Abstract
Поскольку электрон передачи 1940s микроскопии (ПЭМ) оказывает биологов с изображениями ультра-высокого разрешения биологических материалов. Тем не менее, из трудоемких и затратных по времени протоколов, которые также требуют опыт в подготовке без артефактов, образцов, ТЕМ не считается методика удобно. Традиционный пробоподготовки для ПЭМ использовали химические фиксаторы, чтобы сохранить клеточные структуры. Замораживание высокого давления является cryofixation биологических образцов при высоких давлениях производить очень быстрые скорости охлаждения, тем самым ограничивая образование льда, который наносит ущерб целостности клеточной ультраструктуры. Замораживание высокого давления и замена замораживания в настоящее время методом выбора для производства самого высокого качества морфологии в секциях смолы для ТЭМ. Эти методы минимизации артефактов, обычно связанные с традиционной обработке для ТЭМ тонких срезов. После cryofixation замерзшей воды в образце жидкости заменяетсяорганический растворитель при низких температурах, этот процесс называется замещение замерзания. Замораживание замена обычно проводят в течение нескольких дней в посвященном, дорогостоящего оборудования. Недавнее нововведение позволяет процесс должен быть завершен в течение трех часов, вместо обычных двух дней. Это, как правило, следует еще несколько дней пробоподготовки, который включает инфильтрацию и встраивания в эпоксидных смол, прежде чем секционирования. Здесь мы приводим протокол, сочетающий замораживание высокого давления и быстрое замещение замораживания, что позволяет образец фиксация завод, чтобы быть достигнуто в течение нескольких часов. Протокол может быть легко адаптирован для работы с другими тканями или организмов. Растительные ткани вызывают особую озабоченность в связи с наличием газированных пространств и заполненных водой вакуолей, которые препятствуют свободной ото льда замерзание воды. Кроме того, процесс химической фиксации особенно долго растений за счет клеточных стенок, препятствующих проникновению химических веществ, чтобы глубоко в ткани. Растительные ткани, следовательно, участнлярно сложным, но этот протокол является надежным и производит образцы высочайшего качества.
Introduction
Наше знание ультраструктуры клеток поступает в основном из электронной микроскопии, которые могут решить детали в диапазоне от нескольких нанометров 1. Несмотря на то, настолько мощным, в резолюции ТЭМ не считается удобной, как подготовка образца требуется много времени и трудоемкие протоколы, и требует определенного опыта от врача. Традиционный фиксация образцов объединил использование альдегидов и осмия перед дальнейшей обработки, которая включает обезвоживание, вложение в смоле, а затем секционирования производить ультратонкие срезы, которые затем окрашивали тяжелых металлов. Тем не менее, известно, что химической фиксации может производить артефакты в том числе агрегации белка и липидов потери 1, и изменения в мембранах, что, в конечном счете влияют несколько клеточных компартментах 2. Эти артефакты в основном связано с медленной скоростью фиксации и дегидратации при комнатной температуре 3, 4, 5.
6, 7. ФВЧ уменьшается Температура образца для жидкого азота, под очень высоким давлением (210 МПа или 2100 бар) в миллисекундах. Если все сделано правильно ФВЧ предотвращает образование крупных кристаллов льда, которые могут вызвать серьезные повреждения ультраструктуры клеток. ФВЧ может быть использован для фиксации образцов толщиной 100-200 мкм при типичных концентраций растворенных веществ в биологических 7. Существуют многочисленные отзывы на физике и принципы, лежащие в основе ФВЧ, например, 1, 7, 8.
После HPF, образцы инкубируют при низкой температуре (-78,5 ° С до -90 &# 176; C) в присутствии жидких органических растворителей, содержащих химических фиксаторов как осмия, как правило, в течение нескольких дней. При такой низкой температуре, вода в образце заменяется на органическом растворителе, обычно ацетон или метанол, 1 9. Таким образом, этот процесс называется замена замораживания (FS). Затем образец постепенно нагревают, и в течение этого времени является фиксированной, как правило, с осмия и уранил-ацетатом 9. Сшивание при низких температурах обладает тем преимуществом, фиксации молекулы, которые иммобилизованных 1. FS, следовательно, производит образцы высшего качества по сравнению с теми, фиксированный с помощью обычной химической фиксации при комнатной температуре, в частности, это приводит к улучшенным сохранением ультраструктуры, лучшей сохранности антигенности и уменьшить потерю несвязанных клеточных компонентов 10, 11.
Большинство FS осуществляется в течение длительных периодов времени, как правило, до нескольких дней. Это особенно Truе для растений образцов 12, 13, 14. Недавнее протокол, разработанный Макдональд и Уэбб значительно сокращает время для FS от нескольких дней до нескольких часов 15. В их быстрого замещения замораживания (QFS) процедуры, FS осуществляется в течение 3 часов, в то время как в супер быстрых FS образцы (SQFS) обрабатываются в течение 90 минут. Качество образцов, полученных с помощью этих методов можно сравнить с теми, которые давала традиционных протоколов FS. Мы приняли протокол QFS для глубокой переработки растительных образцов после ФВЧ. Это оказалось сэкономить не только время, но и деньги, как QFS и SQFS использовать здравый лабораторного оборудования вместо дорогостоящих коммерчески доступных машин ФС.
Растительные ткани, часто очень сложной, чтобы подготовиться к ТЭМ. В среднем, растительные клетки крупнее, чем либо бактериальных или животных клеток. Наличие гидрофобного восковой кутикулы, толстые клеточные стенки, крупных емкостей, заполненных водой вакуолей, содержащих органические кислоты, гидролазы и фенольного Compounds, что может занимать до 90% от общего объема клеточной 16, и присутствие газированных пространств строго уменьшается теплопроводность системы 17. Кроме того, в случае растений, толщина образца почти всегда превышает 20 мкм, предел для использования химической фиксации. В этих толщин, низкой теплопроводности воды предотвращает замораживание со скоростью больше, чем -10000 ° C / сек в центре образца. Этот показатель необходим, чтобы избежать повреждения гексагональную образование льда (ледяные кристаллы с более низкой плотностью и больше, чем от 10 до 15 нм) 8. Вместе, эти нынешние вызовы как надлежащего замораживания образца и последующих FS. Тем не менее, cryofixation является лучшим методом для фиксации образцы растений. Вот это протокол для ФВЧ-QFS образцов ткани растений представлена. Она сосредоточена на модель вида Arabidopsis THALIANA, но также используется с Nicotiana benthamiana. Типичные результаты показывают, что HPF-QFS производит саmples сопоставимого качества традиционных HPF-FS в долю времени. При правильном корректировок, этот протокол также может быть использована для других относительно толстых биологических образцах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура QFS требует крайней осторожности и осторожности со стороны пользователя, и мы выделить эти меры предосторожности здесь как предупреждения и примечания, где это возможно.
1.Preparation для ФВЧ Run
- Перед началом подготовки образцов, включите морозильник высокого давления в соответствии с инструкциями изготовителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: ФВЧ единица, используемая в данном протоколе является Вольвенд Компактный 02 единица (1А), и это занимает примерно 12:59-и с половиной часов процедуры запуска до ФВЧ работает может начаться.- Включение Вольвенд Компактный 02 высокого давления Freezer.
- Включите инструмент, поворачивая главный выключатель от "0" до "1".
- Выпуск сжатого воздуха к машине.
- Выпуск жидкого азота к машине.
- Нажмите кнопку "SYSTEM высохнуть".
- Через 30 мин, нажмите "SysteM высыхают "кнопку еще раз.
- Нажмите кнопку "ON / OFF" для переключения на инструмент.
- Нажмите кнопку «Азот».
- Дайте машине остыть в течение 20 минут, даже если «DRIVE IN" кнопки уже загорелись.
- «DRIVE IN» включается подсветка кнопки.
- Нажмите "Drive In" кнопку.
- Нажмите кнопку "AUTO".
- В "Система готова" подсветка кнопки.
- Поместите зонд температуры и давления в барокамере и зафиксируйте его с пальца.
- Нажмите кнопку "JET AUTO". Эта операция проверяет, что повышение давления и понижение температуры являются по желанию; существенно пробный запуск. Резкие перепады температуры и резких скачков давления, как ожидается (Рисунок 1В).
- Провести еще два циклы JET.
- Включение Вольвенд Компактный 02 высокого давления Freezer.
2 Подготовка к Receiviнг Замороженные образцы
- Заполните изолированную коробку с криопробирку держатели с жидким азотом (см Техника безопасности), так что держатели полностью покрыты (Рисунок 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование СИЗ включая cryogloves и очки при работе с жидким азотом. - Поместите необходимое количество флаконов, содержащих среду FS в держатели алюминиевой трубы в жидком азоте (Рисунок 1C). С помощью этого протокола до четырех дисков каждый из которых содержит один образец может быть помещен в одном криопробирку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Флаконы должны быть маркированы с острым инструментом, как алмазным писца и очень мягким карандашом.- Для фиксатора во QFS использовать 1% ОСО 4 и 0,1% уранилацетатом в ацетоне 9. Готовят раствор в большом объеме, обойтись аликвоты 1,5 мл в криопробирки и магазина, замороженных в жидком азоте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте Предупреждения по технике безопасности для работы ОСО 4 и уранилацетатом.
ПРИМЕЧАНИЕ: OsO 4 ПРИМЕЧАНИЕ: криопробирки, используемые для хранения образцов для QFS, должны иметь твердое уплотнительное кольцо, чтобы убедиться, что трубы остаются запечатанными во QFS чтобы избежать утечки OsO 4.
- Для фиксатора во QFS использовать 1% ОСО 4 и 0,1% уранилацетатом в ацетоне 9. Готовят раствор в большом объеме, обойтись аликвоты 1,5 мл в криопробирки и магазина, замороженных в жидком азоте.
- Подготовка дрожжевой пасты путем смешивания пекарских дрожжей с примерно равным объемом 10% метанола с помощью зубочистки или другим подобным инструментом, пока паста не станет однородной. Дрожжи паста действует как внеклеточный криопротекторов и используется, чтобы заполнить пространство вокруг образца в носителе образца. Количество пасты зависит от количества образцов; для 10 образцов или меньше пасты (1 мл) могут быть смешаны в микроцентрифужных трубки.
3 высокого давления Замораживание образцов
- Удалить лист (или другой ткани) интерес со стороны завода и аккуратно поместить его на листке Дентал воск или другой режущей поверхности. С помощью штампа в 2,0 мм или желаемого размера, чтобы вырезать образец из листа. Ручка пробу осторожно с парой щипцов и работать как можно быстрее.
- Работая под микроскопом рассекает положите лист диска в 0,2 мм стороне Тип образец носителя и полностью покрывать в дрожжевой пастой. Убедитесь, что диск полностью заполнен и паста на одном уровне с краем держателя путем сглаживания пасты с тонкой кистью (Рисунок 2).
- Вставьте носитель в держатель образца. Обложка образца с Тип B образца носителя, плоской поверхности вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держатель образца должна быть сухой и при комнатной температуре. - Возьмите образец в держатель образца, вставить ее в машину и инициировать замерзания цикл, нажав на кнопку "JET AUTO", который должен завершить в секунду или две.
- Работа как можно быстрее, снимите держатель из машины и поместить кончик проведения SAMPле в жидкий азот в изолированный ящик на верхней части машины ФВЧ. Погрузить кончики двух пар щипцов в жидком азоте, чтобы охладить их.
ПРИМЕЧАНИЕ: После замораживания, носители должны быть обработаны только с жидкими щипцов азота охлаждением. Теплые (комнатная температура) щипцы часто являются причиной отказа в cryotechniques. - Откройте криопробирку содержащий СМИ FS, и поместите крышку на стороне коробки. С помощью пары жидких щипцов азота охлаждением, аккуратно извлеките диск из держателя образцов, гарантируя, что диск всегда находится в жидком азоте или парах. Работа в парах жидкого азота, удерживайте FS трубку с одним предварительно охлаждается пинцетом и использовать другой поместить держатель в FS флаконе. Винтовые крышки ФР флакон обратно. У не зажаты жидкого азота в ампуле.
ПРИМЕЧАНИЕ: При передаче образцов для криопробирки для QFS, обеспечению того, чтобы жидкий азот не попавшие в флаконах. Жидкий азот расширяется 700 раз во время потепления и любой Trappeг жидкого азота может привести к взрыву в течение этого времени. - Повторите шаги 3,1 до 3,7, пока все нужные Образцы замораживают. Несколько дисков листьев, содержащие один и тот же тип образца могут быть размещены в том же самом флаконе. Следует отметить, что держатель образца должен быть высушен и доводили до комнатной температуры замерзания между запусками. Чтобы сделать это быстро, нагреть его с феном, и контролировать его температуру на ощупь.
4 Подготовка к Замена замораживания
- Полностью погрузите Блок отопителя алюминия в жидком азоте в течение 10 мин или до пузырькового кипение не прекратится. В то время как это происходит, разместить слой сухого льда (1-2 см) в нижней части контейнера, используемого в качестве камеры FS (рисунок 3). Пенополистирола контейнер или ведро льда может быть использован для FS, вместе с измельченной сухой лед или гранул.
- Быстро вставить криопробирки содержащие образцы вместе с датчиком температуры в средних рядах блока нагревателя. Убедитесь, что крышки наФлаконы плотно привинчена так что FS СМИ не просачивается во FS. Начните запись температуры.
- Сделать датчик температуры, поместив термопары через верхнюю часть криопробирку таким образом, что она достигает дна трубки. Закрыть крышку трубки смолой так, чтобы жидкость не просачивается. Заполните трубку с 1,5 мл ацетона в начале каждого QFS перспективе.
- Использование изолированных cryogloves или большие щипцы, выльет жидкого азота от блока нагревателя. Будьте осторожны, не вылейте криопробирки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование СИЗ включая cryogloves и очки при работе с жидким азотом. - Поместите блок, содержащий флаконов на слой сухого льда в QFS камеры. Убедитесь, что блок размещен так, что трубы лежат горизонтально, а с небольшим наклона вверх. Там не должно быть никакой утечки, если используются правильные криопробирки.
- Упакуйте QFS камеру с сухим льдом, так что FS трубки покрыты, хотя это не является необходимым дляпокрыть верхнюю часть блока. Поместите крышку на камере.
5 Быстрый FS
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните QFS работать в вытяжном шкафу в том случае, если любая утечка OsO 4 непреднамеренно происходит несмотря на другие меры предосторожности.
- Поместите QFS камеру на платформе роторной качалке в вытяжной шкаф и вращаются на 125 оборотов в минуту в течение 120 мин. В течение этого времени температура блока следует постепенно увеличивать до примерно -80 ° С. Агитация обеспечивает смешивания компонентов для лучшего FS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение шейкере в вытяжной шкаф и положением капота двери дыма должна быть такой же на протяжении всей процедуры QFS и на каждые QFS работают для обеспечения последовательного потепление образцов. - Снимите сухой лед из камеры и продолжить встряхивания в течение еще одного часа.
Примечание: температура должна возрасти до примерно -15 ° С до -20 ° С. - Удалить образцы и датчик температуры от QFS камеры и разместить нашейкере при комнатной температуре в течение еще 10-15 мин, пока они не достигнут комнатной температуры. Остановка записи температуры.
- В FS, выключите аппарат HPF.
- Закройте кран резервуара с жидким азотом в то время как машина ФВЧ заполняется азотом.
- Нажмите кнопку «Азот».
- Подождите, пока красные "поршень вниз" легких гаснет.
- Нажмите "ON / OFF" кнопку.
- Нажмите кнопку "SYSTEM высохнуть".
- Прекратил подачу сжатого воздуха к машине.
- После как минимум 12 часов (для обеспечения сушки любой влажности), выключить машину, повернув главный выключатель с "1" на "0".
6 Сообщение FS Обработка
- Осторожно снимите FS СМИ с пластиковыми пипетками передачи и место в соответствующий контейнер для токсичных отходов.
ПРИМЕЧАНИЕ: OsO 4 и уранилацетатом опасные химические веществаи должны быть обработаны в вытяжной шкаф, а носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая закрытые носком обуви, халате и перчатках. - Wash образцы четыре раза 100% ацетона. Соберите первые два моет и поместите в токсического контейнер для отходов.
- Использование тонких щипцов, удалить образцы ткани из держателей. Держите образцы мокрый ацетоном, как это делается, и работать очень осторожно, чтобы не ломать образцы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это не является необычным, и это на самом деле может быть полезно иметь дрожжи пасты отпасть от образцов в этой точке. Дрожжи пасты обычно очень темно-коричневый, а ткань листа все еще зеленым. - Сбор образцов в криопробирки содержащих ацетон. Продолжайте пробоподготовки (инфильтрации и вложения) для ТЭМ в соответствии с обычными протоколами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты, представленные ниже, были получены с использованием Вольвенд Compact 02 для ФВЧ (Рисунок 1A). Одно из главных преимуществ этого инструмента является простота использования образцов носителей и их носителей. При использовании других инструментов, McDonald рекомендует два пользователя должны осуществлять подготовку образцов и ФВЧ, один приготовления образцов, а другой делает замораживание и трансфер в FS криопробирки 9. Тем не менее, Вольвенд образца носители и держатель достаточно легко для одного пользователя манипулировать независимо (рисунок 2А, B, E, F и G). Следует отметить, однако, что следует выполнить несколько пробных попыток, чтобы ознакомиться с инструментом ФВЧ перед работой с ценными образцами. Опытный пользователь должен быть в состоянии исправить несколько (10 или более) образцов в час. Тем не менее, принципы, представленные в данном протоколе могут быть использованы с любым из коммерчески доступных машин HPF.
Возможно,наиболее важной частью процедуры HPF-QFS является подготовка проб для загрузки в образце носителя (Рисунок 2C). Хотя это не может быть интуитивно, это шаг в протокол, по которому исследователь имеет максимальный контроль. ФВЧ машина надежная, и при правильном использовании и обслуживании должны производить ожидаемые изменения в давлении и температуре с небольшим изменением между образцами. Если образец плохо обработаны в процессе приготовления, то никакой другой шаг не будет выкупать ущерб так причинил. Растительные ткани довольно легко манипулировать во время этой стадии процесса, поскольку они не культивируют в среде и их клетки стены дают клеткам хорошую прочность. Тем не менее важно, что образцы обрабатываются быстро, чтобы избежать ультраструктурным изменения в результате удаления из исходного растения и ограничить стресс и ранив ответов. Самый маленький образец носитель, который может вместить образец должен использоваться для обеспечения эффективного и последовательного ФВЧ (рисЮр 2C). Наконец, перевозчик образец должен быть заполнен, но не переполнены (рисунок 2D). Заполненный образец носитель легко вставляется в машину ФВЧ для замораживания (Рисунок 2 H и I).
Первые шаги в протоколе QFS может быть сложным для новичка, поэтому рекомендуется, что два человека должны работать вместе, пока пользователи не знакомы с процедурой (3А-E). Следует проявлять осторожность при всех случаях при обращении с жидким азотом и фиксаторы тетроксид осмия и уранилацетатом. Типичная кривая изменения температуры во время QFS показан на рисунке 2J. Температурные быстро возрастает от -196 ° C, температуре жидкого азота, до примерно -80 ° С. Это при температуре около -78 ° С до -90 ° С, что замораживание замена как полагают, происходит 9. Один сложным шагом в протоколе QFS является удаление сухого льда через 2 часа FS. Вэтот шаг, неправильного обращения образцов может произвести всплеск температурах. Для этого блока нагревателя должны быть быстро поднимается из QFS камеры с помощью cryoglove и сухой лед быстро выливали в средней емкости.
ФВЧ была использована для исправления различных тканях растений Nicotiana benthamiana в том числе листьев Arabidopsis и листьев и эмбрионов. Это является сложной задачей, чтобы исправить образцы из зрелых листьев, благодаря большим центральной вакуоли большинства клеток. Младшие листья содержат меньшие вакуоли но трихомы обычно довольно плотно упакованы. Наличие трихомами может затруднить для упаковки образцов с дрожжевой пастой, но необходимо позаботиться, чтобы убедиться, что это правильно сделать, чтобы свести к минимуму количество воздуха, захваченного между поверхностью листа и пасты. Захваченный воздух будет препятствовать передачи тепла во время HPF и снизить качество фиксации. Это верно для любого образца.
После HPF и QFS образцы могут быть получены для VIЮинг под ТЕА путем пропитки и встраивания смолой. Тонкие секции 65-100 нм, то может быть получено путем секционирования. Типичные результаты приведены на рисунке 4. Показанные изображения все из образцов Arabidopsis листьев. Плазменные мембраны обычно гладкие и прижимается к клеточной стенке, признак хорошей фиксации (Рисунок 4A, С и Е). Другие органеллы в том числе хлоропласты (фиг.4А, D, F и Н) и тилакоидами (фиг.4В), митохондрий (Рисунок 4D и F), Гольджи (Рисунок 4 г), микротрубочки (Рисунок 4E) и рибосом (особенно фиг.4С) также отчетливо видны и большая центральные вакуоли остаются нетронутыми (4А). Неправильное обращение во результатов HPF-QFS в артефактов в том числе кристаллов льда-индуцированного повреждения (Рисунок 4D) и плазмолиза (Рисунок 4H). Ведущий осадок также может образовывать во окрашивания разделес (Рисунок 4F).
Рисунок 1: Вольвенд Компактный 02 высокого давления Морозильная камера () Вольвенд Компактный 02 HPF машина используется для cryofixation с прилагаемым компьютерного терминала.. Образцы вставляют в передней части машины (малого круга) для замораживания. Температурная кривая может генерироваться на экране компьютера для каждого запуска, по желанию пользователя. (B) Типичный температурную кривую давления для ФВЧ перспективе. Желтые и фиолетовые линии представляют температуру и давление, соответственно. Обратите внимание на крутые склоны обеих кривых. Высокое давление поддерживают в течение примерно 400 мс. Каждый интервал на оси абсцисс представляет 50 мс. Данные были собраны с EasyScopeII для программного обеспечения DSIM12. (C) изоляцией окно и крышка используется для хранения OF замороженные образцы сразу после замораживания можно удобно разместить на верхнем машине ФВЧ. Он заполнен жидким азотом. Круглые алюминиевые контейнеры держать криопробирки.
Рисунок 2: Подготовка образец ткани для ФВЧ. (A) Держатель образца для Compact 02 ФВЧ машины в его закрытом положении. (B) Держатель образца открыт. (C) лист образец в 0,2 мм лунку Тип образец носителя. Другая сторона этого носителя глубоко 0,1 мм. (D) Образец лист покрыт дрожжей пасты. Следует отметить, что носителем является полным, но не переполнены. (Е)-носитель образца в держателе образца. (F) Образец покрыта с носителем типа B. Этот носитель имеет одну плоскую поверхность и с другой стороны скважины, котораяглубоко 0,3 мм. Здесь плоская поверхность используется для сэндвич образец. (G), Держатель образца закрыта и готов к установке в машину HPF. (Н) отверстия на передней панели прибора HPF, в котором держатель образца будет вставлен для замораживания . (I), температура и давление зонда / держатель вставлен в машину HPF. (J) Типичная кривая температуры в течение QFS перспективе (данные, собранные с помощью программного обеспечения EASYLOG). Температура была записана в секунду. Всплеск в начале пробега обусловлено электроника зонда используется и не отражает реальную измерение температуры.
Рисунок 3:. Оборудование, используемое в QFS QFS можно проводить в любом изолированном контейнере, такие как коробка из пенопласта или ведерке со льдом (A) <./ Сильный> слой сухого льда 1-2 см в глубину охватывает нижнюю часть QFS камеры, здесь пенополистирол коробки. (B) нагреватель блок с 13 мм отверстия используется для образцов дома во QFS. Датчик температуры с цифровой регистратор данных находится в нагревательном блоке. (С) После охлаждения блока нагревателя в жидком азоте образцы помещают в блоке, жидкий азот выливали, а весь узел помещают в камеру QFS . с сухим льдом (D) QFS камера заполнена сухим льдом так, чтобы образцы покрытого; нет Недостатком охватывает весь нагревательного блока с сухим льдом. (Е) Коробка покрыта, а затем перемещается на ротационном шейкере в вытяжном шкафу, где образцы перемешиваемой в течение всей процедуры QFS.
Рисунок4:.. Arabidopsis листья подготовлен ФВЧ-QFS результаты, полученные для образцов, полученных ФВЧ-QFS и отображенных с помощью ПЭМ на Zeiss Libra 200 HT FE MC (A) средний высокий увеличения изображения, показывая хлоропласты (CH) с клеточными стенками и цитоплазма соседних клеток. В вакуоли (V) содержит электронно-плотного материала. Шкала бар = 0,5 мкм. (В) с большим увеличением изображение хлоропласта. Шкала бар = 100 нм. (C) высокого увеличенное изображение клеточной стенки между соседними клетками. Разветвленной plasmodesma видна (стрелка). Обратите внимание на гладкую мембрану плазмы прижатым к клеточной стенке в вакуоли. Цитоплазма плотно упакованы с рибосом. V является вакуоль. Тонопласт является гладкой и непрерывной. Шкала бар = 200 нм. (D) малом увеличении изображение, показывающее области хорошей фиксации в хлоропластов (CH) возле регионах повреждения льдом (звездочка). Шкала бар = 0,5 мкм. (Е) Высокий коэффициент увеличения клетки вальл и микротрубочки. Шкала бар = 100 нм. (F) Изображение показывает хорошую сохранность хлоропластов (CH) и митохондрий (М). Большой черный осадок от окрашивания срезов цитратом свинца. Шкала бар = 1 мкм. (G) Высокое увеличение вид Гольджи (GA). Шкала бар = 200 нм. (H) Плохо сохраняется образец, показывающий отсутствие деталей в хлоропласты и плазмолиза (черная стрелка). Шкала бар = 1 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Успех протокола, представленного здесь в большой степени зависит от пользователя. Во-первых, расширенный подготовка требуется для того, чтобы все необходимые материалы легко доступны и в достаточном количестве, чтобы завершить весь HPF-QFS пробег. Во-вторых, пользователь должен работать быстро, переход от стадии-к-шагом в эффективной манере, что сводит к минимуму обращение с пробами, таким образом минимизируя изменения в нативном состоянии ткани. После того, как образцы замораживаются и, прежде чем они обезвожены крайне важно, чтобы они держать в холоде, поэтому следует соблюдать осторожность, чтобы избежать обращения, которые могут непреднамеренно нагреть образец, например, обрабатывает рукой в перчатке, а не предварительно охлаждается щипцов. Скорость и повышения эффективности с знакомство с протоколом, так пробные пробеги рекомендуется, прежде чем пытаться исправить свои образцы интерес. В-третьих, пользователь должен постоянно помнить об опасности химических веществ, используемых в ФС среды, а также об опасностях работы с жидким азотом и сухим льдом. Вытяжной шкаф необходимо для подготовки среды FS и для процедуры QFS. Для всех других шагов, необходимых средств индивидуальной защиты, включая перчатки, плащи, закрытую обувь и очки рекомендуются.
Преимущества использования cryofixation вместо химических фиксаторов при комнатной температуре в течение подготовки образцов для ПЭМ, в том числе растения, давно известны 10. Одно исследование сравнения ультраструктуры корневых кончиков Nicotiana и арабидопсиса, установленных ФВЧ или химических фиксаторов установлено, что способ HPF-FS дал намного превосходят результаты 5. В ткани, подготовленного HPF-FS плазмалемме и другие клеточные мембраны были гладкими, плазмалемме был заподлицо с клеточной стенки, и, как правило органелл, включая микротрубочки были лучше, чем тогда, когда сохраняется образцы фиксировали с помощью обычных способов. Еще одно исследование клубеньках на корнях сои к выводу, что "Химическая фиксацию буферной глутаральдегидомне сохраняет ультраструктуры клубеньках корней сои в состоянии, которое позволяет корреляцию структуры и функции. "И он продолжает говорить, что только свободные альтернативы HPF-ФЗ 2. Плазмодесмы являются мембраносвязанные каналы, соединяющие клетки растений для их соседей, но чьи подструктуры трудно решить даже при ТЭМ. Cryofixation по ФВЧ или с пропан реактивного морозильник последующим FS был выбран более химическую фиксацию в исследованиях, направленных на выяснение тонких деталей структуры plasmodesmal 18. Несмотря на эти первые выводы, ПЭМ исследования условно-постоянных тканей по-прежнему нормой в науках растений. Это может быть связано с простым соблюдением традиционных методов или к, казалось бы, чрезмерно высокой стоимости HPF-FS оборудования в сочетании с длительным препаративной время для используемых в настоящее время ФС протоколов.
Порядок QFS является недавнее нововведение в ускорении подготовки образцов для ПЭМ 15. QFS былиспользоваться для получения всей C. Элеганс и Н. benthamiana оставляет после cryofixation 15. Это относительно толстые образцы должны быть установленные ФВЧ, и подготовка образцов Nicotiana по HPF-FS традиционно используется очень длинные FS раз 12, 13, 14. Для этого протокола мы использовали листья из модельного растения Arabidopsis. Обоснование длительного времени ФС для Nicotiana и других образцов растений является то, что обмен растворителей и воды, вероятно, будет снижена на крупных вакуолях клеток. Тем не менее, предполагается, что расстеклования хорошо замороженного образца должно привести к минимальным повреждением клеток (15 и ссылках. В ней). Если повреждение льда происходит это, скорее всего, вызвано самой замораживания, а не на QFS. Еще короче протокол для FS сообщалось 15. Это супер быстрый FS (SQFS) использует только 90 минут для FS. В этом протоколе, образцы в нагревательном блоке вращаются при 100 оборотах в минуту при отсутствии сухого Iв.п. без покрытия камеру SQFS. Это позволяет образцы до -80 ° C быстро. Затем образцы удаляют из нагревательного блока и дают нагреться до комнатной температуры на качалке. SQFS успешно используется для обезвоживания клеток, выращенных в культуре и Е. палочки клетки. Мы пока не пытались использовать SQFS с образцами растений за счет толщины ткани растения.
Протокол cryofixing а затем дегидратации образцы растений по тандемной ФВЧ и QFS представляет собой значительное улучшение по сравнению с нынешним протоколов. Время для подготовки проб перед смолы инфильтрации в настоящее время сводится до нескольких часов вместо нескольких дней. В дополнение к разработке метода QFS 15, McDonald также недавно опубликовала протоколы для быстрого проникновения растительных тканей смолой следующих SQFS без сухого льда 19. Растительные ткани, как правило, медленно проникли смолой на несколько долгих инкубации, в том числе на ночь. Эти новые протоперевалы привести к еще более короткое время обработки образца: 6 ч от замерзания до секционирования. Таким образом, в будущем, сочетание ФВЧ-QFS и быстрого проникновения должны заменить настоящие протоколы для подготовки завода-образца для ПЭМ. Кроме того, процедура QFS использует общий лабораторного оборудования, которое недороги и могут быть использованы для различных целей, хотя коммерческий комплект QFS в настоящее время доступна через электронную микроскопию наук (http://www.emsdiasum.com). Любой из этих вариантов представляет огромную экономию свыше стоимости покупки выделенный замораживания блок замещения, которые могут стоить более $ 50 000.
Следует отметить, что применение образцов, полученных с помощью ФВЧ и FS выходят за рамки рутинного анализа ПЭМ. Образцы, приготовленные таким образом, сохраняют свою антигенность и, следовательно, может быть использован в подходов на основе антител, в том числе immunogold маркировки 17, 19. Эти образцы также могут быть использованы для расширенных трехмерных структурных анализовчерез электротомографии 20. Образцы HPF-FS может использоваться даже с корреляционного света и EM 21, 22. Таким образом, дальнейшее улучшение в процедурах cryofixing а затем дегидратирующие образцы будут полезны для широкого круга исследователей, работающих в различных системах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Доброта и щедрость доктора Кента Макдональд из Калифорнийского университета в Беркли, получают высокую оценку. Мы благодарим анонимного рецензента за очень полезные советы. Лаборатория Burch-Смит поддерживается стартовые средства из Университета Теннесси.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine | Technotrade International, Inc | HPF02 | With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display of freezing parameters |
| Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers | Technotrade International, Inc | 290 | |
| Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A | Technotrade International, Inc | 241-200 | |
| Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B | Technotrade International, Inc | 242-200 | |
| Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20 | Chart | ||
| Baker's yeast | The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production | ||
| Tooth picks | |||
| Thermocouple data logger EL-USB-TC | OMEGA Engineering Inc. | OM-EL-USB-TC | Replacement battery purchased separately |
| Temperature probe | Electron Microscopy Sciences | 34505 | |
| Heater block 12/13 mm | |||
| Rotary shaker | Fisher Scientific | 11-402-10 | |
| Leaf punch - Harris Uni-core 2.00 | Ted-Pella Inc. | 15076 | |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
| Cryogenic vials 2 ml | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Methanol | |||
| Blow dryer | |||
| Dry ice | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Acetone | |||
| Forceps | Several pairs |
References
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).
- Studer, D., Hennecke, H., Muller, M. High-pressure freezing of soybean nodules leads to an improved preservation of ultrastructure. Planta. 188, 155-163 (1992).
- Bowers, B. aM. M. Ch 2. Artifacts in Biological Electron Microscopy. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. 2, Plenum Press. 13-42 (1988).
- Mollenhauer, H. H. Ch 3. Artifacts in Biological Electron Microscopy. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. , Plenum Press. 43-64 (1988).
- Kiss, J. Z., Giddings, T. H., Staehelin, L. A., Sack, F. D. Comparison of the ultrastructure of conventionally fixed and high pressure frozen/freeze substituted root tips of Nicotiana and Arabidopsis. Protoplasma. 157, 64-74 (1990).
- Moor, H. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer Verlag. 175-191 (1987).
- Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods in cell biology. 88, 151-164 (2008).
- Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure theory and practice. Journal of electron microscopy. 13, 165-174 (1989).
- McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods in molecular biology. 117, 77-97 (1999).
- Hippe-Sanwald, S. Impact of freeze substitution on biological electron microscopy. Microscopy research and technique. 24, 400-422 (1993).
- Kiss, J. Z., McDonald, K. Electron microscopy immunocytochemistry following cryofixation and freeze substitution. Methods in cell biology. 37, 311-341 (1993).
- Segui-Simarro, J. M., Austin 2nd, J. R., White, E. A., Staehelin, L. A. Electron tomographic analysis of somatic cell plate formation in meristematic cells of Arabidopsis preserved by high-pressure freezing. The Plant cell. 16, 836-856 (2004).
- Kobayashi, K., Otegui, M. S., Krishnakumar, S., Mindrinos, M., Zambryski, P. INCREASED SIZE EXCLUSION LIMIT encodes a putative DEVH box RNA helicase involved in plasmodesmata function during Arabidopsis embryogenesis. The Plant cell. 19, 1885-1897 (2007).
- Austin, J. R., 2nd,, Staehelin, L. A. Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography. Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).
- McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of microscopy. 243, 227-233 (2011).
- Taiz, L. The Plant Vacuole. The Journal of experimental biology. , 172-1113 (1992).
- Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature protocols. 7, 1716-1727 (2012).
- Ding, B., Turgeon, R., Parthasarathy, M. V. Substructure of freeze-substituted plasmodesmata. Protoplasma. 169, 28-41 (1992).
- McDonald, K. L. Rapid Embedding Methods into Epoxy and LR White Resins for Morphological and Immunological Analysis of Cryofixed Biological Specimens. Microscopy and microanalysis. 20, 152-163 (2014).
- McDonald, K. L., Auer, M. High-pressure freezing, cellular tomography, and structural cell biology. BioTechniques. 41, 137, 139-141 (2006).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PloS one. 5, e9014 (2010).
- McDonald, K. L. A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues. Journal of microscopy. 235, 273-281 (2009).
