Schnell In-Line-Steckverbinder.
  6. Verwendung von 3/8 Inch Tygon-Schlauch, verbinden die Durchflussreglern mit der Luftpumpe und Ethanol Kolben wie in Fig. 1 gezeigt.
  7. Für die einzige Luftkammer, befestigen die Austrittsöffnung des Luftstromreglers mit dem Einlass 3/8 Zoll Ellbogen 90 mit 3/8 Zoll Tygon-Schlauch, wie in Fig. 1 gezeigt.

Figur 1
1. Schematische Darstellung der Anordnung der Dampfkammern. Ein T-Verbinder mit dem rauscharmen Luftpumpe angebracht. Eine Seite des T-Verbinders ist direkt an einen Volumenstromregler für die Luft nur Dampfkammer verbunden ist. Die anderen side wieder aufgeteilt und an zwei verschiedenen Volumenstromregler, einer für Luft und einen für Ethanol beigefügt. Die Luftkammer ist direkt mit dem Regler verbunden, wie gezeigt. Für die Ethanoldampf Kammer wird ein Volumenstromregler auf der Belüftungsstein in flüssigem Ethanol in der Filterkolben eingetaucht ist. Der Seitenarm-Port der Saugflasche ist mit dem Ausgang des Luftregler verbunden, wie angegeben. Das fusionierte Ethanoldampf und Luft wird dann zu dem Einlaß des Ethanoldampfkammer verbunden ist. Die Austrittsrohre (nicht gezeigt) an einer Lüftungsöffnung in dem Raum verbunden.

3. Testen Vapor Chambers und Stellen Ethanol Levels

  1. In 600 ml 190 Proof Ethanol zu der Filterflasche, legen Sie die Belüftungs Stein und Haken bis zu Rohr an dem Seitenarm des Kolbens Einlass.
  2. Schließen Kammertüren und wiederum auf die Luftpumpe.
  3. Volumenstromregler einstellen, so dass etwa halb so viel Luft durch die Flüssigkeit Alkohol als Luft ist es mit gemischt fließt. AdjusT die Luft nur Luftstrom zur kombinierten Strom des Alkohols und der Luftkammer Ethanol.
  4. Kammern ermöglichen, für mindestens 30 min äquilibrieren gelassen, bevor die Messung der Luftethanolkonzentration.
  5. Messen Sie Luft Ethanol-Konzentration durch Extraktion 5 ml Luft mit einer 18G Nadel und einer 60-ml-Spritze durch das Septum. Verdünnen, dass die Probe mit der Raumluft, indem Sie den Kolben wieder auf 60 ml (1.12 Verdünnung). Messen Sie Luft Ethanol Ebene mit Alkoholtester gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Verdünnung der Kammerluft benötigt wird, um Alkoholdampf Ebenen innerhalb des Erfassungsbereichs des Alkohol erzielen.
    HINWEIS: Bei Verwendung von verschiedenen Ebenen der Alkohol-Exposition die Verdünnung muss unter Umständen angepasst werden.
  6. Als Ausgangspunkt, wie nötig, um eine Luftalkoholkonzentration von etwa 4,5 bis 5 g / dl (g verdampften Alkohol pro dl Luft) zu erreichen passen Sie die Volumenstromregler.

4. Tierzucht

  1. Gruppenhaus Weibchen C578BL / 6 Mäusen (2-3 Monate alt) für mindestens 1 Woche, um Eierstockzyklen synchronisieren.
  2. Individuell Haus männlichen C57BL / 6 Mäuse (2-5 Monate alt) für mindestens 2 Wochen.
  3. Nach der Synchronisierung, setzen Sie ein einzelnes Weibchen mit einem Männchen für 5 Tage bis zur Paarung zu ermöglichen.
  4. Nach der Paarung, entfernen Männchen und Weibchen Haus individuell und legen Sie sie in die Kammern.

5. Pre-und Post-Natal Ethanol Vapor Belichtungs

  1. Expose schwanger Dämme Ethanoldampf für 4 Stunden pro Tag ab 10 Uhr während des Licht-Zyklus (Licht an von 6.00 bis 06.00 Uhr), außer dem Tag der Geburt bis zum Tod zu verhindern pup.
  2. Wiegen Dämme an Schwangerschafts-Tag (G) 5, G13-G14, G20 und G18-Schwangerschaften zu überwachen; Bettwäsche wurde an den Tagen, dass Frauen wurden gewogen, um die Handhabung zu minimieren geändert.
  3. Jeder Tag ersetzen, das Essen für die Ethanol-exponierten Gruppen Verbrauch von Pellets mit jeder in sie aufgenommen Ethanol zu vermeiden.
  4. Am TagGeburt keine Tiere aussetzen. Nach der Geburt setzen die Dämme und Welpen für 4 Stunden pro Tag ab 10 Uhr von P1-P12.
  5. Wiegen Welpen auf P2, P8, P12, P25 und; und Bettzeug wechseln auf P8 und P12 zusätzliches Handling zu minimieren.
  6. Unmittelbar nach der letzten Exposition (P12), übertragen Sie die Käfige zu einem Standard-Tierhaltungsraum.

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Representative Results

2A zeigt, dass sowohl schwangeren Mäusen und neonatalen Nachkommen wurden relativ stabil Ethanoldampfkonzentration in den Kammern ausgesetzt. Dies lag zwischen 4-6 g / dl. 2B zeigt die in den schwangeren Mäusen als Funktion der Zeit erreicht BECs. BECs wurden mit einem Standard-Alkohol-Dehydrogenase-Assay auf Basis 48 gemessen. Am G5, stieg schnell auf BECs ~ 60 mM 2 Stunden nach Beginn der Exposition und ihren Höhepunkt am Ende der 4 Stunden Belichtungszeit. BECs allmählich auf ~ 12 mM nach einem zusätzlichen 4 Stunden nach dem Ende der Belichtung. Von G13-14 gab es eine dramatische Abnahme in BECs zu etwa 60% der Menge an G5 detektiert. Darüber hinaus stiegen langsamer BECs Ebenen und verringert sich schneller, was zu einer kürzeren Gegenwart von Ethanol im Blut von schwangeren Mäusen. In naher Zukunft (G18-20) wurden BECs weiter auf etwa 30% der Menge an G5 erkannt reduziert. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der Entw sindent des raschen Stoffwechsel Toleranz zu Ethanol in den schwangeren Mäusen. 2C zeigt, dass Neugeborene Nachkommen wurden zu BECs in der Nähe von 30 mM ausgesetzt. BECs stieg allmählich in diesen Tieren und erreichte einen Höhepunkt Ende der 4 Stunden Belichtungszeit und allmählich abnehm auf das Ausgangsniveau 8 Stunden nach dem Ende der 4 Stunden Exposition Paradigma. Im Gegensatz zu den schwangeren Dämme, gab es keinen Unterschied zwischen BECs bei Neugeborenen, die früh (P2) ausgesetzt wurden gemessen vs spät (P7-P12) in der Neugeborenenperiode. Diese Ergebnisse zeigen, dass die neugeborenen Mäusen nicht metabolischen Toleranz entwickeln, um Ethanol.

Figur 2
Abbildung 2. Charakterisierung von Ethanol Ebenen. A) Ethanol Dampfkammerebenen relativ konstant geblieben in den Schwangerschafts-und Rückbildungsphasen der Exposition paradigmaMeter Um diese zu messen, wurde Kammerluft mit einer Spritze durch die Gummimembran entnommen, mit Umgebungsluft verdünnt und in die Einlassöffnung eines Alkoholtester ausgewiesen (siehe Video für Details). Werte wurden aus 5 und 4 unterschiedlichen Belichtungs Runden auf den Schwangerschafts und postnatalen Phasen erhalten wurden. B) Blutethanolspiegel zu unterschiedlichen Zeitpunkten für die veranschlagten Schwangerschaftstagen bei schwangeren Muttertiere (n = 5-7 Dämme) gemessen. Die rechtliche Intoxikation Grenze (17,4 mM oder 0,08 g / dl) ist durch die gestrichelte Linie angedeutet. Der graue Balken zeigt die Zeit, die Dämme wurden zu Ethanol. C) wie in B ausgesetzt, sondern für neugeborenen Mäusen (n = 5-9 Jungtiere aus verschiedenen Würfen).

Abbildung 3 zeigt, dass die Exposition Paradigma nicht signifikant Gewichtszunahme in den Dämmen oder die Welpen beeinflussen. Tabelle 2 zeigt, dass die Ethanolexposition nicht signifikant die Anzahl lebensfähiger fetu beeinflussenses, Anzahl der Föten resorbiert, Fötus Gewicht und Plazenta Gewicht (gemessen bei kurzfristig). Tabelle 2 zeigt auch, dass die Zahl der Jungtiere pro Wurf und Sterblichkeit der Jungtiere wurden nicht signifikant durch Ethanolexposition betroffen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen dieser Figur.

Fig. 3
Abbildung 3. Fehlen einer Wirkung von Ethanol-Exposition auf die Staumauer und Welpen Gewichten. A) Dam Gewichtszunahme als Funktion der geschätzten Schwangerschafts Tag (n = 8-12). Das Gewicht zu geschätzten Schwangerschafts Tag 5 entspricht dem Gewicht am ersten Tag der Exposition. B) Pup Gewichtszunahme gemessen als Funktion des Alters (n = 7-9). Für beide Paneele sind die Fehlerbalken kleiner ist als der Symbole. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51839/51839fig3highres.jpg" target = "_blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abmessungen (cm) Höhe Breite
Top 32 22
Boden 32 22
Front 32 14
Zurück 32 14
Seite 1 21,5 14
Seite 2 21,5 14
Tür 18 10

Tabelle 1. Abmessungen von Polycarbonat-Platten.

Luft EtOH
7,50 ± 1,08, n = 6 7,33 ± 1,52, n = 6
Durchschnittliche Fetus Gewicht (g): ~ E18 1,04 ± 0,09, n = 6 0,82 ± 0,09, n = 6
Durchschnittliche Placenta Gewicht (g): ~ E18 0,12 ± 0,003, n = 6 0,14 ± 0,01, n = 6
Anzahl der Re-absorbiert Föten: ~ E18 0,50 ± 0,34, n = 6 0,50 ± 0,50, n = 6
Anzahl der Jungtiere / Wurf 7,11 ± 0,67, n = 9 6,89 ± 0,42, n = 9
Anzahl der toten Welpen / Wurf 0,11 ± 0,11, n = 9 0,66 ± 0,24, n = 9

Tabelle 2. Pre-und postnatale Charakterisierung von Maus-Dampfexposition Paradigma.

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Discussion

Hier beschreiben wir detailliert die Methoden für den Bau von Dampfinhalationskammern. Materialien und Werkzeuge erforderlich sind, um die Kammern zu bauen sind leicht von einer Reihe von kommerziellen Anbietern und die Schritte zur Konstruktion der Kammern sind relativ unkompliziert. Das System, das wir hier beschreiben keine Inline-Rückschlagventile enthalten, um den Rückfluss und Vermischung zu verhindern. Wir konnten keine nachweisbare Ethanol in der Luft zu messen nur Kammern was darauf hindeutet, dass wir keine Misch-oder Rückfluss von Ethanol in den Luftkammern nur nicht. Die Luftkammern sollten nur für Ethanoldampf in regelmäßigen Abständen überprüft werden (es sei darauf hingewiesen, dass die Luftkammer sollte immer vor dem Ethanol Kammer getestet werden, um den Nachweis der Restethanoldampf in der Alkohol und / oder Spritze vorliegenden vermeiden). Idealerweise sollten die Kammern in speziellen Räumen an der Tierstation, wo Maus-Käfige können kontinuierlich für die Dauer der E untergebracht werden platziert werdenxposure Paradigmas, wodurch die Notwendigkeit, um die Mäuse zu transportieren, wodurch Stress. Ein Standard-Zimmer mit einer Lüftungsöffnung ist alles, was für dieses Paradigma benötigt wird. Allerdings, wenn der Raum mit anderen Forschern geteilt wird, kann es notwendig sein, um die Kammern in einem Zimmer mit getrennten Kabinen Platz, um die Exposition von anderen Tieren zu Ethanol Geruch zu minimieren. Jede Kammer kann bis zu 6 Standard-Maus-Käfigen unterzubringen, so dass es eine weniger arbeitsintensive Methode der Exposition als beispielsweise intragastrischen Magensonde.

Die Belichtungs Paradigma kann leicht entsprechend der Anforderung eines bestimmten Experiment modifiziert werden. Die Tiere können während der äquivalent zu allen Trimester der Schwangerschaft beim Menschen zu Ethanol ausgesetzt werden. Es ist zu beachten, dass das Nagetier Entwicklungs entspricht der menschlichen Entwicklung kann je nachdem, welche Gehirnregion betrachtet wird und welche Entwicklungsprozess ein Interesse an (Neurogenese, synaptische Integration, etc.) ist zu variieren. In dieser Studie legten wir die dritte Trimester-Äquivalent wie das Gehirn Wachstumsschub Zeitraum. Forscher sind aufgefordert, die Website zu übersetzen Zeit 49 zu konsultieren. Auf der Grundlage der in Fig. 2B gezeigten Ergebnisse wird empfohlen, dass die Exposition auf einem niedrigeren Niveau der Ethanoldampf (zB ~ 3 g / dl) gestartet werden und nach und nach erhöht, um die Entwicklung der metabolischen Toleranz auszugleichen. Während der Durchführung des Verfahrens sollte die Ermittler eng BECs an verschiedenen Schwangerschafts Tag zu überwachen, um festzustellen, ob dies führt zu stabileren Niveaus in den schwangeren Dämme. Ein Inhibitor der Alkoholdehydrogenase verwendet wurde, um die Entwicklung von Toleranz in Mäusen zu Ethanol in der Gaskammer 50 ausgesetzt wird. Es wird jedoch nicht empfohlen, dass dieses Mittel bei schwangeren Mäusen verwendet werden, weil es möglicherweise Studien legen nahe, teratogene Wirkungen, die die Interpretation der Ergebnisse erschweren könnte 51,52 hat. Darüber hinaus wird jede Form von Injektionen zusätzliche Belastung für die schwangere Damm führen,möglicherweise verwechseln das Experiment 53.

Im Gegensatz zu den schwangeren Dämme, haben Dampfkammer-Exposition während der Neugeborenenperiode nicht in die Entwicklung von Stoffwechsel Toleranz führen. BECs unterschieden sich nicht zwischen P2 und P7-12 Mäusen. Peak BECs waren ähnlich denen in den Dämmen bei G13-14 erkannt und etwas höher als die bei G18-20 nachgewiesen. Allerdings nahm BECs mehr auf der Grundlinie in den Welpen zurück. Es bleibt zu prüfen, ob Ethanolexposition in Dampfkammern während der Schwangerschaftszeit ändert die Kapazität der Neugeborenen-Nachkommen, um Ethanol zu verstoffwechseln. Jedoch basierend auf der Literatur, wäre es für Jungtiere, die während der Schwangerschaft ausgesetzt wurden zu Ethanol zu zeigen eine geringfügig verringerte oder unveränderte Fähigkeit, Ethanol 54,55 metabolisieren erwarten. In unseren Studien haben wir nicht beobachten, ein Unterschied in der durchschnittlichen Gewichts der Nachkommen, und unsere Daten zeigen, dass bis zum Ende der Schwangerschaft, die mütterlichen BECs kaum steigen über dem gesetzlichen Rausch ohne more als 2 Stunden. Diese Daten legen nahe, dass die Mütter nicht wesentlich von der Alkohol-Exposition während der Zeit nach der Geburt betroffen. Dennoch sollte dies weiter erforscht werden vor allem, wenn die Tiere zu höheren Ethanolkonzentrationen ausgesetzt.

Diese Exposition Paradigma hat einige Einschränkungen. Weibliche Mäuse wurden während der ersten fünf Tage der Schwangerschaft ausgesetzt, da sie mit den Männchen in diesem Zeitraum gezüchtet. Ein kürzeres Intervall Zucht versucht werden kann (z. B. 2-3 Tage), aber dies kann zu einer Verringerung der Anzahl der Frauen, die schwanger werden, führen. Alternativ können Tiere für eine kürzere Zeit und Weibchen zur Paarung Stecker überprüft gezüchtet werden. Eine weitere Einschränkung ist, dass alle Mäuse in einer gegebenen Kammer nur auf eine einzige Konzentration der Ethanoldampf ausgesetzt werden. Darüber hinaus sind einige Aspekte der Ethanoldampfkammer Belichtungs Paradigma belastenden, wie die Tatsache, dass Dämme werden einzeln über den Großteil der Trächtigkeit untergebracht und ausgesetzt sindstarke Ethanol Geruch. Es ist auch möglich, dass Ethanol Dämpfe das einige Veränderungen in den Atemwegen von Staudämmen und / oder Welpen. Darüber hinaus Engagement in neugeborenen Ratten ist kein perfektes Modell der Exposition von Menschen im dritten Trimenon (zB ist die Plazenta und Fötus Einheit in diesem Modell nicht vorhanden). Dennoch behaupten wir, daß die Vorteile dieses Paradigma überwiegen die Schwächen, und daß es ein nützliches Modell, um die Mechanismen in der Pathophysiologie beteiligt FASDs charakterisieren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Unterstützt vom National Institutes of Health gewährt R01-AA015614, AA014973-R01, T32-AA014127 und K12-GM088021. Die Autoren danken Samantha L. Blomquist für technische Unterstützung und Drs. Kevin Caldwell und Donald Partridge für das Manuskript und Video kritische Bewertung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polycarbonate 1/4" clear 48" x 24" McMaster-Carr 8574K23 10
Foam Rubber bulb seal 3/8"w x 7/32"h McMaster-Carr 93085K67 10 ft
Weld-on #16 McMaster-Carr 7515A11 3
Piano hinge 12" long McMaster-Carr 1658A11 2 x 1 ft
Hold-down toggle clamps standard McMaster-Carr 5126A26 8
PEX tubing 1/2" McMaster-Carr 51275K88 10 ft
Barbed Tee tube fitting (Black) Pkg 10 McMaster-Carr 5463K608 1
Barbed plug fitting (Black) Pkg 10 McMaster-Carr 5462K79 1
Barbed Elbow tube fitting (Black) Pkg 10 McMaster-Carr 5463K596 1
3/8" Through-Wall Adapters, Tube to Threaded Pipe McMaster-Carr 5463K851 1
Phillips Machine screw 4-40 McMaster-Carr 91772A112 1
Machine screw hex nut 4-40 McMaster-Carr 90480A005 1
Panel-mount flowmeter 2-20 McMaster-Carr 41945K76 3
FLASK, FILTER 1,000 ml 6/PACK VWR 89001-800 2
Precision Seal Septa VWR 89084-490 1
VWR Black Rubber Stopper #8 1-hole VWR 59581-367 1
TUBE TYGON R3603 3/8X9/16 50' VWR 89068-556 1
TUBE TYGON R3603 1/4X11/16 50' VWR 89068-502 1
Aerator Stone P2120 VWR 32573-007 1
3/8" T-connectors Pk of 20 VWR 46600-060 1
VWR Disconnectors tapered Pk of 10 VWR 46600-110 1
3/8 Hose Barb valved in-line coupling Colder Products Company HFCD17612 1
Air pump medium capacity LMI Manufacturers DB60L 1
Nexelate Wire Shelving 36"W X 24"D X 63"H Global industrial T9A990135 1
Stem Casters Set of (4) 5" Polyurethane Wheel Global industrial T9A500591 1

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References

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Medizin fetale Ethanol Belichtung Paradigma Dampf Entwicklung Alkoholismus teratogene Tier Maus Modell
Bau von Dampfkammern verwendet, um Mäuse zu Alkohol Expose Während der Equivalent aller drei Trimester der Human Development
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Morton, R. A., Diaz, M. R., Topper,… More

Morton, R. A., Diaz, M. R., Topper, L. A., Valenzuela, C. F. Construction of Vapor Chambers Used to Expose Mice to Alcohol During the Equivalent of all Three Trimesters of Human Development. J. Vis. Exp. (89), e51839, doi:10.3791/51839 (2014).

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