Summary
ガイドラインが提示細胞キラー人工抗原の生成のために提示され、KaAPC、ヒト抗原特異的T細胞のインビトロ枯渇および抗原のT細胞媒介性自己免疫疾患の治療のための細胞免疫療法の代替ソリューションのための効率的なツール残りの免疫系を損なうことなく、特定の方法。
Abstract
T細胞媒介性自己免疫疾患の現在の治療は長期的には、そのような感染または悪性腫瘍を制御する能力の低下などの有害な副作用を伴う、グローバル免疫抑制の戦略に主に依存している。したがって、新しいアプローチが唯一の疾患を媒介する細胞を標的とし、無傷で残っている免疫システムを残すことが開発される必要がある。過去10年間T細胞媒介免疫応答を調節するための細胞ベースの免疫療法戦略の多様な開発されてきた。これらのアプローチのほとんどは、寛容誘導抗原提示細胞（APC）に依存している。しかし、技術的に困難で面倒であることに加えて、そのような細胞ベースのアプローチは、それらの治療的能力を制限細胞傷害性T細胞応答に非常に敏感である。ここでは、再を残しながら病的なT細胞の枯渇を可能にする非細胞キラー人工抗原提示細胞の生成（KaAPC）のためのプロトコルを提示maining免疫系手つかずで機能的。 KaAPCは、抗原特異的な様式で、望ましくないT細胞応答を調節することにより、自己免疫疾患および同種移植片拒絶反応を治療するための可能性を有する細胞免疫療法に代わる解決策である。
Introduction
最後の20年間に多くの進歩は、自己免疫疾患の発症機序を理解する上でなされた。しかし、最も一般的な治療法はまだコステロイドならびにそのようなプリン類似体などの免疫抑制剤、アルキル化剤およびカルシニューリン阻害剤1に依存しています。そのような薬物の使用は、患者の予後を大幅に改善されている、まだ治療は、基礎免疫学誤動作の硬化を提供していません。さらに、患者は感染症および癌の発生に対して脆弱になる。
したがって、T細胞媒介自己免疫疾患および同種移植片拒絶の治療のための究極の目標は、具体的に、同時に、手付かずおよび免疫学的疾患と戦うために有能な残りの免疫系を残してT細胞を生じさせるだけの疾患を標的とすることである。末梢T細胞応答を抑制するための治療を最初に早けれ説明したように、抗原提示細胞（APC）を利用しいくつかのグループによって、1970。その後、多くの細胞ベースのアプローチが開発されているので（シュッツら 2に概説される）。免疫調節細胞は、自己免疫、移植片拒絶および慢性感染症の治療のための治療的可能性を示す有望な結果を示したように、FasLの発現キラー-APCを用いた戦略。しかし、最終的にそれらの臨床的適用性が制限されているのFasLキラー-APCを利用する戦略に重大な制限があります。 （ⅰ）、APCの生成または単離は時間、労力、集中コスト（ⅱ）による免疫抑制に血球減少症を患っている患者は、細胞の限られた量と品質を提供（iii）のような高度でのFasLの結果としてのアポトーシス誘導シグナルと、APCのコーティングまたは形質導入を変数の表現型および（iv）キラー-APCは、T細胞の細胞傷害性エフェクター機能は、結果としてその治療可能性を低減することに敏感である。したがって、定義された再現可能なキラー-APCのフェノを保証することは困難であるin vivoで T細胞応答の抗原特異的変調のために利用することができるタイプ。
キラー-APC 3-5および人工抗原提示細胞に発現のFasLとの以前の研究（のaAPC）6,7に基づき、私たちは中に自己反応性T細胞の抗原特異的阻害または除去のために、ビーズベースのアプローチ（KaAPC）を開発試験管 。 KaAPCは、HLA-A2-Ig二量体（信号1）と共有結合さ4.5μmの常磁性ラテックスビーズの表面上に固定化された抗Fasモノクローナル抗体（アポトーシス誘導シグナル）で構成されています。彼らは、Fas / FasLの抗原特異的様式で複数の特異性のT細胞の培養物からファッションを媒介活性化誘導細胞死（AICD）経路とは無関係に抗原特異的T細胞を枯渇させる。標的T細胞において用量依存性アポトーシスは、すでに30分8後に急速に誘導される。
KaAPCを容易棚phenotオフに定義確実に制御された様式で生成することができYPEおよび細胞ベースの枯渇戦略の欠点のほとんどを克服する。したがって、KaAPCは、T細胞特異的治療戦略のフィールドを進め、T細胞媒介自己免疫疾患および同種移植片拒絶の治療のための大きな可能性を表示する。
Protocol
HLA-A2-IgをベースKaAPCの1世代
- 無菌のホウ酸緩衝液を準備します。水中のホウ酸の0.1M溶液を作成し、pHを7.0に調整。無菌フィルター（0.22μm）をバッファリングし、4℃で保存する。
- 無菌のビーズ洗浄バッファーを準備します。マグネシウムおよびカルシウムなしでリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を使用。 3％の最終濃度のためのヒトAB血清を追加します。 2mMの最終濃度のためにエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を加える。 0.01％の最終濃度のためにアジ化ナトリウム（NaN 3を ） を加える。無菌フィルター（0.22μm）をバッファリングし、4℃で保存する。
- 無菌に在庫からのエポキシビーズ（約100×10 6ビーズ）を250μlを移し、トップガラスバイアルスクリュー。
- ホウ酸緩衝液を250μlを追加。
- 磁石の上ガラスバイアルを入れて、ビーズを2分間付着させ;吸引バッファと磁石からガラスバイアルを取り外します。
- 1ミリリットルホウ酸緩衝液で1回ビーズを洗浄する。
- 0.018μgの550μlの中に再懸濁ビーズ/ mlのHLA-A2-Igおよび3.64 / mlの抗ヒトCD95モノクローナル抗体（クローンCH11）と軽く振り混ぜる。 （詳細については、議論のセクションを参照してください。）
- 24時間、4℃で、端部の上に回転子の端にガラスバイアルをインキュベートする。
- 2分間300×gでビーズをスピンダウン。
- 2分間磁石上にガラスバイアルを置き、「KaAPC負荷溶液」を吸引する。磁石からガラスバイアルを取り外し、ビーズ洗浄緩衝液1mlを加え、振とうして、慎重に再懸濁する。
- 二回ステップ1.10を繰り返します。
- 1ミリリットルビーズ洗浄緩衝液中で24時間、4℃で回転装置上ガラスバイアルをインキュベートする。この時点で、結合部位を全ての残留タンパク質は、ビーズ洗浄緩衝液に含まれるヒトAB血清によってブロックされる。
- 2分間300×gでビーズをスピンダウン。
- 2分と吸引ビーズ洗浄バッファー用の磁石の上に置きガラスバイアル;磁石からガラスバイアルを除去し、1mlのPBSで溶液を交換してください。
2品質管理、ペプチド負荷、Wアッシング、ストレージ、およびKaAPCの安定性
- FACSチューブに1.5×10 5 KaAPCを移し、FACSバッファを洗う1ミリリットルで洗浄する。
- 100μlのFACSに再懸濁ビーズ（HLA-A2-IgのFc部分を検出するための）抗マウスIgG1 PEを1μlおよび検出のための抗マウスIgM FITC（クローンR6-60.2、1μlのをバッファリングし、追加の洗浄抗ヒトCD95 mAbの）。
- FACSバッファーを洗浄し、250μlのFACSでの再懸濁は、フローサイトメトリーによって染色をバッファリングし、読んで洗う1ミリリットルで洗浄し、4℃で15分間インキュベートする。
プロトコルの項で述べたように作られKaAPCバッチの図1のQC染色剤。染色は、抗ヒトCD95のに対し、2 HLA-A2-Igは抗マウスIgG1のPEモノクローナル抗体を用いて検出したプロトコルの項に記載したように行った（抗Fas）（プロトコル自体を参照して抗マウスIgMをFITC mAbで検出されました2.2 ction）（青線）。充填された黒色のグラフは、それぞれ、抗マウスIgG1のPE mAbまたは抗マウスIgMをFITC mAbで染色された空のビーズを表す。右上の数字は、平均蛍光強度（MFI）を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- 新しい滅菌ガラスバイアルにペプチド積載転送20×10 6 KaAPCのために、2分間磁石上に置き、5μgのペプチドを有する500μlの新しいPBSに吸引PBS再懸濁ビーズは（覚えておいて、唯一のHLA-A2制限ペプチドは意志二量体に結合すること！）。
- ストアは、HLA-A2-Ig二量体への十分なペプチド負荷を可能にするために、少なくとも3日間、使用するまで4℃でKaAPCをロードしました。
- 使用直前に、1.14に示されるようにKaAPCをロードしたペプチドを洗浄し;少なくとも6倍、この手順を繰り返します。
注：これは遊離ペプチドがtを有することを保証するために重要なステップです。oが偽陽性の殺傷の結果を避けるために完全に除去すること;残留遊離ペプチドは、抗原特異的T細胞培養9においてアポトーシスを誘導することが示されている。可溶性ペプチドの効果を除外するために、ペプチドの実行上清対照サンプルがロードされ、（3.8を参照）KaAPC洗浄した。 - 血球計数器を用いてビーズを数え、ペプチドと集中の日付、名前でラベルを付けます。
注：ロードされたKaAPCは少なくとも1ヶ月間、4℃で機能している場合。 1ヶ月後、同じペプチドでの再ロードはKaAPCは、1年のために利用することができます。
3 KaAPC 体外キリングアッセイ
- 共培養培地を準備します。 （実験室6製）3％T細胞増殖因子および3％ドナー自家血漿を添加した完全RPMI培地を調製する。ドナー自己血漿が使用できない場合は、熱不活性化ヒトAB血清を使用しています。
- アネキシンV結合緩衝液の準備を準備します。 8.12グラムの塩化ナトリウム（NaCl）および0.12グラムの計算値を溶かす990ミリリットルののddH 2にイウムクロライド（のCaCl 2）を 10mlの1M HEPES緩衝液をO.Add。
- ヒト抗原特異的T細胞を生成する。 （詳細なプロトコールについては、人工抗原提示細胞（aAPCを）利用する前の出版物7を参照してください）。四量体染色によって決定されるように、ペプチド特異性は、少なくとも> 75％であることを確認してください。
- 加湿インキュベーター中で48時間KaAPC 1比率37℃で：各試料について、2×10 5抗原特異的T細胞/ウェル（96ウェル丸底プレート中の）1での共培養培地200μl中でインキュベートC、5％CO 2。
- 収穫サンプルおよびFACSチューブに移す。 、1ミリリットルアネキシンV結合緩衝液で洗浄し、5分間300×gでスピンダウン、アネキシンV結合緩衝液100μlの上清と再懸濁を捨てる
- RTで10〜15分間、1μlのアネキシンV FITCおよび5μlの7-AADで染色サンプルは、1ミリリットルアネキシンV結合緩衝液で洗浄する。 5分間300×gでスピンダウン、上澄みANを捨てる250μlのアネキシンV結合緩衝液中のd再懸濁
- フローサイトメーター上で直ちにサンプルをお読みください。
- 以下KaAPCにより抗原特異的な死滅を決定するためのサンプルの準備：T細胞のみ; T細胞+可溶性抗CD95; T細胞はKaAPCアンロード+; KaAPCロードされたT細胞は、+非同族ペプチド; T細胞+同族のペプチドはKaAPCをロードした。同族のペプチドのT細胞+上清をKaAPCをロードしました。
アッセイを殺す図2 KaAPCペプチドは1から48時間培養した（HLA-A2-Igのビーズのみ）KaAPCまたはコントロールビーズをロードした：回収し、その後アネキシンVで染色し、CMVpp65特異的T細胞（〜80％）と1の比率フローサイトメトリーによってアポトーシスを測定するためにヨウ化物（PI）プロピジウム（プロトコルセクション3.3から3.7を参照）。「コグネイト」はであることがCMVpp65および「非同族"で撮影されたビーズを指しMART-1ペプチドをロードした広告。数字は各プロットの左下の象限中の生存T細胞の割合を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- 十字、実験を行うために、2つの異なる特異性の抗原特異的T細胞を生成する。
- さらに不均一なT細胞集団におけるT細胞の抗原特異的排除の同時分析をKaAPCの抗原特異的な空乏能力を評価する。 （詳細なプロトコールについてシュッツらを参照してください。10）。
Representative Results
このプロトコルの特徴は、HLA-A2-Igの（シグナル1）および細胞ベースのアプローチと比較してコーティングすることによって変更されないと同時に、抗Fasモノクローナル抗体を（アポトーシスシグナル）、表示KaAPC表現型の定義された発生を含むまたは形質導入の有効性と簡単に生産します（ 図1）の間に変調することができる。さらに、KaAPCは、T細胞の細胞傷害性エフェクター機能に敏感ではなく、それらの機能は、 インビトロ操作で事前および事後自家抗原提示細胞の品質に依存しない。
KaAPC KaAPCロードされた非同族のT細胞（ 図2）を枯渇させ、一方、同族ペプチドを負荷したとき、インビトロで抗原特異的T細胞を枯渇させることが可能である。したがって、KaAPCは、抗原特異的にT細胞のアポトーシスを誘導する。続いて、本発明者らは、異なるT細胞のSPEの混合物から抗原特異的T細胞の選択的枯渇KaAPCを使用最小限の細胞毒性は、隣接するT細胞に漏れたことを実証cificities、（ 図3）。したがって、KaAPCは、自己免疫疾患および同種移植片拒絶反応の治療のための潜在的な臨床適用性を有するヒト活性化した抗原特異的T細胞のインビトロ抗原特異的枯渇のための精巧なツールを表す。
Discussion
プロトコルの中で最も重要なステップは、信号1（ペプチドMHC）と信号2（抗Fas mAb）での適切な比率を確保することである。私たちは、信号1および2のための完全な比率を定義するために集中的な滴定実験を行った。それは、HLA-A2 Ig二量体または抗Fas mAb濃度の違いによる最小限の変動がKaAPCの機能を妨害する可能性があることが明らかになった。このように、両方の信号の濃度を常に検証する必要があり、それは商業的供給源から注文された場合でも、両方のタンパク質の品質は頻繁にテストする必要があります。異なる検出アッセイは、異なる濃度になる場合がありさらに、濃度が常に同じアッセイによって決定されるべきである。 HLA-A2-Igの機能は、不完全なフォールディングおよび/または非効率的なペプチド負荷に損なわれる可能性があります。さらに、二量体分子は、タンパク質の機能的活性に影響を与える可能性が異なる程度に集約できます。従って、ACTU機能的かつ具体的なKaAPCの生成に必要とされる二量体の他の量は変わる場合があります。さらに、当社はKaAPC上の信号抗Fasモノクローナル抗体を誘導する死のための理想的な範囲は非常に厳しいであることがわかった。私たちの手の金額でより3.64μgの/ ml未満の金額は用量依存減少殺傷活性をもたらした中のFas陽性T細胞の非特異的殺害につながる/ 3.64μgの。これらの条件はかなり厳しいようだが、これらの細部に注意が機能し、特定のKaAPCの世代になります。
現在KaAPC表現型は活性化した抗原特異的T細胞の枯渇のために機能的であるが、これらの集団は、Fas発現が低下しているように、ナイーブまたは休止抗原特異的T細胞を標的とする最初の実験は、抗原特異的アポトーシスの有意な誘導を示さなかった。そのため、人はそれらを有効にする静止T細胞上のFasのアップレギュレーションを誘導することがKaAPC上に共刺激シグナルを追加思い描くかもしれませんKaAPCのターゲットに。これは実現可能ですが、3つすべての信号は、慎重に、機能KaAPC表現型を確実にするために滴定する必要があります。
生体適合性または生分解性マトリックスにビーズプラットフォームを調整することで、生体内適用に KaAPCを強化する。最近、シェンらは KaAPCは抗Fas（クローンは、Jo2）および抗His / H2-K b の -TRP2 11にコンジュゲートを5μmのラテックスビーズを利用した生体内の使用で成功を報告している。私たちは、人工抗原提示細胞（aAPCを）の一般的な概念が正常程度の大きさの粒子の大きさの程度12から転送することができ、その機能性は、粒子の幾何学的形状13の影響を受けていることを示すことができた。したがって、サイズおよび/ または将来のKaAPCの形状を変化させることによって一つの臓器特異的自己免疫疾患の治療の成功のための鍵である可能性があり、in vivoでの機能性および生体分布に影響を与えることができるかもしれない設計。
2、私はさらに増加しての適用可能性を広げるであろう分子ならびに新たな自己免疫に関連する抗原の継続的な識別ダイマー追加のHLAクラスの開発を同定されているKaAPC。さらに1は、同時に複数の抗原を標的とするために、異なるエピトープに向けKaAPCを使用して考えることができます。
要約すると、KaAPCはのための柔軟なプラットフォーム技術を表しているtigen特異的T細胞枯渇。彼らの「レゴのような」性質は、in vitroおよびin vivoの適用におけるそれらのその後を広げ、強化することができ、さまざまな行列、上のようなPD1又はTRAILなどの追加の共刺激または阻害シグナルなどの新しい信号を含めることができます。私たちは、本明細書KaAPC、異なる特異性を有するT細胞の混合物からの抗原特異的T細胞の除去のための第1のビードベースのアプローチを生成するためのステップバイステップのプロトコルを提示する。
。図3 KaAPCが、抗原特異的な様式でCTLをなくす PKH26で標識し、同じドナーからのFas +エフェクターメモリーCTLを活性化し、PKH67で標識したCMVpp65特異的CTLを1に混合した：CMVpp65 KaAPCと1の比率と共培養し48時間。対照培養はアンロード KaAPC、または1μg/ mlので処理したの可溶性抗Fas-モノクローナル抗体（クローンCH11）。生存細胞の最小限の損失を、未処理の混合CTL培養物（T ミックス ）で測定した。 T ミックスの各CTL集団の元のFACSデータを示している。以前に両方のT細胞集団10上の別のゲーティングによって発行されたアポトーシスの分析を行った。左上の象限に描か数値は、全細胞の％を占める。説明図は、3つの独立した実験のうちの1つの代表的な実験に由来する。この研究は、もともと血液に掲載されました。シュッツ、C. らキラー人工抗原提示細胞：特異的T細胞を削除するための新規戦略ブラッド。 2008; 111、3546から52。著作権米国血液学会。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Disclosures
CSとMFが開示することは何もない。
NexImmuneとジョンズ·ホプキンス大学、博士との間のライセンス契約の下で。シュネックとエールケはこの資料に記載のaAPC商品の販売に大学によって受信されたロイヤルティの株式を受けることができます。彼らはまた、大学の方針の下、一定の制限の対象となるNexImmune株式を所有。博士はシュネックは取締役会および科学諮問委員会」の会社のメンバーでもあります。この構成の条件は、金利政策の抵触に応じて、ジョンズ·ホプキンス大学で管理されている。
Acknowledgments
この作品は、ドイツ研究財団（DFG）SCHU-2681 / 1-1（CS）とKFO 146（MF）、DOD学科防衛の助成PC 040972（MO）によってサポートされており、国立衛生研究所は、RO1 CA108835を付与します、RO1 Ai44129（JPS）
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Human AB serum | Atlanta biologicals | S40110 | |
| EDTA | Sigma/Aldrich | E5134 | |
| Sodium azide | Sigma/Aldrich | 71289 | |
| M-450 epoxybeads | Invitrogen/Dynal | 14011 | |
| MPC-1 magnet | Invitrogen/Dynal | 12001D | |
| Screw top glass vial | Fisher Scientific | 03-338AA | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| anti-CD95 (clone CH11) | Milliore | 05-201 | |
| HLA-A2-Ig dimer | BD/Pharmingen | 551263 | |
| Cryo-tube 2 ml | Corning | 430488 | |
| anti-mouse IgG1 PE | BD/Pharmingen | 559320 | |
| anti-mouse IgM FITC | BD/Pharmingen | 553408 | |
| Sodium chloride | Merck | S271-3 | |
| Calcium chloride | Sigma/Aldrich | C5080 | |
| HEPES | cellgro/Mediatech | 25-060-CI | |
| RPMI | gibco/life technologies | 11875-085 | |
| 96-well Round bottom plate | Falcon | 353077 | |
| AnnexinV FITC | PromoKine | PK-CA577-1001-1000 | |
| 7-AAD | BD/Pharmingen | 51-68981E | |
| FACS tubes | Falcon | 352008 |
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