Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Bygging av Vapor Chambers Brukes til Expose Mus til alkohol under tilsvarende alle tre trimester av Human Development

Published: July 13, 2014 doi: 10.3791/51839
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Neurosciences, School of Medicine, University of New Mexico Health Sciences Center

Summary

Vi viser bygging av alkoholdampkamre som bruker lett tilgjengelige materialer som samtidig rommer seks mus bur. Vi beskriver bruken ytterligere i en musemodell med føtalt alkoholeksponering tilsvarer alle 3 trimester av graviditet. Dette paradigmet utsetter dyr under svangerskap og barsel dager 1-12.

Abstract

Eksponering for alkohol under utvikling kan resultere i en konstellasjon av morfologiske og atferdsmessige forandringer som er kollektivt kjent som Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASDs). På det mest alvorlige enden av spekteret er Fetal Alcohol Syndrome (FAS), preget av veksthemming, kraniofaciale dysmorphology, og neurobehavioral underskudd. Studier med dyremodeller, inkludert gnagere, har belyst mange molekylære og cellulære mekanismene som er involvert i patofysiologien av FASDs. Etanol administrering til gravide rotter har blitt brukt til å modellere human eksponering under de første og andre trimester av svangerskapet. Tredje trimester etanol forbruk hos mennesker har blitt modellert ved hjelp av neonatal gnagere. Imidlertid har få gnagere preget effekten av etanol eksponering under tilsvarende alle tre trimester av graviditet, et mønster av eksponering som er vanlig hos gravide kvinner. Her viser vi hvordan du kan bygge dampkamre fra lett obtainable materialer som hver kan romme opp til seks standard mus bur. Vi beskriver et dampkammer paradigme som kan brukes for å modellere eksponering mot etanol, med minimal håndtering, i alle tre trimester. Våre studier viser at gravide dammer utviklet betydelige metabolske toleranse for etanol. Men neonatal mus ikke utvikler metabolsk toleranse og antall fostre, fostervekt, placenta vekt, antall unger / kull, antall døde unger / kull, og valp vekt ble ikke signifikant påvirket av etanol eksponering. En viktig fordel med dette paradigmet er dens anvendbarhet til studier med genmodifiserte mus. I tillegg, dette paradigmet minimerer håndtering av dyr, en stor forvirre i føtalt alkoholforskning.

Introduction

Drikking under svangerskapet kan skade fosteret, forårsaker vedvarende endringer i mange organer og systemer som betydelig reduserer livskvaliteten for de berørte personer og deres familier. Det er anslått at om lag 10-30% av kvinner drikker under svangerskapet i USA, med 1-8% drikking i en binge mønster 1,2. Utvalget av effekter produsert av etanol eksponering under fosterutviklingen er kollektivt kjent som fetal alcohol spectrum disorders (FASDs). Nyere anslag tyder på at FASDs er et stort folkehelseproblem med en prevalens så høy som 2-5% i USA tre. Jo mer alvorlig manifestasjon av FASDs er Fetal Alcohol Syndrome (FAS), som er preget av veksthemming, kraniofaciale misdannelser, og neurobehavioral underskudd, inkludert lærevansker. Forekomsten av FAS har blitt anslått til å være 0,2 til 0,7% i USA tre. De tilgjengelige behandlinger for FASDs er bare delvis effektivog utvikling av mer effektive behandlinger er begrenset av den dårlige forståelse av cellulære og molekylære grunnlaget for denne komplekse spektrum av lidelser.

Data fra de nasjonale fødselsskader Prevention Study (NBDPS) indikerer at gravide kvinner oftest drikker i løpet av en st trimester, før svangerskapet har blitt oppdaget, etterfulgt av avholdenhet under senere stadier av svangerskapet to. Den NBDPS fant også at den nest vanligste mønsteret av etanol forbruk under svangerskapet innebærer å drikke i alle trimester av svangerskapet to. Årsakene til dette er mangel på bevissthet om de potensielt skadelige effektene av foster etanol eksponering (selv ved lave doser), begrenset tilgang til svangerskapskontroll, positiv historie for nevropsykiatriske lidelser, og misbruk av eller avhengighet av etanol fire. Interessant, rapporterte NBDPS at den tredje mest vanlige forbruksmønsteret involvert avholdenhet i løpet av en 2. trimester fulgt av forbruket i 3. trimester, når det blir ofte antatt at drikking er trygt fordi organogenesen er stort sett ferdig. Imidlertid er det 3. trimester av en periode av høy følsomhet for etanol-indusert skade på nervesystemet, fordi dette er en periode hvor nevrale kretser gjennomgå dyp avgrensning 2. Den NBDPS også identifisert andre, mindre hyppige mønstre av alkoholforbruket som oppstår under svangerskapet, inkludert forbruket i hele 1 og 2. trimester fulgt av avholdenhet i 3. trimester to.

I et forsøk på å modellere de ulike mønstre av etanol forbruk observert hos gravide kvinner, er det etablert en rekke utviklings etanol eksponerings paradigmer bruker ulike dyrearter, med rotter og mus blir mest vanlige 5,6. Varigheten av svangerskapet i disse dyrene vanligvis lasts ca tre uker, noe som tilsvarer en og 2. trimester av graviditet. Mange gnagere har vurdert effekten av ulike doser og mønstre av etanol eksponering i denne perioden. Eksempler på fremgangsmåter som brukes ofte til å administrere etanol til gravide mus og rotter omfatter administrering via flytende dietter 7,8, tilsetting av etanol til drikkevann 9,10, frivillig drikking av sakkarin holdige løsninger 11, gastrisk gavage 12, damp 13 inhalering , og subkutan eller intraperitoneal injeksjon 14. Resultatene fra disse studiene har recapitulated flere av underskudd observert hos mennesker med FASDs, viser at eksponering under tidlige stadier av svangerskapet er tilstrekkelig til å skade nevrale kretser over hele hjernen (anmeldt i 6,15).

Forsøk med rotter har også vist at eksponering i den tilsvarende 3 rd 16-18, intragastrisk intubasjon 19, subkutan injeksjon 20, og damp innånding 21,22. Disse studiene har overbevisende demonstrert at hjernen vekstspurten er en periode med høy sårbarhet for den utviklingsmessige effekten av etanol seks.

Som nevnt ovenfor, drikking under alle trimester av svangerskapet er et vanlig mønster av etanolforbruk hos kvinner 2. Imidlertid har relativt få studier har vurdert effekten av dette mønsteret av eksponering ved bruk av dyremodeller. Noen av disse studiene har tatt advantage av store dyr hvor det 3. trimester-ekvivalent forekommer i livmoren i stedet for neonatal periode som i tilfelle av rotter og mus. Disse dyremodeller inkluderer ikke-menneskelige primater 23,24 og sau 25-27. Men disse dyremodeller har blitt mye brukt i FASDs forskning, delvis på grunn av høye kostnader og behovet for spesialiserte og helseinstitusjoner. Gnagere har blitt mer vanlig å karakterisere effekten av all-trimester etanol eksponering på fosterutvikling fem. Marsvin har vært spesielt fordelaktig i denne forbindelse fått deres omfattende prenatal utvikling og likheter i hjernen modning på den hos mennesker 28,29. I marsvin, har det vært mulig å karakterisere virkningen av etanol eksponering in utero som inkluderer tilsvarende utviklingsperioden av human 3. trimester. Den forholdsvis høye kostnader for disse dyrene, samt den relativt lange varighet av svangerskapet(~ 67 dager), har begrenset bruken til noen få laboratorier som arbeider på FASDs forskning.

På grunn av sin kostnadseffektivitet og bred bruk i biomedisinsk forskning, har etterforskerne brukt rotter til å modellere eksponering for etanol i alle trimester av svangerskapet. I innledende studier ble rotter eksponert under svangerskapet via flytende dietter fulgt av administrasjon av etanol via gastrostomi til kunstig oppdrettet nyfødte (postnatale dager (P) 1-10) som resulterer i peak blod etanol nivåer (BEC) i dammene på 0,08 g / dl og i pups 0,16 g / dl. Dette paradigmet forårsaket langvarige endringer i synsnerven myelinisering og redusert antall Bergmann gliaceller fibre i lillehjernen 30-32. Tilsvarende, Maier og samarbeidspartnere ved hjelp av kunstige oppdrettsforhold administreres etanol til gravide rotter demninger i en binge-aktig måte via intragastrisk intubasjon fulgt av neonatal administrasjon under en del av 3. trimester tilsvar (P4-9) 33,34. PEAK mors og pup becs var 0,3 g / dl på både svangerskaps dag 20 og P6. Dette all-trimester paradigmet resulterte i veksthemming som var betydelig større enn den som ble observert hos avkom eksponert i utvalgte perioder av svangerskapet 33. I tillegg, rotter eksponert for etanol i løpet av tilsvarende alle trimester oppviste en reduksjon i antallet av cerebellar granule og Purkinje-celler som var større enn den som ble observert hos dyr eksponert i løpet av andre perioder 34. Reduksjoner i hippocampus celle tall ble også rapportert med dette paradigmet, men disse effektene ser ut til å være først og fremst en konsekvens av eksponering i 3. trimester-ekvivalent 35. En metode som involverer etanol administrasjon via intragastrisk gavage til både gravide rotter og neonatal mus har også blitt brukt til å modellere alle trimester 36. Denne metoden, som ga becs av ​​0,13 g / dl i dammene (svangerskaps dag 17) og 0,24 g / dl i P6 unger, indusert long-varige endringer i MAO nevrotransmitter nivåene i hippocampus og hypothalamus, og økt uttrykk av DNA methyltransferases og metyl CpG bindende protein 2 i hippocampus 37,38. Ved hjelp av en lignende eksponering paradigme (BEC = 0,14 til 0,2 g / dl i dammer og 0,2 g / dl i unger), Gil-Mohapel et al. 39 oppdaget en økning i antall nye umodne nerveceller i dentate gyrus av voksne rotter som kan representere en kompenserende mekanisme til etanol-indusert neuronal skade eller en endring i modningen av voksen-fødte neuroner. Etterforskerne har også forsøkt å modellere alle trimester etanol eksponering ved å utsette demninger via flytende dietter eller drikkevann under både graviditet og amming 9,40. Imidlertid er nytten av å utsette valpene via morsmelken begrenset fordi det vanligvis resulterer i lave pup Becs (f.eks, 0,002 til 0,05 g / dl; 41,42).

Mus har også blitt brukt extensively å karakterisere virkningene av utviklings etanol eksponering. Denne dyremodell deler mange av de styrker som er beskrevet ovenfor for rottedyremodell, med den ekstra fordel at mange genetisk modifiserte musestammer er tilgjengelige 5. Mus har blitt brukt for å karakterisere virkningene av etanol i en st, 2 nd eller 3 rd trimester av svangerskapet 43,44. Men virkningen av all trimester på disse dyrene har ikke blitt godt karakterisert, fordi det er teknisk vanskeligere å utsette musene i løpet av tilsvarende alle trimester av svangerskapet menneske. For eksempel, kunstig oppdrett og gastrisk sonde, som har vært brukt med hell i rotter, krever mer spesialiserte prosedyrer i mus 45. Så langt vi kjenner til, har bare én studie hittil forsøkt å studere effekten av alle trimester etanol eksponering ved bruk av mus; Disse dyrene ble utsatt for etanolløsning i drikkevann during graviditet og amming 46. Maternal becs var 0,07 g / dl og pup becs ble ikke fastslått, men forventes å være en brøkdel av dem i dammer.

Her beskriver vi en ny modell for alle trimester etanol eksponering av mus der alkohol er administrert til både gravide demninger og nyfødte via damp inhalasjon kamre. Vapor kamre ble bygget basert på en tidligere utforming 47. Vi gir detaljerte instruksjoner om hvordan å bygge innånding kamre og gjennomføre prosedyrer eksponerings. Vi gir også informasjon om de becs som kan oppnås og effekten av eksponering på overlevelse og vekst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle Animal prosedyrene ble godkjent av University of New Mexico-Health Sciences Center Institutional Animal Care og bruk komité.

En. Vapor Chamber Assembly

  1. Cut polykarbonat ark med en sirkelsag eller stikksag til de dimensjonene som i videoen til øverst, nederst, foran, bak, sider og dør (figur 1 og tabell 1).
  2. Med en sirkelsag eller stikksag, kuttet en åpning 8 inches høy med 16 inches bred på midten av frontpanelet.
  3. Mål og merk av hullene for piano hengsel på 18 tommer med 10 tommers polykarbonat ark som vil bli inngangen til kammeret.
  4. I døren, bore benke synke hull med en 5/16 tommers borekronen, og med en 3/16 tommers borer du hull til skruene. Sørg for å bore benke synke hull på innsiden av døren for skruehodene.
  5. Forbered polykarbonat ark for sveising.
  6. Monter front, rygg, og sidepaneler på bunnen panelet med Weld-on # 16.
  7. Forsegle alle åpninger mellom panelene med Weld-on # 16.
  8. Fest toppanelet med Weld-on # 16.
  9. Bruk bar klemmer eller tunge lærebøker for å holde alt på plass mens de sveiser kurere.
  10. Fest et 1 cm av en 12 tommers stykke av polykarbonat på frontpanelet 1. tomme under åpningen for å feste en dørhengsel.
  11. La det være minst 24 timer for Weld-on for å kurere.
  12. Klipp to stykker av PEX rør 12 inches lang og en del av en tomme lang PEX rør.
  13. Med en 5/16 borer et hull i hver av de 12 tommers PEX rør ca 1 til 2 inches fra den ene enden.
  14. Fest 2 x 12 tommers PEX rør til en 3/8 tommers T-kontakt med de hullene som ligger vekk fra kontakten.
  15. Cap de åpne endene av PEX rør med 3/8 tommer plugger.
  16. Fest pianohengsel til frontpanelet og dør ved hjelp av 4-40 maskinskruer og muttere.
  17. Bruke dør som en guide, mArk hullene som trengs for piano hengsel på en tomme spacer på frontpanelet av kammeret.
  18. Med en 3/16 tommers borer du hull i frontpanelet for piano hengsel.
  19. Fest døren og piano hengsel til frontpanelet med 4-40 maskinskruer og muttere.
  20. Monter vippeklemmene som vist i video med en skive og mutter på hver side av sidearmen.
  21. Mark og drill 3/16 tommers hull for veksle klemmer på frontpanelet og fest toggle klemmer med 4-40 maskinskruer og muttere.
  22. Til 3/8 tomme gummi pære tetninger på innsiden av døren.
  23. Med en 5/8 tommers boring borer et hull i midten av topplaten for innløpsporten.
  24. Bor et 1/2 tommers hull i bunnen / midten av bakpanelet for avkjøringen port.
  25. Monter utløpsåpning ved å skyve den gjengede del av 3/8 tommer gjennom-veggen-adaptere gjennom bakveggen av dampkammeret i utløpsåpningen hullet. Fest mutteren frapå innsiden av kammeret for å holde det på plass.
  26. Fjern den beskyttende dekke av polykarbonat ark.
  27. Sett på 1 cm stykke av PEX-rør til T-kontakten og tvinge PEX slange gjennom hullet i toppen av kammeret fra innsiden.
  28. Fest en 3/8 tommer 90 albue til toppen av en tomme PEX slange fra utsiden.
    MERK: Bor et 1/2 tommers hull i døren og sette inn en 1/2 cm segl septa inn i hullet.
  29. Gjenta trinn 1-22 for luften bare kontrollere kammer.

2. Rack og Air Deli Assembly

  1. Hvis du plasserer kamrene på vognen / stativ nevnt i materialliste, montere vogna i henhold til produsentens instruksjoner.
  2. Med reserve muttere og bolter, feste en skrap stykke polykarbonat til stativet for å holde luftstrømmen regulatorer.
  3. Hvor som helst på skrap stykke polykarbonat, mark og drill 3/4 tommers hull for luftstrømmen regulatorer og feste regulatorer med nøtterforutsatt.
  4. Fest 3/8 tommers gjennom veggen adapter til innløps-og utløpsportene lufttekniske regulatorer.
  5. Monter etanol kolbe med lufting stein, # 8 stopperen og quick release i linjer kontakter.
  6. Ved hjelp av 3/8 tomme Tygon rør, forbinder strømnings regulatorer for luftpumpen og etanol kolbe, som vist i figur 1.
  7. For at luften bare kammer, feste utløpsåpning for luftstrømmen regulator til innløpet 3/8 tommer 90 albue med 3/8 inch Tygon-rør som vist i figur 1.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk fremstilling av konfigurasjonen til dampkamrene. A-T-forbindelsesstykke festes til det støyluftpumpe. Den ene siden av T-kontakten er koblet direkte til en luftstrøm regulator for luften bare dampkammer. De andre side er delt igjen og festet til to ulike luftstrøm regulatorer, en for luft og en for etanol. Luftkammeret er direkte koblet til regulatoren som vist. For etanol dampkammeret, blir en luftstrøm regulator som er koblet til lufteren stein nedsenket i væske etanol i filterkolbe. Den sidearmen port av filter kolbe er forbundet med utgangen fra luftregulator som angitt. Den fusjonerte etanoldamp og luft blir så forbundet med innløpet av etanolen dampkammeret. De utløpsrørene (ikke vist) er koblet til et ventilasjonsutløp i rommet.

Tre. Test Vapor Chambers og Juster Etanol Levels

  1. Legg 600 ml 190 proof etanol til filterflaske, sett lufting sten og koble opp til innløpsrøret til sidearmen av kolben.
  2. Lukk kammer dører og slå på luftpumpe.
  3. Juster luftstrøm regulatorer, slik at omtrent halvparten så mye luft strømmer gjennom det flytende alkohol som luften den er blandet med. Justertt luft bare luftstrømmen til den kombinerte strømning av alkoholen og luft av etanolen kammeret.
  4. Tillat kamre ekvilibrering i minst 30 minutter før måling av luftetanolkonsentrasjon.
  5. Mål luft etanolkonsentrasjon ved å ekstrahere 5 ml av luft med en 18G nål og en 60 ml sprøyte gjennom septum. Fortynne at prøven med romluft ved å tegne stempelet tilbake til 60 ml (1:12 fortynning). Måle luft etanol nivå ved hjelp av en Breathalyzer i henhold til produsentens anvisninger. Utvanningen av kammeret luft er nødvendig for å oppnå alkoholdampnivået innenfor rekkevidden av Breathalyzer.
    MERK: Hvis du bruker forskjellige nivåer av alkohol eksponering fortynningen må kanskje justeres.
  6. Som et utgangspunkt, justere luftstrømmen regulatorer som nødvendig for å oppnå en luft alkohol konsentrasjon på ca 4,5-5 g / dl (g fordampet alkohol per dl av luft).

4. Husdyravl

  1. Gruppe huset hunner C578BL / 6 mus (2-3 måneder gamle) i minst en uke for å synkronisere eggstokkene sykluser.
  2. Individuelt huse mannlige C57BL / 6 mus (2-5 måneder gammel) i minst to uker.
  3. Etter synkroniseringen satte en singel kvinne på med en enkelt mann for fem dager for å tillate parring.
  4. Etter parring, fjerne hanner og individuelt huset hunner og plassere dem inn i kammer.

5. Pre-og Post-natal Etanol Vapor Eksponering

  1. Expose gravide demninger til etanol damp for 4 timer per dag starter på 10 am i lys syklus (lysene på fra 6 am-18:00) bortsett fra den dagen fødselen for å hindre valpen død.
  2. Vei dammer på svangerskaps dag (G) 5, G13-G14, og G18-G20 å overvåke svangerskap; sengetøy ble endret på dager som kvinner ble veid for å minimere håndtering.
  3. Hver dag erstatte mat for etanol utsatt grupper for å unngå forbruk av pellets med noe etanol absorbert inn i dem.
  4. På dagen forfødsel ikke utsette dyr. Etter fødselen utsetter dammene og valper for 4 timer per dag starter på 10 am fra P1-P12.
  5. Vei unger på P2, P8, P12, og P25; og endre sengetøy på P8 og P12 for å minimere ekstra håndtering.
  6. Umiddelbart etter siste eksponering (P12), overføre burene til en standard dyr bolig rom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2A viser at både gravide mus og neonatal avkom ble utsatt for relativt stabile konsentrasjoner etanoldamp som kamrene. Disse varierte mellom 4-6 g / dl. Figur 2B viser BECS oppnådd i de gravide mus som en funksjon av tid. Becs ble målt ved hjelp av en standard alkohol dehydrogenase basert analysen 48. Ved G5, raskt steg BECS til ~ 60 mM 2 time etter starten av eksponeringen, og nådde en topp ved enden av den 4 timers eksponeringsperiode. BECS gradvis redusert til ~ 12 mM etter ytterligere 4 timer etter slutten av eksponeringen. Av G13-14, var det en dramatisk nedgang i Becs til ca 60% av nivåene oppdaget på G5. I tillegg BECS nivåene steg langsommere og redusert hurtigere, noe som resulterer i en kortere nærvær av etanol i blodet av de gravide mus. På kort sikt (G18-20), ble becs ytterligere redusert til ca 30% av nivåene oppdaget på G5. Disse funnene er i tråd med utviklent av rask metabolsk toleranse for etanol i gravide mus. Figur 2C viser at neonatal avkom ble utsatt for becs nær 30 mm. Becs gradvis økte i disse dyrene, og nådde en topp på slutten av fire timers eksponeringsperiode og gradvis minkende til baseline nivå åtte timer etter slutten av den fire timers eksponering paradigme. I motsetning til de gravide demninger, var det ingen forskjell mellom BECS målt hos nyfødte som ble eksponert tidlig (P2) g. sen (P7-P12) i neonatal periode. Disse funnene tyder på at neonatal mus ikke utvikler metabolsk toleranse for etanol.

Fig. 2
Figur 2. Karakterisering av etanol nivåer. A) Etanol damp kammernivå holdt seg relativt konstant gjennom svangerskaps og postnatal faser av eksponering paradigm. For å måle disse nivåer ble kammer luft trukket med en sprøyte gjennom gummi septum, fortynnes med omgivende luft, og utviser inn i innløpsporten i en breathalyzer (se video for detaljer). Verdier ble innhentet fra fem og fire ulike eksponerings runder for svangerskaps og postnatal faser, henholdsvis. B) Blood etanol nivåer målt på ulike tidspunkter for de angitte estimerte svangerskaps dager i gravide demninger (n = 5-7 dammer). Den lovlige rus grensen (17,4 mm eller 0,08 g / dl) er angitt med stiplet linje. Det grå feltet indikerer tiden dammene ble utsatt for etanol. C) Samme som i B, men for neonatal mus (n = 5-9 valper fra forskjellige kull).

Figur 3 viser at eksponering paradigmet ikke i vesentlig grad påvirker vektøkning hos hunnrotter eller avkommet. Tabell 2 viser at etanol eksponering ikke i vesentlig grad påvirker antallet levedyktige FetuSES, antall resorberte fostre, fosteret vekt, og morkaken vekt (målt på kort sikt). Tabell 2 viser også at antall unger per kull og mortalitet hos avkom ikke ble vesentlig påvirket av etanol eksponering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figur.

Figur 3
Figur 3.. Mangel på en effekt av etanol eksponering på dam og pup vekter. A) Under vektøkning som funksjon av den beregnede drektighets dag (n = 8-12). Vekten til estimert svangerskaps dag 5 tilsvarer vekten målt på den første dagen for eksponering. B) Pup vektøkning som funksjon av alder (n = 7-9). For begge paneler, feilfeltene er mindre enn symbolene. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51839/51839fig3highres.jpg" target = "_blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Dimensjoner (inches) Høyde Bredde
Topp 32 22
Bottom 32 22
Front 32 14
Tilbake 32 14
Side 1 21.5 14
Side 2 21.5 14
Dør 18 10

Tabell 1. Dimensjoner på polykarbonat ark.

Air EtOH
7.50 ± 1.08, n = 6 7.33 ± 1.52, n = 6
Gjennomsnittlig Fetus Vekt (g): ~ E18 1,04 ± 0,09, n = 6 0,82 ± 0,09, n = 6
Gjennomsnittlig Placenta Vekt (g): ~ E18 0,12 ± 0,003, n = 6 0,14 ± 0,01, n = 6
Antall Re-absorbert fostre: ~ E18 0,50 ± 0,34, n = 6 0,50 ± 0,50, n = 6
Antall valper / kull 7,11 ± 0,67, n = 9 6,89 ± 0,42, n = 9
Antall døde valper / kull 0,11 ± 0,11, n = 9 0,66 ± 0,24, n = 9

Tabell 2. Pre-og post-natal karakterisering av mus eksponering damp paradigme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi i detalj fremgangsmåter for konstruksjon av damp inhalasjon kamre. Materialer og verktøy som kreves for å bygge kamrene er lett tilgjengelig fra en rekke kommersielle leverandører og trinnene for bygging av kamrene er relativt grei. Det system som beskrives her ikke inneholder noen in-line tilbakeslagsventiler for å forebygge tilbake-strømning og blanding. Vi var ikke i stand til å måle noen påviselig etanol i luften bare kamre som tyder på at vi ikke har noen blanding eller tilbake flyten av etanol i luften bare kamre. Luften bare kamrene bør kontrolleres for etanoldamp periodisk (det bør bemerkes at luftkammeret alltid skal testes før etanol kammeret for å unngå påvisning av gjenværende etanol damp tilstede i breathalyzer og / eller sprøyte). Ideelt sett bør kamrene plasseres i egne rom i anlegget for dyrehold hvor muse bur kan være kontinuerlig plassert for varigheten av eXposure paradigme, eliminerer behovet for å transportere mus, og dermed redusere stress. En standard rom med en ventilasjonsuttaket er alt som trengs for dette paradigmet. Imidlertid, hvis rommet er delt med andre forskere, kan det være nødvendig å plassere kamrene i et rom med adskilte avlukker for å minimalisere eksponering av andre dyr for å etanol lukt. Hvert kammer kan huse opp til seks standard mus bur, noe som gjør det til en mindre arbeidskrevende metode for eksponering enn, for eksempel, intragastrisk gavage.

Eksponeringen paradigme kan lett modifiseres i henhold til kravet om en bestemt eksperimentet. Dyr kan bli utsatt for etanol i løpet av tilsvarende alle trimester av svangerskapet human. Det bør bemerkes at den gnager utviklings tilsvarer menneskelig utvikling kan variere avhengig av hva hjernen regionen er behandlet og hva utviklingsprosess man er interessert i (neurogenesis, synaptisk integrasjon, etc). I denne studien definert vi tredje triMester-ekvivalent som hjernen vekstspurten perioden. Forskere oppfordres til å ta kontakt med nettstedet sette tid 49. Basert på resultatene som er vist i figur 2B, anbefaler vi at eksponering startes på et lavere nivå av etanol damp (f.eks ~ 3 g / dl) og gradvis økes for å kompensere for utvikling av metabolsk toleranse. Under gjennomføringen av prosedyren, bør etterforskere følge nøye Becs på ulike svangerskaps dager å fastslå om dette resulterer i mer stabile nivåer i de gravide demninger. En inhibitor av alkohol dehydrogenase er blitt brukt for å forhindre utvikling av toleranse hos mus eksponert for etanol i dampkamre 50. Men, er det ikke anbefalt at denne agenten brukes hos gravide mus fordi studier antyder det har potensielt teratogene effekter som kan komplisere tolkningen av resultatene 51,52. Videre vil injeksjoner av enhver form føre til ekstra stress til den gravide demningen,potensielt konfunderende eksperimentet 53.

I motsetning til gravide demninger, gjorde dampkammer eksponering under nyfødtperioden ikke føre til utvikling av metabolsk toleranse. Becs var ikke forskjellig mellom P2 og P7-12 mus. Peak BECS var lik de detektert i dammer på G13-14, og noe høyere enn de som er detektert ved G18-20. Men Becs tok lengre tid å komme tilbake til baseline i valpene. Det gjenstår å fastslås om etanol eksponering i dampkamrene i løpet av svangerskapsdiabetes for endrer kapasiteten til neonatal avkom for å forbrenne etanol. Men basert på litteraturen, det ville være forventet for valpene som ble eksponert under svangerskapet til etanol til å vise en litt redusert eller uendret kapasitet til å forbrenne etanol 54,55. I våre studier har vi ikke observere en forskjell i gjennomsnittlig vekt av ungene, og våre data viser at ved utgangen av svangerskapet, mors becs knapt rager over den lovlige rus for ingen more enn 2 timer. Disse dataene antyder at mødrene ikke er vesentlig påvirket av alkohol eksponering under barsel. Likevel, dette bør utforskes videre, spesielt hvis dyr blir utsatt for høyere etanol nivåer.

Denne eksponeringen paradigmet har noen begrensninger. Hunnmus ble ikke utsatt i løpet av de første fem dagene av svangerskapet fordi de er avlet med hannene i denne perioden. En kortere avl intervall kan forsøkes (f.eks 2-3 dager), men dette kan føre til en reduksjon i antall kvinner som blir gravide. Alternativt, kan dyr bli avlet for en kortere tid, og hunnene sjekket for copulation plugger. En annen begrensning er at alle mus i en gitt kammer kan bare bli utsatt for en enkelt konsentrasjon av etanoldamp. Dessuten, noen aspekter av etanol dampkammeret eksponering paradigme er stressende, slik som det faktum at dammene er enkeltvis plassert gjennom flertallet av drektigheten, og er utsatttil sterk etanol lukt. Det er også mulig at eksponering etanol damp forårsaker noen endringer i luftveiene av dammer og / eller pups. I tillegg, er eksponering til nyfødte rotter ikke en perfekt modell for menneskelig eksponering under det tredje trimester (f.eks, i placenta-føtal enhet ikke er tilstede i denne modell). Ikke desto mindre, hevder vi at fordelene med dette paradigmet oppveier sine svakheter, og at det kan være en nyttig modell for å karakterisere de mekanismer som er involvert i patofysiologien av FASDs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Støttet av National Institutes of Health gir R01-AA015614, R01-AA014973, T32-AA014127 og K12-GM088021. Forfatterne takker Samantha L. Blomquist for teknisk assistanse og legene. Kevin Caldwell og Donald Partridge for kritisk vurdere manuskriptet og video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polycarbonate 1/4" clear 48" x 24" McMaster-Carr 8574K23 10
Foam Rubber bulb seal 3/8"w x 7/32"h McMaster-Carr 93085K67 10 ft
Weld-on #16 McMaster-Carr 7515A11 3
Piano hinge 12" long McMaster-Carr 1658A11 2 x 1 ft
Hold-down toggle clamps standard McMaster-Carr 5126A26 8
PEX tubing 1/2" McMaster-Carr 51275K88 10 ft
Barbed Tee tube fitting (Black) Pkg 10 McMaster-Carr 5463K608 1
Barbed plug fitting (Black) Pkg 10 McMaster-Carr 5462K79 1
Barbed Elbow tube fitting (Black) Pkg 10 McMaster-Carr 5463K596 1
3/8" Through-Wall Adapters, Tube to Threaded Pipe McMaster-Carr 5463K851 1
Phillips Machine screw 4-40 McMaster-Carr 91772A112 1
Machine screw hex nut 4-40 McMaster-Carr 90480A005 1
Panel-mount flowmeter 2-20 McMaster-Carr 41945K76 3
FLASK, FILTER 1,000 ml 6/PACK VWR 89001-800 2
Precision Seal Septa VWR 89084-490 1
VWR Black Rubber Stopper #8 1-hole VWR 59581-367 1
TUBE TYGON R3603 3/8X9/16 50' VWR 89068-556 1
TUBE TYGON R3603 1/4X11/16 50' VWR 89068-502 1
Aerator Stone P2120 VWR 32573-007 1
3/8" T-connectors Pk of 20 VWR 46600-060 1
VWR Disconnectors tapered Pk of 10 VWR 46600-110 1
3/8 Hose Barb valved in-line coupling Colder Products Company HFCD17612 1
Air pump medium capacity LMI Manufacturers DB60L 1
Nexelate Wire Shelving 36"W X 24"D X 63"H Global industrial T9A990135 1
Stem Casters Set of (4) 5" Polyurethane Wheel Global industrial T9A500591 1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). World Health Organization Who. Alcohol use and binge drinking among women of childbearing age--United States. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 61 (28), 534-538 (2012).
  2. Ethen, M. K., et al. Alcohol consumption by women before and during pregnancy. Matern Child Health J. 13, 274-285 (2009).
  3. May, P. A., et al. Prevalence and epidemiologic characteristics of FASD from various research methods with an emphasis on recent in-school studies. Dev Disabil Res Rev. 15, 176-192 (2009).
  4. Wendell, A. D. Overview and epidemiology of substance abuse in pregnancy. Clin Obstet Gynecol. 56, 91-96 (2013).
  5. Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Exp Biol Med (Maywood. 230, 389-393 (2005).
  6. Valenzuela, C. F., Morton, R. A., Diaz, M. R., Topper, L. Does moderate drinking harm the fetal brain? Insights from animal models). Trends Neurosci. 35, 284-292 (2012).
  7. Sliwowska, J. H., Song, H. J., Bodnar, T., Weinberg, J. Prenatal Alcohol Exposure Results in Long-Term Serotonin Neuron Deficits in Female Rats: Modulatory Role of Ovarian Steroids. Alcohol Clin. Exp. Res. 10, (2013).
  8. Sutherland, R. J., McDonald, R. J., Savage, D. D. Prenatal exposure to moderate levels of ethanol can have long-lasting effects on hippocampal synaptic plasticity in adult offspring. Hippocampus. 7, 232-238 (1997).
  9. Naassila, M., Daoust, M. Effect of prenatal and postnatal ethanol exposure on the developmental profile of mRNAs encoding NMDA receptor subunits in rat hippocampus. J Neurochem. 80, 850-860 (2002).
  10. Servais, L., et al. Purkinje cell dysfunction and alteration of long-term synaptic plasticity in fetal alcohol syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9858-9863 (2007).
  11. Brady, M. L., Allan, A. M., Caldwell, K. K. A limited access mouse model of prenatal alcohol exposure that produces long-lasting deficits in hippocampal-dependent learning and memory. Alcohol Clin Exp Res. 36, 457-466 (2012).
  12. Bake, S., Tingling, J. D., Miranda, R. C. Ethanol exposure during pregnancy persistently attenuates cranially directed blood flow in the developing fetus: evidence from ultrasound imaging in a murine second trimester equivalent model. Alcohol Clin Exp Res. 36, 748-758 (2012).
  13. Cuzon, V. C., Yeh, P. W., Yanagawa, Y., Obata, K., Yeh, H. H. Ethanol consumption during early pregnancy alters the disposition of tangentially migrating GABAergic interneurons in the fetal cortex. J Neurosci. 28, 1854-1864 (2008).
  14. Godin, E. A., et al. Magnetic resonance microscopy defines ethanol-induced brain abnormalities in prenatal mice: effects of acute insult on gestational day 7. Alcohol Clin Exp Res. 34, 98-111 (2010).
  15. Gil-Mohapel, J., Boehme, F., Kainer, L., Christie, B. R. Hippocampal cell loss and neurogenesis after fetal alcohol exposure: insights from different rodent models. Brain Res Rev. 64, 283-303 (2010).
  16. Diaz, J., Samson, H. H. Impaired brain growth in neonatal rats exposed to ethanol. Science. 208, 751-753 (1980).
  17. Stanton, M. E., Goodlett, C. R. Neonatal ethanol exposure impairs eyeblink conditioning in weanling rats. Alcohol Clin Exp Res. 22, 270-275 (1998).
  18. West, J. R., Hamre, K. M., Pierce, D. R. Delay in brain growth induced by alcohol in artificially reared rat pups. Alcohol. 1, 213-222 (1984).
  19. Tran, T. D., Stanton, M. E., Goodlett, C. R. Binge-like ethanol exposure during the early postnatal period impairs eyeblink conditioning at short and long CS-US intervals in rats. Dev Psychobiol. 49, 589-605 (2007).
  20. Ikonomidou, C., et al. Ethanol-induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome. Science. 287, 1056-1060 (2000).
  21. Heaton, M. B., Paiva, M., Madorsky, I., Siler-Marsiglio, K., Shaw, G. Effect of bax deletion on ethanol sensitivity in the neonatal rat cerebellum. J Neurobiol. 66, 95-101 (2006).
  22. Ryabinin, A. E., Cole, M., Bloom, F. E., Wilson, M. C. Exposure of neonatal rats to alcohol by vapor inhalation demonstrates specificity of microcephaly and Purkinje cell loss but not astrogliosis. Alcohol Clin Exp Res. 19, 784-791 (1995).
  23. Kraemer, G. W., Moore, C. F., Newman, T. K., Barr, C. S., Schneider, M. L. Moderate level fetal alcohol exposure and serotonin transporter gene promoter polymorphism affect neonatal temperament and limbic-hypothalamic-pituitary-adrenal axis regulation in monkeys. Biol Psychiatry. 63, 317-324 (2008).
  24. Schneider, M. L., et al. Moderate-level prenatal alcohol exposure alters striatal dopamine system function in rhesus monkeys. Alcohol Clin Exp Res. 29, 1685-1697 (2005).
  25. Ramadoss, J., Hogan, H. A., Given, J. C., West, J. R., Cudd, T. A. Binge alcohol exposure during all three trimesters alters bone strength and growth in fetal sheep. Alcohol. 38, 185-192 (2006).
  26. Ramadoss, J., Lunde, E. R., Pina, K. B., Chen, W. J., Cudd, T. A. All three trimester binge alcohol exposure causes fetal cerebellar purkinje cell loss in the presence of maternal hypercapnea, acidemia, and normoxemia: ovine model. Alcohol Clin Exp Res. 31, 1252-1258 (2007).
  27. Ramadoss, J., Tress, U., Chen, W. J., Cudd, T. A. Maternal adrenocorticotropin, cortisol, and thyroid hormone responses to all three-trimester equivalent repeated binge alcohol exposure: ovine model. Alcohol. 42, 199-205 (2008).
  28. Byrnes, M. L., Reynolds, J. N., Brien, J. F. Brain growth spurt-prenatal ethanol exposure and the guinea pig hippocampal glutamate signaling system. Neurotoxicol Teratol. 25, 303-310 (2003).
  29. Catlin, M. C., Abdollah, S., Brien, J. F. Dose-dependent effects of prenatal ethanol exposure in the guinea pig. Alcohol. 10, 109-115 (1993).
  30. Phillips, D. E., Krueger, S. K. Effects of combined pre- and postnatal ethanol exposure (three trimester equivalency) on glial cell development in rat optic nerve. Int J Dev Neurosci. 10, 197-206 (1992).
  31. Phillips, D. E., Krueger, S. K., Rydquist, J. E. S. hort- Short- and long-term effects of combined pre- and postnatal ethanol exposure (three trimester equivalency) on the development of myelin and axons in rat optic nerve. Int J Dev Neurosci. 9, 631-647 (1991).
  32. Shetty, A. K., Burrows, R. C., Wall, K. A., Phillips, D. E. Combined pre- and postnatal ethanol exposure alters the development of Bergmann glia in rat cerebellum. Int J Dev Neurosci. 12, 641-649 (1994).
  33. Maier, S. E., Chen, W. J., Miller, J. A., West, J. R. Fetal alcohol exposure and temporal vulnerability regional differences in alcohol-induced microencephaly as a function of the timing of binge-like alcohol exposure during rat brain development. Alcohol Clin Exp Res. 21, 1418-1428 (1997).
  34. Maier, S. E., Miller, J. A., Blackwell, J. M., West, J. R. Fetal alcohol exposure and temporal vulnerability: regional differences in cell loss as a function of the timing of binge-like alcohol exposure during brain development. Alcohol Clin Exp Res. 23, 726-734 (1999).
  35. Livy, D. J., Miller, E. K., Maier, S. E., West, J. R. Fetal alcohol exposure and temporal vulnerability: effects of binge-like alcohol exposure on the developing rat hippocampus. Neurotoxicol Teratol. 25, 447-458 (2003).
  36. Kelly, S. J., Lawrence, C. R. Intragastric intubation of alcohol during the perinatal period. Methods Mol Biol. 447, 101-110 (2008).
  37. Perkins, A., Lehmann, C., Lawrence, R. C., Kelly, S. J. Alcohol exposure during development: Impact on the epigenome. Int J Dev Neurosci. 31, 391-397 (2013).
  38. Tran, T. D., Kelly, S. J. Alterations in hippocampal and hypothalamic monoaminergic neurotransmitter systems after alcohol exposure during all three trimester equivalents in adult rats. J Neural Transm. 106, 773-786 (1999).
  39. Gil-Mohapel, J., et al. Altered adult hippocampal neuronal maturation in a rat model of fetal alcohol syndrome. Brain Res. 1384, 29-41 (2011).
  40. Popovic, M., Caballero-Bleda, M., Guerri, C. Adult rat's offspring of alcoholic mothers are impaired on spatial learning and object recognition in the Can test. Behav Brain Res. 174, 101-111 (2006).
  41. Guerri, C., Sanchis, R. Alcohol and acetaldehyde in rat's milk following ethanol administration. Life Sci. 38, 1543-1556 (1986).
  42. Matta, S. G., Elberger, A. J. Combined exposure to nicotine and ethanol throughout full gestation results in enhanced acquisition of nicotine self-administration in young adult rat offspring. Psychopharmacology (Berl. 193, 199-213 (2007).
  43. Olney, J. W. Fetal alcohol syndrome at the cellular level). Addict Biol. 9, 137-149 (2004).
  44. Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Exp Biol Med (Maywood). 230, 366-375 (2005).
  45. Lewis, S. M., et al. Modifying a displacement pump for oral gavage dosing of solution and suspension preparations to adult and neonatal mice). Lab Anim (NY). 39, 149-154 (2010).
  46. Cebolla, A. M., et al. Effects of maternal alcohol consumption during breastfeeding on motor and cerebellar Purkinje cells behavior in mice. Neurosci Lett. 455, 4-7 (2009).
  47. Becker, H. C., Hale, R. L. Repeated episodes of ethanol withdrawal potentiate the severity of subsequent withdrawal seizures: an animal model of alcohol withdrawal "kindling". Alcohol Clin. Exp. Res. 17, 94-98 (1993).
  48. Galindo, R., Valenzuela, C. F. Immature hippocampal neuronal networks do not develop tolerance to the excitatory actions of ethanol. Alcohol. 40, 111-118 (2006).
  49. Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33, 7368-7383 (2013).
  50. Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Weathersby, R. T. Repeated ethanol withdrawal experience increases the severity and duration of subsequent withdrawal seizures in mice. Alcohol. 14, 319-326 (1997).
  51. Ukita, K., Fukui, Y., Shiota, K. Effects of prenatal alcohol exposure in mice: influence of an ADH inhibitor and a chronic inhalation study. Reprod Toxicol. 7, 273-281 (1993).
  52. Varma, P. K., Persaud, T. V. Influence of pyrazole, an inhibitor of alcohol dehydrogenase on the prenatal toxicity of ethanol in the rat. Res Commun Chem Pathol Pharmacol. 26, 65-73 (1979).
  53. Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemp Top Lab Anim Sci. 43, 42-51 (2004).
  54. Arias, C., Molina, J. C., Mlewski, E. C., Pautassi, R. M., Spear, N. Acute sensitivity and acute tolerance to ethanol in preweanling rats with or without prenatal experience with the drug. Pharmacol Biochem Behav. 89, 608-622 (2008).
  55. Nizhnikov, M. E., Molina, J. C., Varlinskaya, E. I., Spear, N. E. Prenatal ethanol exposure increases ethanol reinforcement in neonatal rats. Alcohol Clin Exp Res. 30, 34-45 (2006).

Tags

Medisin foster etanol eksponering paradigme damp utvikling alkoholisme teratogen dyr mus modell
Bygging av Vapor Chambers Brukes til Expose Mus til alkohol under tilsvarende alle tre trimester av Human Development
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morton, R. A., Diaz, M. R., Topper,… More

Morton, R. A., Diaz, M. R., Topper, L. A., Valenzuela, C. F. Construction of Vapor Chambers Used to Expose Mice to Alcohol During the Equivalent of all Three Trimesters of Human Development. J. Vis. Exp. (89), e51839, doi:10.3791/51839 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter