Summary
Directrices se presentan para la generación de antígeno artificial asesino células presentadoras, KaAPC, una herramienta eficaz para el agotamiento in vitro de células T específicas de antígeno humanos y una solución alternativa a la inmunoterapia celular para el tratamiento de la T enfermedades autoinmunes mediadas por células en un antígeno forma específica sin comprometer el sistema inmune restante.
Abstract
El tratamiento actual de las células T mediadas enfermedades autoinmunes se basa principalmente en las estrategias de inmunosupresión global, lo que, a largo plazo, se acompaña de efectos secundarios adversos tales como una disminución de la capacidad para controlar las infecciones o tumores malignos. Por lo tanto, los nuevos enfoques deben ser desarrollados que se dirigen a las células sólo la enfermedad mediación y dejar el sistema inmunológico queda intacta. Durante la última década una serie de estrategias de inmunoterapia basada en células para modular de células T mediada por la respuesta inmune han sido desarrollados. La mayoría de estos enfoques se basan en células presentadoras de antígeno que induce tolerancia (APC). Sin embargo, además de ser técnicamente difícil y engorroso, tales enfoques basados en células son muy sensibles a las respuestas de células T citotóxicas, lo que limita su capacidad terapéutica. Aquí se presenta un protocolo para la generación de células presentadoras de antígeno artificiales asesinas no celular (KaAPC), que permite el agotamiento de células T patológicos, dejando la resistema inmune restante intacto y funcional. KaAPC es una solución alternativa a la inmunoterapia celular que tiene potencial para el tratamiento de enfermedades autoinmunes y rechazos de aloinjertos mediante la regulación de las respuestas indeseables de células T de una manera específica de antígeno.
Introduction
Durante las dos últimas décadas se ha avanzado mucho en la comprensión de los mecanismos patogénicos de las enfermedades autoinmunes. Sin embargo, los tratamientos más comunes todavía dependen de los corticosteroides y los fármacos inmunosupresores tales como análogos de la purina, agentes alquilantes y los inhibidores de la calcineurina 1. El uso de estos fármacos ha mejorado en gran medida el pronóstico de los pacientes, sin embargo, el tratamiento no proporcionar una cura de la anomalía inmunológica subyacente. Además, los pacientes se vuelven vulnerables a las infecciones y para el desarrollo del cáncer.
Por lo tanto el objetivo final para el tratamiento de enfermedades mediadas por células T autoinmunes y rechazo de aloinjerto es apuntar específicamente sólo la enfermedad causando que las células T mientras que, al mismo tiempo, dejando el sistema inmune restante intacto y competente para combatir los trastornos inmunológicos. Utilizando células presentadoras de antígeno (APC) como tratamiento para suprimir las respuestas de células T periféricas que se describió primero tan pronto comola década de 1970 por varios grupos. Desde entonces se han desarrollado muchos enfoques basados en células (revisado en Schütz et al. 2). Las estrategias que utilizan FasL expresan asesino-APC como células inmunorreguladoras mostraron resultados prometedores que indican un potencial terapéutico para el tratamiento de la autoinmunidad, rechazo de aloinjertos y las infecciones crónicas. Sin embargo, existen limitaciones significativas con las estrategias que utilizan FasL Killer-APC que en última instancia han limitado su aplicabilidad clínica; (I) la generación o el aislamiento de APC es el tiempo, la mano de obra y el coste intensivo (ii) pacientes que sufren de la citopenia debido a la inmunosupresión proporcionan cantidades y calidad de las células limitadas (iii) revestimiento o la transducción de señales de APC con inductores de apoptosis tales como resultados de FasL en altamente fenotipos variables y (iv) Killer-APC son sensibles a citotóxicos funciones efectoras de las células T en consecuencia la reducción de su potencial terapéutico. Por lo tanto, es difícil garantizar un reproducible fenotipo Killer-APC definidotipo que puede ser utilizado para la modulación específica de antígeno de las respuestas de células T in vivo.
Sobre la base de nuestro trabajo previo con FasL expresión Killer-APC 3-5 y células presentadoras de antígeno artificiales (AAPC) 6,7 desarrollamos un enfoque basado en el talón (KaAPC) para la inhibición específica de antígeno o la eliminación de las células T autorreactivas en vitro. KaAPC consiste de un dímero de HLA-A2-Ig (señal 1) y un mAb anti-Fas (apoptosis induciendo señal) covalentemente inmovilizado sobre una superficie de una perla de látex paramagnético 4,5 m. Ellos agotar las células T específicas de antígeno de una manera mediada por Fas / FasL a partir de cultivos de células T de múltiples especificidades de una manera específica de antígeno e independiente de la muerte celular inducida por activación (AICD) y la vía. Dosis dependiente de la apoptosis en las células T específicas se induce rápidamente ya después de 30 min 8.
KaAPC se puede generar fácilmente de una manera controlada asegurando un definido fuera de la plataforma phenotype y superar la mayoría de las deficiencias de las estrategias de reducción de células basado. En consecuencia, KaAPC mostrar un gran potencial para el tratamiento de enfermedades mediadas por células T autoinmunes y rechazo de aloinjertos, avanzar en el campo de las estrategias de tratamiento específicas de células T.
Protocol
1. Generación de HLA-A2-Ig Based KaAPC
- Preparar tampón de borato estéril. Hacer una solución de ácido bórico 0,1 M en agua y ajustar el pH a 7,0. Filtro estéril (0,22 m) de amortiguación y se almacenan a 4 ° C.
- Preparar el tampón de lavado del grano estéril. Utilizar tampón fosfato salino (PBS) sin magnesio y calcio. Añadir suero AB humano para la concentración final del 3%. Añadir ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) durante 2 mM de concentración final. Añadir azida de sodio (NaN 3) para la concentración final de 0,01%. Filtro estéril (0,22 m) de amortiguación y se almacenan a 4 ° C.
- Transferir 250 l de perlas de epoxi (unos 100 x 10 6 perlas) de caldo en un recipiente estéril, tornillo vial de vidrio superior.
- Añadir 250 l de tampón de borato.
- Ponga vial de vidrio en un imán y dejar que los granos se adhieren durante 2 min; tampón aspirar y eliminar vial de vidrio de imán.
- Lavar una vez con perlas 1 ml de tampón de borato.
- Suspender las en 550 l de 0,018 g/ Ml HLA-A2-Ig y 3,64 mg / ml CD95 MAB (clon CH11) anti-humana y mezclar suavemente por agitación. (Por favor vea la sección de discusión para obtener información adicional.)
- Incubar vial de vidrio en un extremo sobre el extremo de los rotadores, a 4 ° C durante 24 horas.
- Centrifugar perlas a 300 xg durante 2 min.
- Coloque el vial de vidrio sobre un imán durante 2 min y aspirar la "solución de carga KaAPC"; eliminar vial de vidrio de imán, añadir 1 ml de tampón de lavado del grano y volver a suspender cuidadosamente por agitación.
- Repita el paso 1.10 dos veces.
- Incubar vial de vidrio en un rotador a 4 ° C durante 24 horas en tampón de lavado 1 del talón ml. En este punto, toda la proteína residual sitios de unión será bloqueada por el suero AB humano contenida en el tampón de lavado de perlas.
- Centrifugar perlas a 300 xg durante 2 min.
- Lugar ampolla de cristal en un imán para los 2 min y tampón aspirado de lavado del grano; eliminar vial de vidrio de imán y reemplazar solución con 1 ml de PBS.
2. Control de Calidad, Péptido Cargando, Wincineración, Almacenamiento y Estabilidad de KaAPC
- Transferir 1,5 x 10 5 KaAPC en un tubo de FACS y se lava con 1 ml de tampón de lavado FACS.
- Suspender las en 100 l FACS tampón de lavado y se añade 1 l de anti-ratón IgG1 PE (para la detección de la parte Fc de la HLA-A2-Ig) y 1 l de IgM anti-ratón FITC (clon R6-60.2, para la detección del mAb anti-CD95 humano).
- Incubar durante 15 min a 4 ° C, lavar con 1 ml FACS tampón de lavado y se vuelve a suspender en 250 FACS mu l de solución de lavado y leer tinción por citometría de flujo.
Figura 1. QC mancha de un lote KaAPC hecho como se indica en la sección de protocolo. Tinción se realizó tal como se describe en la sección de protocolo 2. HLA-A2-Ig se detectó utilizando un PE mAb anti-ratón IgG1, mientras que los anti-humano-CD95 (anti-Fas) se detectó con un anti-ratón-FITC mAb IgM (véase el protocolo en sícción 2.2) (línea azul). Gráficos negros rellenos representan perlas vacías teñidas con anti-ratón IgG1-PE o mAb anti-ratón-FITC mAb IgM, respectivamente. Los números en la esquina superior derecha indican la intensidad media de fluorescencia (MFI). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Para péptido transferencia de carga 20 x 10 6 KaAPC en un nuevo vial de vidrio estéril, colocar en un imán durante 2 min, aspirado PBS y volver a suspender las bolas en 500 l de PBS fresco con 5 mg de péptido (Tenga en cuenta, sólo péptidos HLA-A2 restringidas asirse al dímero).
- Tienda cargado KaAPC a 4 ° C hasta su uso, durante al menos 3 días para permitir suficiente carga péptido en el dímero HLA-A2-Ig.
- Inmediatamente antes de su uso, lavar el péptido cargado KaAPC como se indica en 1,14; repita este paso al menos 6 veces.
NOTA: Este es un paso crucial para asegurar que el péptido libre tiene to ser eliminado completamente para evitar falsos resultados positivos de matanza; péptido libre residual se ha demostrado que induce la apoptosis en cultivos de células T específicas de antígeno-9. Para descartar un efecto de péptidos solubles, correr las muestras de control de sobrenadante de péptido cargado y lavado KaAPC (ver 3.8). - Cuente perlas usando un hemocitómetro y la etiqueta con la fecha, nombre del péptido y la concentración.
NOTA: Loaded KaAPC siendo funcional a 4 ° C durante al menos un mes. Después de un mes, volver a la carga con el mismo péptido permite KaAPC a utilizar durante un máximo de un año.
3. KaAPC Ensayo in vitro Killing
- Preparar los medios de co-cultivo. Preparar medio completo RPMI suplementado con 3% de factor de crecimiento de células T (hecho en el laboratorio 6) y el 3% de los donantes de plasma autólogo. Si los donantes de plasma autólogo no está disponible, utilizar suero AB humano inactivado por calor.
- Preparar preparación tampón de unión AnnexinV. Disolver 8,12 g de cloruro de sodio (NaCl) y 0,12 g calccloruro de io (CaCl 2) en 990 ml ddH 2 O.Add 10 ml de tampón HEPES 1M.
- Generar células T específicas de antígeno humanos. (Para un protocolo detallado por favor vea una publicación previa 7 utilizando células artificiales presentadoras de antígenos (AAPC)). Asegúrese de que la especificidad del péptido es al menos> 75%, determinada por tinción de tetrámero.
- Para cada muestra se incuba 2 x 10 5 células T específicas de antígeno / pocillo (en una placa de fondo redondo de 96 pocillos) en 200 l de medio de co-cultivo a una proporción de 1: 1 con KaAPC durante 48 horas en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Muestras de la cosecha y transferir a un tubo FACS; lavar con 1 ml de tampón de unión AnnexinV, centrifugar a 300 xg durante 5 min, eliminar el sobrenadante y resuspender en 100 l de tampón de unión AnnexinV
- Muestras de la mancha con 1 l AnnexinV FITC y 5 l 7-AAD durante 10-15 minutos a temperatura ambiente, se lavan con tampón de unión AnnexinV 1 ml; centrifugar a 300 xg durante 5 min, descartar un sobrenadanted resuspender en tampón de unión 250 l AnnexinV
- Leer muestras inmediatamente en citómetro de flujo.
- Preparar las siguientes muestras para determinar la matanza-antígeno específico por KaAPC: sólo las células T; Células T anti-CD95 + soluble; Células T + descargadas KaAPC; Células T + péptido no cognado cargado KaAPC; Células T + péptido cognado cargado KaAPC; T células + sobrenadante del péptido cognado cargado KaAPC.
. Figura 2. KaAPC ensayo de matar péptido cargado KaAPC o microesferas de control (HLA-A2-Ig sólo perlas) se cultivaron durante 48 horas a una relación 1: 1 con las células T específicas CMVpp65 (~ 80%), cosechada y posteriormente se tiñó con AnnexinV y yoduro de propidio (PI) para determinar la apoptosis mediante citometría de flujo (véase la sección de protocolo 3.3 a 3.7). "afín" se refiere a perlas cargadas con CMVpp65 y "no afines" a seranuncios cargados de Mart-1 péptido. Los números indican el porcentaje de células T viables en el cuadrante inferior izquierdo de cada parcela. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Para realizar entrecruzadas-experimentos, generar células T específicas de antígeno de dos especificidades diferentes.
- Evaluación adicional de los depleción de habilidades específicas de antígeno de KaAPC con un análisis simultáneo de la eliminación específica de antígeno de células T en la población de células T heterogénea. (Para un protocolo detallado por favor vea Schütz et al. 10).
Representative Results
Las características de este protocolo incluyen la generación de un fenotipo definido KaAPC que muestra HLA-A2-Ig (señal 1) y anti-Fas mAb (señal de apoptosis) al mismo tiempo, que en comparación con los enfoques basados en células no está alterado por recubrimiento o eficacias de transducción y pueden modularse fácilmente durante la producción (Figura 1). Además, KaAPC, no son sensibles a las funciones efectoras citotóxicas de las células T y su funcionalidad no es dependiente de la calidad de las células presentadoras de antígeno autólogas pre y post manipulación in vitro.
KaAPC son capaces de agotar las células T específicas de antígeno in vitro cuando se carga con el péptido cognado, mientras que no afines cargado KaAPC no agotar las células T (Figura 2). Por lo tanto, KaAPC inducir apoptosis de las células T de una manera específica de antígeno. Posteriormente, se utilizó KaAPC para el agotamiento selectivo de células T específicas de antígeno a partir de una mezcla de diferentes SPE células Tcificities, lo que demuestra que sólo un mínimo de citotoxicidad se filtra en las células T de vecinos (Figura 3). Por lo tanto, representan una herramienta KaAPC exquisita para el agotamiento in vitro específica de antígeno de las células T específicas de antígeno humanos activados con un potencial aplicabilidad clínica para el tratamiento de enfermedades autoinmunes y rechazos de aloinjertos.
Discussion
El paso más crítico en el protocolo es asegurar la adecuada relación de señal 1 (péptido MHC) y la señal 2 (anti-Fas mAb). Hemos realizado experimentos de titulación intensivos para definir la proporción perfecta para la señal 1 y 2; se hizo evidente que las variaciones mínimas debido a las diferencias en el dímero HLA-A2 Ig o concentraciones anti-Fas mAb pueden interferir con el funcionamiento de la KaAPC. Por lo tanto, la concentración de ambas señales siempre debe ser verificada y la calidad de ambas proteínas se debe probar con frecuencia, incluso si se ordenó de una fuente comercial. Además, las concentraciones siempre deben ser determinados por el mismo ensayo como diferentes ensayos de detección pueden resultar en diferentes concentraciones. Funcionalidad del HLA-A2-Ig también puede verse afectada debido a replegamiento incompleta y / o la carga peptídica ineficiente. Además moléculas dímero pueden agregarse a los diferentes grados, lo que podría repercutir en la actividad funcional de la proteína. Por lo tanto, la actual cantidad de dímero necesario para la generación de un KaAPC funcional y específica puede variar. Además, se encontró que el rango ideal para la inducción de la muerte de la señal anti-Fas mAb en KaAPC es extremadamente apretado. En nuestras manos cantidades mayores 3,64 g / ml conducen a la muerte no específica de células T positivas Fas mientras que las cantidades por debajo de 3,64 g / ml resultaron en una reducción de la actividad de matar dependiendo de la dosis. Si bien estas condiciones parecen bastante estrecho, atención a estos detalles resultará en la generación de un KaAPC funcional y específico.
Mientras que la corriente fenotipo KaAPC es funcional para el agotamiento de células T activadas específicas de antígeno, los experimentos iniciales dirigidas a células T específicas de antígeno ingenuo o descansando demostrado ninguna inducción significativa de apoptosis específica de antígeno ya que estas poblaciones han reducido la expresión de Fas. Por lo tanto, se podría prever la adición de una señal co-estimuladora sobre el KaAPC para inducir la regulación al alza de Fas en células T en reposo para que se conviertanen un objetivo para el KaAPC. Mientras que esto es factible las tres señales tendrán que ser valorada cuidadosamente para asegurar un fenotipo KaAPC funcional.
Ajuste de la plataforma del talón a una matriz biocompatible o biodegradable mejorará KaAPC aplicabilidad en vivo. Recientemente, Shen et al. Han informado de la exitosa en el uso in vivo de KaAPC la utilización de 5 micras perlas de látex conjugadas con anti-Fas (Jo2 clon) y anti-His / H2-K b -TRP2 11. Hemos sido capaces de demostrar que el concepto general de las células presentadoras de antígeno artificiales (AAPC) se puede transferir con éxito de micras de tamaño de partículas de tamaño nm 12 y que la funcionalidad está influenciada por la geometría de las partículas 13. Por lo tanto, variando el tamaño y / o forma de la futura KaAPC diseña uno podría ser capaz de afectar a la funcionalidad in vivo y bio-distribución, lo que podría ser la clave para el éxito del tratamiento de enfermedades autoinmunes específicas de órganos.
2, el desarrollo de HLA de clase I adicional dímero moléculas, así como la identificación continua de nuevos antígenos relevantes autoinmunes aumentará aún más y ampliar la aplicabilidad de KaAPC. Además se podría pensar en utilizar KaAPC dirigido a diferentes epítopos para apuntar múltiples antígenos simultáneamente.
En resumen, KaAPC representan una tecnología de plataforma flexible para un-Tigen depleción de células T específica. Su naturaleza "-lego como" permite la inclusión de nuevas señales como señales co-estimuladoras o inhibidoras adicionales como PD1 o mapa en diversas matrices, lo que podría ampliar y mejorar su posterior in vitro e in vivo aplicabilidad. Nosotros en este documento presentamos el protocolo paso a paso para generar KaAPC, el enfoque basado en primer talón para la eliminación de las células T específicas de antígeno a partir de mezclas de células T con diferentes especificidades.
Figura 3. KaAPC eliminar CTL de una manera específica de antígeno marcado con PKH26 activado Fas + CTL efectoras de memoria y PKH67-etiquetado CMVpp65 CTL específicos del mismo donante se mezclaron a una 1:. Relación de 1 y co-cultivadas con CMVpp65 KaAPC durante 48 h. Los cultivos de control fueron tratados con KaAPC descargado, o 1 mg / mlde soluble anti-Fas-mAb (clon CH11). Pérdida mínima de células viables se determinó en cultivos mixtos de CTL no tratados (T) de la mezcla. Se muestran los datos de FACS originales para cada población de CTL de la mezcla de T. Se realizó un análisis de la apoptosis como se publicó anteriormente por gating separado en ambas poblaciones de células T 10. Números representados en los cuadrantes superiores izquierda representa% de las células totales. La figura ilustra se deriva de un experimento representativo de tres experimentos independientes. Esta investigación fue publicada originalmente en la sangre. . Schütz, C. et al asesino de las células presentadoras de antígeno artificiales: una nueva estrategia para eliminar las células T específicas de Sangre.. 2008; 111, 3546-52. Derecho de Autor de la Sociedad Americana de Hematología. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Disclosures
CS y MF tienen nada que revelar.
En virtud de un acuerdo de licencia entre NexImmune y la Universidad Johns Hopkins, los Dres. Schneck y Oelke tienen derecho a acciones de imagen recibidos por la Universidad en las ventas de productos AAPC descritos en este artículo. También son dueños de NexImmune de stock, lo que está sujeto a ciertas restricciones en virtud de la política de la Universidad. Dr. Schneck es miembro de la compañía "s Consejo de Administración y del Consejo Asesor Científico. Los términos de este acuerdo están siendo gestionados por la Universidad Johns Hopkins, de conformidad con su conflicto de intereses políticas.
Acknowledgments
Este trabajo ha sido financiado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) SCHU-2681 / 1.1 (CS) y de KFO 146 (MF), el Departamento de Defensa DOD de subvención PC 040972 (MO) y el Instituto Nacional de Salud subvenciones RO1 CA108835 , SR1 Ai44129 (JPS)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Human AB serum | Atlanta biologicals | S40110 | |
| EDTA | Sigma/Aldrich | E5134 | |
| Sodium azide | Sigma/Aldrich | 71289 | |
| M-450 epoxybeads | Invitrogen/Dynal | 14011 | |
| MPC-1 magnet | Invitrogen/Dynal | 12001D | |
| Screw top glass vial | Fisher Scientific | 03-338AA | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| anti-CD95 (clone CH11) | Milliore | 05-201 | |
| HLA-A2-Ig dimer | BD/Pharmingen | 551263 | |
| Cryo-tube 2 ml | Corning | 430488 | |
| anti-mouse IgG1 PE | BD/Pharmingen | 559320 | |
| anti-mouse IgM FITC | BD/Pharmingen | 553408 | |
| Sodium chloride | Merck | S271-3 | |
| Calcium chloride | Sigma/Aldrich | C5080 | |
| HEPES | cellgro/Mediatech | 25-060-CI | |
| RPMI | gibco/life technologies | 11875-085 | |
| 96-well Round bottom plate | Falcon | 353077 | |
| AnnexinV FITC | PromoKine | PK-CA577-1001-1000 | |
| 7-AAD | BD/Pharmingen | 51-68981E | |
| FACS tubes | Falcon | 352008 |
References
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