Summary
Sammanhängande anti-Stokes Ramanspridning (CARS) mikroskopi kombineras med en inneboende genomströmnings upplösning setup för att släppa in situ och realtid visualisering av ytan av farmaceutiska tabletter genomgår upplösning. Med hjälp av den här specialbyggd installation, är det möjligt att korrelera BILAR filmer med drog upplösningsprofilema spelats in med inline UV-absorption spektroskopi.
Abstract
Traditionella farmaceutiska upplösningstester bestämma mängden av upplöst läkemedel över tiden genom att mäta halten läkemedel i upplösningsmediet. Denna metod ger lite direkt information om vad som händer på ytan av upplösande tabletten. Som tablettytan sammansättning och struktur kan förändras under upplösningen, är det viktigt att övervaka den under upplösningstestning. I detta arbete konsekvent anti-Stokes Ramanspridning mikroskopi används för att bilden på ytan av tabletterna under upplösning medan UV-absorption spektroskopi samtidigt ger inline analys av upplöst läkemedelskoncentration för tabletter som innehåller en 50% blandning av teofyllin vattenfri och etylcellulosa. Mätningarna visade att in situ-CARS mikroskopi kan avbildning selektivt teofyllin i närvaro av etylcellulosa. Dessutom teofyllin vattenfri omvandlas till teofyllin monohydrat under upplösning, med nål-formad ropStals växer på tablettytan under upplösningen. Omvandlingen av teofyllin anhydratet till monohydrat i kombination med minskad exponering av läkemedlet till det strömmande upplösningsmediet resulterade i minskade upplösningshastigheter. Våra resultat visar att in situ CARS mikroskopi kombinerat med inline UV-absorption spektroskopi kan övervaka läkemedelstablett upplösning och korrelera ytförändringar med förändringar i upplösningshastighet.
Introduction
Under utvecklingen av orala läkemedelsformer såsom tabletter och kapslar finns det en stark betoning på upplösningstester. Orala doseringsformer som krävs för att lösa upp innan de kan absorberas för terapeutisk effektivitet. Svårlösliga läkemedel i allmänhet har problem att nå en tillräcklig koncentration som gör testning av frisättnings särskilt viktig 1. Farmakopé upplösningsmetoder används oftast för upplösning analys. I de flesta fall kräver detta att framställa läkemedlet som en tablett eller kapsel, som sedan placeras i en bägare under rinnande upplösningsmedium. Den upplösta läkemedelskoncentrationen bestäms sedan genom att analysera prover av upplösningsmediet med användning av en standard-spektroskopiska teknik såsom UV-absorptionsspektroskopi 2. Dessa traditionella läkemedelsupplösningsmetoder ger inte någon direkt analys av provet eller förändringar som eventuellt förekommer på den upplösande ytan av doseringsformen.Direkt analys av provet under upplösningen kan ge mer information om upplösningsberedningsform och eventuellt identifiera problem som orsakar upplösningstest misslyckande.
Direkt analys av upplösning av doseringsformer erfordrar användning av in situ-analystekniker, vilka är i stånd att övervaka upplösningsprocessen. För att spela in situ under upplösnings analysmetoden inte måste påverkas av närvaron av upplösningsmediet och den teknik som behöver en hög tidsupplösning för att på ett tillförlitligt sätt mäta förändringar i den upplösande doseringsform av storleksordningen sekunder. Dämpad totalreflektion UV-spektroskopi har visat sig vara lämplig för att mäta förändringar under upplösningen men saknar rumsliga upplösningen som tillhandahålls av avbildningstekniker 3. Traditionella läkemedelsavbildningstekniker, såsom svepelektronmikroskop (SEM), och spontana Raman kartläggning har båda begränsande faktorer som hindrar deras användning isitu för upplösning.
SEM-avbildning är en högupplösande snabb avbildningsteknik kan avbildning av ytan av farmaceutiska doseringsformer. Emellertid är SEM-avbildning i allmänhet utförs under vakuumförhållanden och kräver provet beläggning vilket gör det olämpligt för in situ-upplösning avbildning. Fiber-coupled spontan Raman-spektroskopi i kombination med en genomflödescell och UV genomströmnings absorptionsspektroskopi, har utförts för att övervaka olika drogsystem in situ under upplösningen, inklusive teofyllin 4, karbamazepin och indometacin 5. Raman-spektroskopi kunde identifiera ytförändringar inträffar under upplösning, men det gav ingen geografisk information om var de förändringar ytan var inträffar. Spontan Raman kartläggning använder Raman spektra och tillhandahåller geografisk information om ytan av provet utan avbildning tar i storleksordningen minuter till timmar beroende på bildytan, vilket gördet olämpligt för in situ upplösning avbildning.
Sammanhängande anti-Stokes Ramanspridning (CARS) mikroskopi är en snabb bildteknik och kombinerat med inline UV-absorption spektroskopi har det möjligt för oss att utveckla en teknik som kan in situ upplösningsanalys. CARS mikroskopi ger snabb kemiskt selektiv avbildning som inte påverkas av närvaron av upplösningsmediet gör det till en lämplig teknik för att in situ-upplösningsanalys. BILAR tekniker är grovt delas in i två grupper baserat på pulslängd på lasrarna; en är smalbandiga BILAR (pikosekund pulsade lasrar), och den andra är bredbands BILAR (femtosecond pulsad laser). En typisk CARS mikroskop system består av två pulsade laserkällor och ett inverterat mikroskop. För att producera en CARS signal, en av de pulsade lasrar behöver vara avstämbar så det finns en frekvensskillnad mellan de två lasrar, som matchar ett Raman vibrationer. Dessutomde två lasrar som krävs för att överlappa varandra i rymden (rumslig) och tid (tidsmässig), varvid pulserna från båda lasrarna som anländer till samma område av provet på samma gång. Eftersom Raman vibrationer är kemiskt specifika och CARS signalen genereras endast i bränn volymen av mikroskopet, är CARS mikroskopi kan kemiskt selektiv avbildning med en upplösning ner till diffraktionsgränsen.
Smalbandiga CARS mikroskopi med en enda Raman vibrationsläget kan ca 100x snabbare bildbehandling jämfört med spontana Raman stående förfaranden 6. Bredbands CARS mikroskopi bilder över ett bredare spektralområdet (600-3,200 cm -1 vs ~ 4 cm -1), men har en lägre spektral upplösning (ca 10 cm -1 vs ~ 4 cm-1) och långsammare utskriftshastighet (50 msek / pixel vs ~ 5 ^ sek / pixel) jämfört med smal CARS mikroskopi 7.
Smalbandiga CARS mikroskopi har använts för att avbilda drug frigivning från vissa läkemedelssystem. Inom området för farmaceutiska formuleringar, Kang et al. 8-10 avbildade läkemedelsfyllda polymerfilmer. Initialt de avbildade fördelningen av laddade läkemedel, vilket följdes av avbildning av läkemedelsfrisättning från en statisk upplösningsmedium. Jurna et al. 11 och Windbergs et al. 12 gick ett steg längre och avbildas för det första teofyllin fördelningen i lipid doseringsformer följt av avbildning drogen upplösning med hjälp av en dynamisk upplösningsmedium.
Vi har utvecklat en ny analysmetod för att samtidigt övervaka förändringar yta på tabletten som genomgår upplösning med smal CARS mikroskopi medan du spelar in det upplösta läkemedelskoncentrationen med UV-absorption spektroskopi. Vi illustrerar användandet av denna metod som avbildar tabletter som innehåller modellen drog teofyllin i kombination med etylcellulosa genomgår upplösning med vatten som upplösningsmedium.
Protocol
Figur 1. Schematisk illustrerar CARS mikroskop setup med den inneboende flödet genom upplösning inställningar. Siffran har modifierats Fussell et al 13.
1. System Startup
- Slå på 20 ps pulsade 1064 nm BILAR laser och låta lasern att värmas upp (ca 1,5 tim).
- Slå på deuteriumlampa UV-ljuskälla och låt den värmas upp (ca. 10 min).
- Öppna slutaren på deuteriumlampan UV-ljuskällan genom att ställa in slutar omkopplaren på "öppna".
- Slå på mikroskopkontroll PC och öppna mikroskop styrprogram.
- Slå på UV-spektrometer PC och öppna spektrometern styrprogram.
2. Mimikroskopet Setup
- Välj önskad mikroskop målet. Använd en 20X/0.5 NA mål att uppnå de resultat som presenteras i detta arbete.
- Ställ in filtren i filter set torn för att överföra excitation lasrar och återspeglar CARS signalen. Välj ett 775 nm långpass dikroisk spegel och ett 650 nm bandpass-40 nm-filter för att replikera de resultat som visas i detta arbete.
- Placera lämpliga filter framför fotomultiplikatorröret (PMT) detektor som sänder CARS signalen och filtrera oönskat ljus. Filtrera det ljus med en 750 nm kortpass-filter och en 650 nm bandpass-40 nm-filter för att återge de experiment som utförts i detta arbete.
3. System Testing
- Slå på den peristaltiska pumpen och pumpupplösningsmedium under några minuter genom den Z-formade UV-flödescellen för att rensa föregående vätskan ur rörsystemet.
- Bestämma flödeshastigheten hos pumpen genom att väga mängden av upplösningsmedium pumpas i 2 min. Justera pumphastigheten until önskade flödeshastigheten har uppnåtts. Pump upplösningsmediet vid en flödeshastighet av 5 ml / min för att uppnå de resultat som redovisas i detta arbete.
4. UV Upplösning Mätning
- I UV-spektrometer styrprogram, klicka på menyn "Arkiv" och sedan på "Ny absorbansmätning" för att öppna ett fönster som listar alla tillgängliga spektrometrar.
- Klicka på rätt UV-spektrometer, och klicka sedan på "Nästa" för att öppna ett fönster som visar datainsamlingsparametrarna.
- Definiera både integrationstiden och den spektrala medelvärdesbildning. Välj en integrationstid på 150 msek med 200 genomsnitt att replikera de resultat som visas i detta arbete.
- Klicka på knappen "Next" för att få upp på skärmen som används för att spela in referensspektrum.
- Klicka på den knapp som visas som en gul glödlampa för att spela in ett referensspektrum. Pumpupplösningsmedium kontinuerligt under denna mätning.
- Stäng luckan på deuteriumlampan UV-ljuskällan genom att ställa strömbrytaren till "stängd".
- Klicka på knappen "Next" för att få upp på skärmen som används för att spela in den mörka spektrumet.
- Klicka på den knapp som visas som en grå lampa för att spela in en mörk spektrum. Pumpupplösningsmedium kontinuerligt under denna mätning.
- Klicka på knappen som säger "Avsluta" för att påbörja de absorbansmätningar UV.
5. CARS Upplösning video
- I CARS mikroskop styrprogram, klicka på knappen som väljer en "XYT" mätning.
- Klicka på listrutan och välj bildstorlek i pixlar. Välj en bildstorlek på 512 x 512 pixlar för att återge de bilder som redovisas i detta arbete.
- Dra reglaget för utskriftshastighet på antingen "snabb", "medium" eller "långsam" läge. Använd den snabba scanningshastighet (1,12 sek per bild) för att uppnåde resultat som visas i detta arbete.
- Klicka på pilarna märkta "Zoom" för att justera zoomnivån. Välj "2x" zoom att replikera nivån zoom och synfält (350 x 350 mikrometer) som används för dessa resultat.
- Klicka på listrutan och välj objektiv används.
- Klicka på inmatningsrutan och ange antalet bildrutor som krävs för CARS upplösning video (beroende på längd experiment). Genomföra upplösning i ca 15 minuter genom att spela in 900 bilder för att reproducera de resultat som visas i detta arbete.
6. BILAR Wavelength Tuning
- Använda optisk parametrisk oscillator (OPO) ansvarige justera inställningarna för OPO såsom temperatur, piezo position och Lyot filter position tills maximal laser effekt vid önskad Raman frekvensen uppnås. Trimma OPO till 2960 cm-1 för att spela in samma resultat som de som presenteras i denna artikel.
7. The Dissolution Experiment
- Placera en tablett i provhållare av specialbyggda BILAR flödescell, skruva provhållaren stängd ordentligt för att förhindra läckage.
- Fäst rören till CARS flödescell ansluter CARS flödescell i den bägare som innehåller upplösningsmediet och den peristaltiska pumpen.
- Placera CARS flödescell som innehåller en tablett på mikroskop scenen.
- Kontrollera att CARS flödescell är kopplad till upplösningsmediet bägare, den peristaltiska pumpen, den Z-formade UV-flödescellen och avfallsuppsamlingsbägare.
- Klicka på "XY repeat" knappen för att börja skanna mikroskopsystemet i en kontinuerlig avsökning.
- Justera mikroskopets fokus genom att flytta målet till dess att ytan av tabletten är i synfältet på mikroskop kontroll datorskärm.
- Klicka på skjutreglaget i mikroskop styrprogram märkt "PMT". Justera detektorkänsligheten genom att öka / minska PMT spänning framen tillfredsställande bild (varken för mörk eller mättad) syns på skärmen. OBS: Se till att inte överbelasta PMT med hög spänning. För detta arbete har vi använt en PMT spänning runt 600 V, men detta kan variera beroende på PMT används.
- Klicka på "Stop" i mikroskop styrprogram för att stoppa den kontinuerliga skanningen.
- Samtidigt (eller så nära varandra som möjligt) börja pumpa upplösningsmedium, börja spela in ett enda XYT scan, och börja samla UV-absorbans-spektra.
- Under upplösningsexperiment, övervaka videoinspelning och manuellt justera mikroskopet fokus att se till att tabletten är ständigt i fokus.
8. Inlägg Upplösning
- Stoppa den peristaltiska pumpen genom att stänga av den.
- Klicka på menyn "Arkiv" och sedan på "Spara som video" på mikroskopet styrprogram för att spara XYT scan som en video.
- Klicka på menyn "Arkiv" och klicka sedan på "Spara "och sedan på" Stop Exportera "på spektrometern styrprogram för att stoppa insamling av UV-absorption spektra.
- Ta CARS flödescell från mikroskop scenen och ta tabletten från flödescellen BILAR.
- Tvätta CARS flödescell med hjälp av vatten och etanol, och sedan torka med hjälp av silkespapper.
Representative Results
In situ-upplösningsanalys med användning av CARS mikroskopi utfördes på tabletter (12 mm i diameter, med plan yta) innehållande en 50:50 blandning av modelläkemedlet teofyllin anhydrat och etylcellulosa med destillerat vatten pumpades vid 5 ml / min som upplösningsmedium. BILAR bilder (512 x 512 pixlar) uppsamlades varje 1,12 sek vid Raman-vibrationsfrekvens 2960 cm -1, som är selektiv för innehållet teofyllin i tabletten för varaktigheten av upplösnings experiment. Figur 2 visar valda ramar efter upplösningen video. Vid början av upplösning (figur 2, tid 0 sek) finns det områden av grönt som visar innehållet i tabletten teofyllin och det finns också mörka områden där det bara etylcellulosa närvarande på ytan av tabletten. I de mörka områden på ytan av tabletten kan man svagt se innehåll i etylcellulosa. Detta beror på att det har rapporterats att etyl-celluloSE har Raman vibrations med maxima runt 2930 och 2975 cm-1 14. Efter ca 60 sek verkar det vara början på teofyllin monohydrat kristalltillväxt på ytan, som kan ses som smala nålformade kristaller växer utåt från minst en kristall kärna i mitten av bilden (Figur 2, tid 60 sek) . Den monohydrat kristalltillväxt kan vara mycket mer tydligt efter 130 sek (Figur 2, tid 130 sek). Dessutom vid tidpunkt 130 sekunder kan det ses att monohydratet kristallen inte har spridit sig helt tvärs över ytan av tabletten. Det verkar som om närvaron av etyl cellulosa regionerna har fysiskt blockerat förlängning av monohydrat nålar. Efter 250 sekunder, kan det ses att monohydratet täckning av ytan är inte så framträdande som föreslår att de monohydrat kristallerna själva börjar att upplösas.
Figur 2. Ramar från CARS upplösning video. Valda bilar Bilder (2960 cm -1) från en upplösning video för en teofyllin vattenfri med etylcellulosa tablett. Den 0 sek bilden spelas in på ett område av provet medan 60, 130, och 250 sek bilder spelas in med en annan del av provet. Den CARS video finns som kompletterande information. Scale bar är 50 | im.
Ultraviolett (UV)-spektroskopi är en form av absorptions-spektroskopi med användning av UV-ljus som exciteringskälla. UV-spektroskopi åtgärder elektronövergångar från grundtillståndet till ett exciterat tillstånd 15. Teofyllin har en bred topp centrerad kring 270 nm medan etylcellulosa är praktiskt taget olösligt i upplösningsmediet så inte förväntas bidra till UV-spektrumet registreras. Analys av Dissolution medium med användning av den infogade z-formade UV-flödescellen ger oss möjlighet att kvantitativt bestämma mängden läkemedel löses under upplösningen. Figur 3 visar UV-upplösningsprofilen för upplösningen av teofyllin anhydratet med etylcellulosa tablett. UV upplösningsprofilen (Figur 3) visar att upplösningen av teofyllin vattenfri börjar snabbt nå en maximal koncentration av cirka 90 mikrogram / ml inom 120 sek; efter denna tid led upplösningshastigheten börjar att minska. Minskningen i upplösningshastighet kan bero på närvaron av teofyllin-monohydrat (löslighet 6 mg / ml vid 25 ° C 16) kristaller på ytan som är mindre lösliga än teofyllin anhydrat (löslighet 12 mg / ml vid 25 ° C 16 ) och tydligt i CARS upplösnings video (figur 2) vid denna tidpunkt. Den gradvis minska upplösningshastigheten kan också delvis förklaras bya minskning teofyllin exponering för det strömmande mediet. Denna minskning beror på etylcellulosa är praktiskt taget olöslig i vatten, så som den teofyllin löses den återstående etylcellulosa hinders teofyllin exponering för upplösningsmediet.
Figur 3. UV upplösningsprofil. Koncentration mot tid tomt för en teofyllin vattenfri kombinerat med etylcellulosa tablett som visar koncentrationen av teofyllin i upplösningsmediet under upplösningen experimentet.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
AF stöds av det nederländska Technology Foundation STW, vilket är den tillämpade vetenskapen uppdelningen av NWO, och Teknikprogrammet i ekonomiministeriet. (STW OTP 11114).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paladin 1,064 nm laser | Coherent | Prototype model not for sale | |
| Levante Emerald Optical parametric oscillator | APE Berlin | ||
| IX71 Microscope | Olympus | ||
| Fluoview 300 scanning unit | Olympus | ||
| Photomultiplier tube R3896 | Hamamatsu | ||
| Free standing optics / filters | Thorlabs and Chroma | ||
| Reglo peristaltic pump | ISMATEC | ||
| USB2000+ spectrometer | Ocean Optics | ||
| DT-MINI-2-GS light source | Ocean Optics | ||
| FIA-Z-SMA-TEF Z shaped flow cell | Ocean Optics | ||
| QP400-2-SR-BX optical fiber | Ocean Optics | ||
| Plastic piping | ISMATEC | ||
| CARS dissolution tablet flow cell | Homebuilt at university - designed to hold 12 mm diameter, 3 mm thick tablets. The flowcell has a channel depth of around 0.5 mm. | ||
| Glass beakers | VWR | D108980 | |
| Theophylline anhydrate | BASF | 30058079 | |
| Ethyl cellulose | Colorcon |
References
- Ku, M. Use of the Biopharmaceutical Classification System in Early Drug Development. The AAPS Journal. 10, 208-212 (2008).
- The United States Pharmacopeia. United States Pharmacopeial Convention 32nd ed. , Rockville, MD. 1-8 (2009).
- Florence, A. J., Johnston, A. Applications of ATR UV/vis spectroscopy in physical form characterisation of pharmaceuticals. Spectrosc. Eur. 4, John Wiley & Sons Ltd. (2004).
- Aaltonen, J., et al. In situ measurement of solvent-mediated phase transformations during dissolution testing. J. Pharm. Sci. 95, 2730-2737 (2006).
- Savolainen, M., et al. Better understanding of dissolution behaviour of amorphous drugs by in situ solid-state analysis using Raman spectroscopy. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71, 71-79 (2009).
- Slipchenko, M. N., et al. Vibrational imaging of tablets by epi-detected stimulated Raman scattering microscopy. Analyst. 135, 2613-2619 (2010).
- Parekh, S. H., Lee, Y. J., Aamer, K. A., Cicerone, M. T. Label-Free Cellular Imaging by Broadband Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy. Biophys. J. 99, 2695-2704 (2010).
- Kang, E., et al. In Situ Visualization of Paclitaxel Distribution and Release by Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy. Anal. Chem. 78, 8036-8043 (2006).
- Kang, E., Robinson, J., Park, K., Cheng, J. -X. Paclitaxel distribution in poly(ethylene glycol)/poly(lactide-co-glycolic acid) blends and its release visualized by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. J. Controlled Release. 122, 261-268 (2007).
- Kang, E., et al. Application of coherent anti-stokes Raman scattering microscopy to image the changes in a paclitaxel-poly(styrene-b-isobutylene-b-styrene) matrix pre- and post-drug elution. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87A, 913-920 (2008).
- Jurna, M., et al. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy to monitor drug dissolution in different oral pharmaceutical tablets. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2, 37-43 (2009).
- Windbergs, M., et al. Chemical Imaging of Oral Solid Dosage Forms and Changes upon Dissolution Using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy. Anal. Chem. 81, 2085-2091 (2009).
- Fussell, A., Garbacik, E., Offerhaus, H., Kleinebudde, P., Strachan, C. In situ dissolution analysis using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) and hyperspectral CARS microscopy. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85, 1141-1147 (2013).
- Lua, Y. -Y., Cao, X., Rohrs, B. R., Aldrich, D. S. Surface Characterizations of Spin-Coated Films of Ethylcellulose and Hydroxypropyl Methylcellulose Blends. Langmuir. 23, 4286-4292 (2007).
- Skoog,, Holler, F. J., Crouch, S. R. Principles of Instrument analysis. 6 ed. , Thomson Brooks/Cole. (2007).
- Rodríguez-Hornedo, N., Lechuga-Ballesteros, D., Hsiu-Jean, W. Phase transition and heterogeneous/epitaxial nucleation of hydrated and anhydrous theophylline crystals. Int. J. Pharm. 85, 149-162 (1992).
