Summary
Richtlinien für die Erzeugung von Killer künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert, KaAPC, ein leistungsfähiges Werkzeug für In-vitro-Abbau von humanen Antigen-spezifische T-Zellen und eine alternative Lösung, um zelluläre Immuntherapie für die Behandlung von T-Zell-vermittelten Autoimmunkrankheiten in einem Antigen- spezifisch, ohne die restlichen Immunsystem.
Abstract
Strom Behandlung von T-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankungen beruht hauptsächlich auf Strategien der globalen Immunsuppression, die auf lange Sicht ist von nachteiligen Nebenwirkungen begleitet, wie einer reduzierten Fähigkeit, Infektionen oder malignen Erkrankungen zu steuern. Daher müssen neue Ansätze entwickelt werden, die nur die Krankheit zu vermitteln Zielzellen und lassen die restlichen Immunsystem intakt ist. Im letzten Jahrzehnt eine Vielzahl von zellbasierten Immuntherapie Strategien moduliert T-Zell-vermittelten Immunantworten sind entwickelt worden. Die meisten dieser Ansätze beruhen auf Toleranz induzierende Antigen-präsentierenden Zellen (APC). Jedoch, zusätzlich zu technisch schwierig und mühsam, eine solche zellbasierte Ansätze sind sehr empfindlich gegenüber zytotoxischen T-Zell-Antworten, die ihre therapeutische Kapazität begrenzt. Hier stellen wir ein Protokoll für die Erzeugung von nicht-zellulären Killer künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen (KaAPC), die für den Abbau von pathologischen T-Zellen ermöglicht, während die WiederRest Immunsystem unberührt und funktional. KaAPC ist eine alternative Lösung, um zelluläre Immuntherapie, Potenzial zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen und Transplantatabstoßungen durch Regulierung unerwünschten T-Zell-Antworten in einem Antigen-spezifischen Weise aufweist.
Introduction
In den letzten zwei Jahrzehnten große Fortschritte im Verständnis der pathogenen Mechanismen von Autoimmunerkrankungen gemacht. Allerdings sind die häufigsten Behandlungen verlassen sich immer noch auf Kortikosteroide sowie Immunsuppressiva wie Purinanaloga, Alkylierungsmittel und Calcineurin-Inhibitoren 1. Die Verwendung solcher Arzneimittel hat sehr die Prognose der Patienten verbessert, aber die Behandlung nicht eine Heilung des Basis immunologischen Fehlfunktionen bereitzustellen. Außerdem Patienten anfällig für Infektionen und zur Entwicklung von Krebs.
Daher das ultimative Ziel für die Behandlung von T-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankungen und Transplantatabstoßung ist, gezielt nur Krankheit, die T-Zellen, während zur gleichen Zeit, so dass die restlichen Immunsystem unberührt und kompetent immunologischen Erkrankungen zu kämpfen. Verwendung Antigen-präsentierenden Zellen (APC) als eine Behandlung, um die Zellreaktionen zu unterdrücken peripheren T wurde bereits beschriebenden 1970er Jahren von mehreren Gruppen. Seitdem sind viele zellbasierte Ansätze entwickelt worden (in Schütz et al. 2 reviewed). Strategien durch FasL-exprimierenden Killer-APC als immunregulatorische Zellen zeigten vielversprechende Ergebnisse zeigt therapeutisches Potential für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Transplantatabstoßung und chronischen Infektionen. Es gibt jedoch signifikante Einschränkungen Strategien Verwendung FasL-Killer-APC, die letztlich begrenzt haben ihre klinische Anwendbarkeit; (I) Erzeugung und Isolierung von APC ist Zeit, Arbeit und kostenintensiv (ii) Patienten Zytopenie aufgrund der Immunsuppression eine begrenzte Menge und Qualität von Zellen (iii) Beschichtung oder Transduktion von APC mit Apoptose induzierende Signale wie FasL führt zu hoch variable Phänotypen und (iv)-Killer-APC zu Effektorfunktionen von T-Zellen zu reduzieren folglich ihr therapeutisches Potential zytotoxisch empfindlich. Daher ist es schwierig, eine definierte reproduzierbare-Killer-Phänotyp APC garantierenTyp, der für Antigen-spezifische Modulation der T-Zell-Antworten in vivo verwendet werden können.
Aufgrund unserer bisherigen Arbeit mit FasL exprimieren Killer APC 3-5 und künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen (AAPC) 6,7 wir eine Wulst-basierten Ansatz (KaAPC) Antigen-spezifische Hemmung oder Beseitigung von autoreaktiven T-Zellen in den entwickelten vitro. KaAPC aus einem HLA-A2-Ig-Dimer (Signal 1) und einem Anti-Fas-mAb (Apoptose-induzierende Signal), die kovalent an eine Oberfläche eines 4,5 um paramagnetische Latexkügelchen immobilisiert. Sie führen Antigen-spezifischen T-Zellen in einem Fas / FasL-vermittelten Weise von T-Zellkulturen von mehreren Spezifitäten in einer Antigen-spezifischen Art und Weise und unabhängig von der Aktivierung induzierten Zelltod (AICD) Weg. Dosis-abhängigen Apoptose in T-Zellen gezielt schnell bereits nach 30 min 8 induziert.
KaAPC kann leicht in einer kontrollierten Art und Weise erzeugt werden Sicherstellung eines aus dem Regal phenot definiertyp und die meisten der Mängel der zellbasierten Strategien Erschöpfung zu überwinden. Folglich KaAPC anzuzeigen großes Potenzial für die Behandlung von T-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankungen und Transplantatabstoßung, die Förderung auf dem Gebiet der T-Zell-spezifische Behandlungsstrategien.
Protocol
1. Erzeugung von HLA-A2-Ig-Based KaAPC
- Bereiten Sie sterile Boratpuffer. Machen Sie eine 0,1 M Lösung von Borsäure in Wasser und den pH-Wert auf 7,0. Sterilfilter (0,22 um) zu puffern und bei 4 ° C.
- Bereiten Sie sterile Wulst Waschpuffer. Verwenden phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ohne Magnesium und Calcium. Hinzufügen humanem AB-Serum für 3% Endkonzentration. Hinzufügen Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) 2 mM Endkonzentration. Natriumazid (NaN 3) für 0,01% Endkonzentration. Sterilfilter (0,22 um) zu puffern und bei 4 ° C.
- Transfer 250 ul Epoxy-Perlen (ca. 100 x 10 6 Perlen) ab Lager in einen sterilen, mit Schraubverschluss-Glasfläschchen.
- Fügen Sie 250 ul Boratpuffer.
- Setzen Glasfläschchen auf einem Magneten und lassen Perlen für 2 min zu halten; absaugen Puffer und entfernen Glasfläschchen von Magneten.
- Einmal zu waschen Perlen mit 1 ml Boratpuffer.
- Resuspendieren Perlen in 550 ul von 0,018 ug/ Ml HLA-A2-Ig und 3,64 g / ml anti-CD95 mAb Mensch (Klon CH11) und vorsichtig durch Schütteln. (Siehe Diskussion Abschnitt für weitere Informationen.)
- Inkubieren Glasfläschchen auf einem Rotator über Kopf, bei 4 ° C für 24 Stunden.
- Spin-Down-Perlen bei 300 g für 2 min.
- Zeigen Glasfläschchen auf einem Magneten für 2 min und saugen Sie den "KaAPC Beladungslösung"; entfernen Glasfläschchen von Magneten, 1 ml Waschpuffer Wulst und sorgfältig resuspendieren durch Schütteln.
- Wiederholen Sie Schritt 1.10 zweimal.
- Inkubieren Glasfläschchen auf einem Rotator bei 4 ° C für 24 h in 1 ml Waschpuffer Wulst. An diesem Punkt werden alle restlichen Proteinbindungsstellen von humanem AB-Serum in dem Wulst Waschpuffer enthielt blockiert werden.
- Spin-Down-Perlen bei 300 g für 2 min.
- Ort Glasfläschchen auf einem Magneten für 2 min und saugen Wulst Waschpuffer; entfernen Glasfläschchen aus Magnet und ersetzen Lösung mit 1 ml PBS.
2. Qualitätskontrolle, die Peptid-Beladung, WVeraschung, Lagerung und Stabilität von KaAPC
- Übertragen 1,5 x 10 5 KaAPC in ein FACS-Röhrchen und wäscht mit 1 ml FACS-Waschpuffer.
- Resuspendieren Perlen in 100 ul FACS-Waschpuffer und mit 1 ul Anti-Maus-IgG1-PE (zum Nachweis der Fc-Teil des HLA-A2-Ig) und 1 ul Anti-Maus-IgM-FITC (Klon R6-60.2 zum Nachweis der Anti-Human-CD95 mAb).
- Die Proben für 15 min bei 4 ° C, waschen mit 1 ml FACS-Waschpuffer und Resuspension in 250 ul FACS Waschpuffer und lesen Färbung mittels Durchflusszytometrie.
Abbildung 1. QC Fleck eines KaAPC Batch gemacht, wie in der Protokollabschnitt angegeben. Färbung wurde wie in Protokoll Abschnitt beschrieben durchgeführt 2. HLA-A2-Ig wurde mit einem Anti-Maus-IgG1 PE mAb detektiert, während anti-human-CD95 (Anti-Fas) wurde mit einem Anti-Maus-IgM-FITC mAb erkannt (siehe Protokoll SEction 2.2) (blaue Linie). Gefüllt schwarz Graphen stellen leer Perlen mit Anti-Maus-IgG1 PE mAb oder Anti-Maus-IgM-FITC mAb bzw. gefärbt. Die Zahlen in der oberen rechten Ecke geben den mittleren Fluoreszenzintensität (MFI). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Für Peptidbeladung Transfer 20 x 10 6 KaAPC in eine neue sterile Glasflasche, auf einem Magneten Platz für 2 min, PBS absaugen und resuspendieren Perlen in 500 ul frischem PBS mit 5 ug Peptid (Denken Sie daran, wird nur HLA-A2-restringierte Peptide auf das Dimer binden!).
- Speicher geladen KaAPC bei 4 ° C bis zur Verwendung, für mindestens 3 Tage, um eine ausreichende Peptidbeladung auf HLA-A2-Ig-Dimer zu ermöglichen.
- Unmittelbar vor der Verwendung, waschen Sie die Peptid beladen KaAPC wie in 1.14 angegeben; wiederholen Sie diesen Schritt mindestens 6x.
Hinweis: Dies ist ein entscheidender Schritt, um sicherzustellen, dass freie Peptid to vollständig entfernt werden, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden Tötung; restliche freie Peptid wurde gezeigt, dass Apoptose in Antigen-spezifischen T-Zell-Kulturen 9 induzieren. Um auszuschließen, die eine lösliche Peptid-Effekt, führen Überstand Kontrollproben von Peptid beladen und gewaschen KaAPC (siehe 3.8). - Graf Perlen mit Zählkammer und beschriften mit Datum, Name des Peptids und Konzentration.
ANMERKUNG: geladenen KaAPC funktionsfähig bleiben bei 4 ° C für mindestens einen Monat. Nach einem Monat Nachladen mit dem gleichen Peptid ermöglicht KaAPC für bis zu einem Jahr verwendet werden.
3. KaAPC In-vitro-Assay Töten
- Bereiten Co-Kultur-Medien. Vorbereitung vollständigem RPMI-Medium mit 3% T-Zellwachstumsfaktor und 3% Spender autologem Plasma (im Labor hergestellt 6) ergänzt wird. Wenn Geber autologem Plasma nicht verfügbar ist, verwenden hitzeinaktiviertem humanem AB-Serum.
- Bereiten AnnexinV Bindungspuffer Vorbereitung. Man löst 8,12 g Natriumchlorid (NaCl) und 0,12 g calcium Chlorid (CaCl 2) in 990 ml ddH 2 O.Add 10 ml 1 M HEPES-Puffer.
- Erzeugen einer humanen Antigen-spezifischen T-Zellen. (Für eine ausführliche Protokoll finden Sie in einer früheren Veröffentlichung 7 Verwendung künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen (AAPC)). Sicherzustellen, dass Peptidspezifität mindestens> 75%, wie durch Tetramer-Färbung bestimmt.
- Für jede Probe inkubieren 2 × 10 5 Antigen-spezifische T-Zellen / Vertiefung (in einer 96-Well-Rundbodenplatte) in 200 ul Co-Kulturmedium in einem Verhältnis 1: 1 mit KaAPC für 48 Stunden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Ernteproben und Transfer in einem FACS-Röhrchen; waschen mit 1 ml Bindungspuffer AnnexinV, drehen bei 300 g für 5 min nach unten, Überstand verwerfen und resuspendieren in 100 ul AnnexinV Bindungspuffer
- Fleck Proben mit 1 ul AnnexinV FITC und 5 ul 7-AAD für 10-15 min bei RT, wäscht mit 1 ml Bindungspuffer AnnexinV; Spin-Down bei 300 g für 5 min, Überstand verwerfen eind Resuspendieren in 250 ul Bindungspuffer Annexin
- Lesen Proben sofort auf Durchflusszytometer.
- Bereiten Sie die folgenden Proben auf Antigen-spezifische Abtötung durch KaAPC bestimmen: nur T-Zellen; + T-Zellen lösliche anti-CD95; + T-Zellen entladen KaAPC; + T-Zellen nicht-verwandten Peptid beladen KaAPC; + T-Zellen verwandten Peptid beladen KaAPC; + T-Zellen Überstand von verwandten Peptid beladen KaAPC.
. Abbildung 2. KaAPC Abtötungsassay Peptid beladen KaAPC oder Kontrollkügelchen (HLA-A2-Ig nur Kügelchen) wurden für 48 h kultiviert in einem Verhältnis 1: 1 mit CMVpp65 spezifischen T-Zellen (~ 80%), geerntet und anschließend mit Annexin gefärbten und Propidiumiodid (PI), um die Apoptose durch Durchflusscytometrie (siehe Protokoll Schnitt von 3,3 bis 3,7) zu bestimmen. "verwandten" bezieht sich auf Perlen mit CMVpp65 und "nicht-verwandten" werden geladenAnzeigen mit Mart-1 Peptid beladen. Die Zahlen geben den Anteil der lebensfähigen T-Zellen in der linken unteren Quadranten jeder Parzelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Um kreuz-Experimente durchzuführen, zu erzeugen Antigen-spezifischen T-Zellen aus zwei verschiedenen Spezifitäten.
- Die Antigen-spezifische Depletion-Fähigkeiten KaAPC weiter auszuwerten bei gleichzeitiger Analyse der Antigen-spezifischen Eliminierung von T-Zellen in der heterogenen T-Zellpopulation. (Für eine ausführliche Protokoll finden Sie Schütz et al. 10).
Representative Results
Die Merkmale dieses Protokolls auf den definierten Erzeugung eines KaAPC Phänotyp, HLA-A2-Ig (Signal 1) und Anti-Fas-mAb (Apoptose-Signal) in der gleichen Zeit, die im Vergleich zu den zellbasierten Ansätze nicht durch Beschichtung verändert zeigt oder Transduktion Wirkungsgrade und kann problemlos während der Produktion (Abbildung 1) moduliert werden. Weiterhin KaAPC, sind nicht empfindlich gegenüber zytotoxischen Effektor-Funktionen von T-Zellen und ihre Funktionalität ist nicht abhängig von der Qualität der autologen Antigen-präsentierenden Zellen vor und nach In-vitro-Manipulation.
KaAPC fähig sind abbau Antigen-spezifischen T-Zellen in vitro, wenn sie mit verwandten Peptid beladen, während nicht-verwandten geladen KaAPC nicht erschöpfen T-Zellen (Figur 2). Daher KaAPC induzieren T-Zell-Apoptose in einer Antigen-spezifischen Weise. Anschließend aus einem Gemisch von verschiedenen T-Zell-SPE verwendeten wir KaAPC für die selektive Abreicherung von Antigen-spezifischen T-Zellencificities, was zeigt, dass nur eine geringe Zytotoxizität wurde in Nachbar-Zellen undicht (Abbildung 3). Somit KaAPC stellen eine vorzügliche Werkzeug für In-vitro-Antigen-spezifische Depletion von humanem aktiviertem Antigen-spezifischen T-Zellen mit möglichen klinischen Anwendbarkeit bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen und Transplantatabstoßungen.
Discussion
Der wichtigste Schritt im Protokoll ist das geeignete Verhältnis des Signals 1 (Peptid-MHC) und des Signals 2 (anti-Fas-mAb) zu gewährleisten. Wir haben intensive Titration Experimente durchgeführt, um das perfekte Verhältnis zur Signal 1 und 2 zu definieren; es zeigte sich, dass minimale Abweichungen aufgrund von Unterschieden in der HLA-A2-Ig-Dimer oder Anti-Fas-mAk-Konzentrationen mit der Funktionalität des KaAPC stören. Daher sollte die Konzentration der beiden Signale stets überprüft werden und die Qualität der beiden Proteine ist häufig getestet, auch wenn sie von einer kommerziellen Quelle befohlen werden. Darüber hinaus sollte die Konzentrationen immer durch den gleichen Assay bestimmt, wie verschiedene Nachweisverfahren kann in unterschiedlichen Konzentrationen führt. Funktionalität des HLA-A2-Ig können durch unvollständige Rückfaltung und / oder ineffizient Peptidbeladung beeinträchtigt werden. Weiterhin Dimer-Moleküle können in unterschiedlichem Ausmaß, das auf der funktionellen Aktivität des Proteins beeinflussen könnten, zu aggregieren. Daher ist die versicherungsal Menge an Dimer zur Erzeugung eines funktionalen und spezifische KaAPC variieren benötigt. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass der ideale Bereich für den Tod induzieren Signal anti-Fas-mAb auf KaAPC ist extrem eng. In unseren Händen größeren Mengen 3,64 g / ml, um unspezifische Tötung von Fas-positiven T-Zellen führen, während Mengen unter 3,64 g / ml führte zu einer dosisabhängigen reduziert Tötungsaktivität. Während diese Bedingungen scheinen recht eng sind, wird die Aufmerksamkeit auf diese Details bei der Erzeugung eines funktionellen und spezifische KaAPC führen.
Während die Strom KaAPC Phänotyp Funktions zur Abreicherung von aktiviertem Antigen-spezifischen T-Zellen, naiv anfänglichen Experimenten Targeting oder Ruhe Antigen-spezifischen T-Zellen zeigten keine signifikante Induktion von Antigen-spezifischen Apoptose als diese Populationen Fas-Expression reduziert. Daher könnte man sich vorstellen das Hinzufügen eines kostimulatorischen Signals auf den KaAPC, um die Hochregulation von Fas auf ruhenden T-Zellen zu machen, schalten Sie sie induzierenin einem Ziel für den KaAPC. Dies ist zwar möglich alle drei Signale müssen sorgfältig titriert, um einen funktionellen Phänotyp KaAPC gewährleisten.
Einstellung der Wulst-Plattform auf eine biokompatible oder bioabbaubare Matrix KaAPC verbessern in vivo Anwendbarkeit. Kürzlich, Shen et al. Haben die erfolgreiche in vivo-Verwendung von KaAPC 5 um unter Verwendung von Latex-Kügelchen, um anti-Fas (Klon Jo2) und Anti-His / H2-K b konjugiert -TRP2 11 gemeldet. Wir waren in der Lage zu zeigen, dass das allgemeine Konzept der künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen (AAPC) erfolgreich aus um bis nm großen Partikel 12 Größe übertragen werden und dass Funktionalität wird durch Partikelgeometrie 13 beeinflusst. Somit kann durch Variieren der Größe und / oder Form der zukünftigen KaAPC Designs könnte man sich auf die in vivo-Funktionalität und biologische Verteilung, die die Schlüssel für eine erfolgreiche Behandlung organspezifischer Autoimmunkrankheiten sein könnte Auswirkungen.
2, Entwicklung von zusätzlichen HLA-Klasse-I-Moleküle Dimer sowie die laufende Identifizierung von neuen Autoimmun relevanter Antigene weiter zu erhöhen und erweitern die Anwendbarkeit der KaAPC. Außerdem eine der mit KaAPC an verschiedenen Epitope gerichtet, mehrere Antigene gleichzeitig gezielt denken konnte.
Zusammenfassend stellen KaAPC eine flexible Plattform-Technologie für eineTigen-spezifischen T-Zell-Depletion. Ihre "lego-like" Natur ermöglicht die Aufnahme neuer Signale, wie zusätzliche Co-stimulierende oder hemmende Signale wie PD1 oder TRAIL auf verschiedenen Matrizen, die erweitern und verbessern ihre anschließende in vitro und in vivo Anwendbarkeit könnte. Hier berichten wir über die Schritt-für-Schritt-Protokoll zu KaAPC, die erste Wulst basierten Ansatz für die Eliminierung von Antigen-spezifischen T-Zellen aus T-Zellgemischen mit unterschiedlichen Spezifitäten.
Abbildung 3. KaAPC beseitigen CTL in einer Antigen-spezifischen Weise PKH26-markierten aktivierten Fas +-Effektor-Memory-CTL und PKH67-markierten CMVpp65 spezifische CTL vom selben Spender wurden gemischt, um eine 1:. 1 gemischt und co-kultiviert mit CMVpp65 KaAPC 48 Stunden. Kontrollkulturen wurden mit entladen KaAPC oder 1 ug / ml behandelt,von löslichen Anti-Fas-mAb (Klon CH11). Minimalen Verlust von lebensfähigen Zellen wurde in unbehandelten Mischkulturen CTL (T-Mix) bestimmt. Original FACS-Daten für jeden CTL Population der T mix gezeigt. Analyse der Apoptose wurde wie zuvor von separaten Gating auf beiden T-Zellpopulationen 10 veröffentlicht. Zahlen in den linken oberen Quadranten dargestellt stellt% der Gesamtzellen. Die Figur veranschaulicht, wird von einem repräsentativen Experiment von drei unabhängigen Experimenten abgeleitet. Diese Forschung wurde ursprünglich in Blood veröffentlicht. . Schütz, C. et al Mörder künstliche Antigen-präsentierenden Zellen: eine neue Strategie, um spezifische T-Zellen zu löschen Blut.. 2008; 111, 3546-52. Copyright der American Society of Hematology. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Disclosures
CS und MF haben nichts zu offenbaren.
Unter einer Lizenzvereinbarung zwischen NexImmune und der Johns Hopkins University, Drs. Schneck und Oelke sind dabei auf Aktien von lizenz von der Universität aus dem Verkauf von in diesem Artikel beschrieben AAPC Produkte erhielten berechtigt. Sie besitzen auch NexImmune Lager, das unter bestimmten Einschränkungen unter Hochschulpolitik ist. Dr. Schneck ist ein Mitglied der Gesellschaft "s Verwaltungsrat und Scientific Advisory Board. Die Bedingungen dieser Vereinbarung werden von der Johns-Hopkins-Universität in Übereinstimmung mit seinen Interessenkonflikt Richtlinien verwaltet.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) und KFO 146 (MF) unterstützt, der DOD-Verteidigungsministerium Zuschuss PC 040972 (MO) und das National Institute of Health gewährt RO1 CA108835 , RO1 Ai44129 (JPS)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Human AB serum | Atlanta biologicals | S40110 | |
| EDTA | Sigma/Aldrich | E5134 | |
| Sodium azide | Sigma/Aldrich | 71289 | |
| M-450 epoxybeads | Invitrogen/Dynal | 14011 | |
| MPC-1 magnet | Invitrogen/Dynal | 12001D | |
| Screw top glass vial | Fisher Scientific | 03-338AA | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| anti-CD95 (clone CH11) | Milliore | 05-201 | |
| HLA-A2-Ig dimer | BD/Pharmingen | 551263 | |
| Cryo-tube 2 ml | Corning | 430488 | |
| anti-mouse IgG1 PE | BD/Pharmingen | 559320 | |
| anti-mouse IgM FITC | BD/Pharmingen | 553408 | |
| Sodium chloride | Merck | S271-3 | |
| Calcium chloride | Sigma/Aldrich | C5080 | |
| HEPES | cellgro/Mediatech | 25-060-CI | |
| RPMI | gibco/life technologies | 11875-085 | |
| 96-well Round bottom plate | Falcon | 353077 | |
| AnnexinV FITC | PromoKine | PK-CA577-1001-1000 | |
| 7-AAD | BD/Pharmingen | 51-68981E | |
| FACS tubes | Falcon | 352008 |
References
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