Summary
दिशानिर्देश कोशिकाओं पेश हत्यारा कृत्रिम प्रतिजन की पीढ़ी के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं, KaAPC, मानव प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं की इन विट्रो कमी और एक antigen- में टी सेल की मध्यस्थता autoimmune रोग के उपचार के लिए सेलुलर प्रतिरक्षा करने के लिए एक वैकल्पिक समाधान के लिए एक कुशल उपकरण शेष प्रतिरक्षा प्रणाली समझौता किए बिना विशिष्ट फैशन.
Abstract
टी सेल की मध्यस्थता autoimmune रोग की वर्तमान उपचार इस तरह के संक्रमण या कैंसर नियंत्रित करने के लिए एक कम क्षमता के रूप में लंबे समय में, प्रतिकूल दुष्प्रभावों के साथ है, जो वैश्विक प्रतिरक्षादमन, की रणनीतियों पर ज्यादातर निर्भर करता है. इसलिए, नए तरीकों को ही रोग मध्यस्थता कोशिकाओं को लक्षित और बरकरार शेष प्रतिरक्षा प्रणाली छोड़ कि विकसित किए जाने की जरूरत है. पिछले दशक के दौरान सेल आधारित immunotherapy रणनीतियों की एक किस्म टी सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया विकसित किया गया है मिलाना. इन तरीकों में से अधिकांश सहिष्णुता उत्प्रेरण प्रतिजन पेश कोशिकाओं (एपीसी) पर भरोसा करते हैं. हालांकि, तकनीकी रूप से कठिन और बोझिल होने के अलावा, इस तरह के सेल आधारित दृष्टिकोण उनके चिकित्सीय क्षमता की सीमा जो साइटोटोक्सिक टी सेल प्रतिक्रिया, के लिए अत्यधिक संवेदनशील हैं. यहाँ हम फिर से जाते वक्त वैकृत टी कोशिकाओं की कमी के लिए अनुमति देता है जो गैर सेलुलर हत्यारा कृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं पेश की पीढ़ी (KaAPC), के लिए एक प्रोटोकॉल पेशmaining प्रतिरक्षा प्रणाली अछूता और कार्यात्मक. KaAPC एक विशिष्ट प्रतिजन फैशन में अवांछनीय टी सेल प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने से autoimmune रोग और allograft rejections के इलाज के लिए क्षमता है जो सेलुलर प्रतिरक्षा करने के लिए एक वैकल्पिक समाधान है.
Introduction
पिछले दो दशकों में बहुत प्रगति autoimmune रोग का रोगजनक तंत्र को समझने में किया गया है. हालांकि, सबसे आम उपचार अभी भी corticosteroids के साथ ही ऐसे purine analogs रूप immunosuppressive दवाओं, क्षारीकरण एजेंटों और calcineurin inhibitors 1 पर भरोसा करते हैं. ऐसी दवाओं का उपयोग बहुत रोगियों के रोग का निदान में सुधार हुआ है, अभी तक उपचार अंतर्निहित प्रतिरक्षाविज्ञानी खराबी के इलाज प्रदान नहीं करता है. इसके अलावा, रोगियों के संक्रमण के लिए और कैंसर के विकास के लिए असुरक्षित हो गया है.
इसलिए टी सेल की मध्यस्थता autoimmune रोग और allograft अस्वीकृति के उपचार के लिए अंतिम लक्ष्य विशेष रूप से, एक ही समय में, अछूता और प्रतिरक्षा विकारों से लड़ने के लिए सक्षम शेष प्रतिरक्षा प्रणाली को छोड़ने जबकि टी कोशिकाओं के कारण ही बीमारी को लक्षित करने के लिए है. उपयोग प्रतिजन पेश कोशिकाओं (एपीसी) परिधीय टी सेल प्रतिक्रियाओं को दबाने के लिए एक इलाज के रूप में पहले के रूप में जल्दी के रूप में वर्णित किया गयाकई समूहों द्वारा 1970 के दशक. तो कई सेल आधारित दृष्टिकोण विकसित किया गया है के बाद से (SCHUTZ एट अल. 2 में समीक्षा). Immunoregulatory कोशिकाओं स्वरोगक्षमता, allograft अस्वीकृति और पुराने संक्रमण के उपचार के लिए चिकित्सीय क्षमता का संकेत आशाजनक परिणाम से पता चला है के रूप में FasL व्यक्त हत्यारा एपीसी का उपयोग रणनीतियाँ. हालांकि, अंत में उनके नैदानिक प्रयोज्यता सीमित है कि FasL हत्यारा एपीसी उपयोग रणनीतियों के साथ महत्वपूर्ण सीमाएं हैं; कृषि मूल्य आयोग (i) पीढ़ी या अलगाव समय, श्रम और गहन लागत है (द्वितीय) cytopenia से कारण प्रतिरक्षादमन को पीड़ित रोगियों सीमित मात्रा में और कोशिकाओं की गुणवत्ता प्रदान (iii) ऐसे अत्यधिक में FasL परिणाम के रूप में apoptosis उत्प्रेरण संकेतों के साथ कोटिंग या एपीसी का पारगमन चर phenotypes और (iv) हत्यारा एपीसी फलस्वरूप उनके चिकित्सीय क्षमता को कम टी कोशिकाओं की प्रेरक कार्यों साइटोटोक्सिक के प्रति संवेदनशील हैं. इसलिए, यह एक परिभाषित प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हत्यारा एपीसी pheno की गारंटी करने के लिए मुश्किल हैविवो में टी सेल प्रतिक्रिया के प्रतिजन विशेष मॉडुलन के लिए उपयोग किया जा सकता है कि प्रकार.
हत्यारा एपीसी 3-5 और कृत्रिम प्रतिजन पेश कोशिकाओं (aAPC) व्यक्त FasL साथ हमारे पिछले काम के आधार पर 6,7 हम ऑटो प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं के प्रतिजन विशेष निषेध या उन्मूलन में के लिए एक मनका आधारित दृष्टिकोण (KaAPC) विकसित इन विट्रो. KaAPC एक एचएलए-A2 पुलिस महानिरीक्षक डिमर (संकेत 1) और covalently 4.5 माइक्रोन अणुचुंबकीय लेटेक्स मनका की सतह पर स्थिर एक विरोधी फैस मैब (apoptosis उत्प्रेरण संकेत) से मिलकर बनता है. वे एक प्रतिजन विशेष ढंग से कई specificities के टी सेल संस्कृतियों से एक फैस / FasL मध्यस्थता फैशन में प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं गिरेगा और सक्रियण प्रेरित कोशिका मृत्यु (AICD) मार्ग से स्वतंत्र. लक्षित टी कोशिकाओं में खुराक निर्भर apoptosis पहले से ही 30 मिनट 8 के बाद तेजी से प्रेरित है.
KaAPC आसानी से एक नियंत्रित फैशन में उत्पन्न किया जा सकता है एक शेल्फ phenot बंद परिभाषित सुनिश्चितype और सेल आधारित कमी रणनीतियों की कमियों का सबसे उबरने. नतीजतन, KaAPC टी सेल विशिष्ट उपचार रणनीतियों के क्षेत्र में आगे बढ़ने, टी सेल की मध्यस्थता autoimmune रोग और allograft अस्वीकृति के उपचार के लिए महान क्षमता प्रदर्शित करते हैं.
Protocol
एचएलए-A2 पुलिस महानिरीक्षक के आधार KaAPC के 1 जनरेशन
- बाँझ borate बफर तैयार करें. पानी में बोरिक एसिड का 0.1 एम समाधान करें और 7.0 पीएच को समायोजित. बाँझ फिल्टर (0.22 माइक्रोन) बफर और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.
- बाँझ मनका धोने बफर तैयार करें. मैग्नीशियम और कैल्शियम के बिना फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) का प्रयोग करें. 3% अंतिम एकाग्रता के लिए मानव अटल बिहारी सीरम जोड़ें. 2 मिमी अंतिम एकाग्रता के लिए ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) जोड़ें. 0.01% अंतिम एकाग्रता के लिए सोडियम azide (NaN 3) जोड़ें. बाँझ फिल्टर (0.22 माइक्रोन) बफर और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.
- एक बाँझ में स्टॉक से epoxy मोती (लगभग 100 x 10 6 मोती) के 250 μl स्थानांतरण, शीर्ष कांच की शीशी पेंच.
- Borate बफर के 250 μl जोड़ें.
- एक चुंबक पर कांच की शीशी रखो और मोती 2 मिनट के लिए पालन करते हैं; महाप्राण बफर और चुंबक से कांच की शीशी को हटा दें.
- 1 मिलीलीटर borate बफर के साथ एक बार मोती धो लें.
- 0.018 ग्राम के 550 μl में Resuspend मोती/ एमएल एचएलए-A2 पुलिस महानिरीक्षक और 3.64 माइक्रोग्राम / एमएल मानव विरोधी CD95 मैब (क्लोन CH11) और धीरे झटकों से मिश्रण. (अतिरिक्त जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें.)
- 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर, अंत में एक रोटेटर अंत पर कांच की शीशी सेते हैं.
- 2 मिनट के लिए 300 XG पर मोती स्पिन.
- 2 मिनट के लिए एक चुंबक पर कांच की शीशी प्लेस और "KaAPC लोडिंग समाधान" aspirate; , चुंबक से कांच की शीशी को दूर मनका धो बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ने और झटकों से सावधानी resuspend.
- दोहराएँ कदम 1.10 दो बार.
- 1 मिलीलीटर मनका धोने बफर में 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटेटर पर कांच की शीशी सेते हैं. इस बिंदु पर, बाध्यकारी साइटों सभी अवशिष्ट प्रोटीन मनका धोने बफर में निहित मानव अटल बिहारी सीरम द्वारा अवरुद्ध हो जाएगा.
- 2 मिनट के लिए 300 XG पर मोती स्पिन.
- जगह कांच 2 मिनट और महाप्राण मनका धोने बफर के लिए एक चुंबक पर शीशी; चुंबक से कांच की शीशी को हटाने और पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ समाधान की जगह.
2 गुणवत्ता नियंत्रण, पेप्टाइड लोड हो रहा है, डब्ल्यूashing, भंडारण, और KaAPC की स्थिरता
- एक FACS ट्यूब में 1.5 x 10 5 KaAPC स्थानांतरण और FACS बफर धोने 1 मिलीलीटर से धो लें.
- बफर और पता लगाने के लिए, और विरोधी माउस आईजीएम FITC (क्लोन R6-60.2 के 1 μl (एचएलए-A2 पुलिस महानिरीक्षक के एफसी भाग का पता लगाने के लिए) विरोधी माउस IgG1 पीई की 1 μl जोड़ने धोने 100 μl FACS में Resuspend मोती मानव विरोधी CD95 मैब की).
- बफर और प्रवाह cytometry द्वारा धुंधला पढ़ा धोने 250 μl FACS में 1 FACS बफर धो मिलीलीटर, और resuspend के साथ धोने, 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
प्रोटोकॉल खंड में कहा गया है के रूप में बनाया एक KaAPC बैच की संख्या 1 क्यूसी दाग. धुंधला विरोधी मानव CD95, जबकि 2 एचएलए-A2 पुलिस महानिरीक्षक के एक विरोधी माउस IgG1 पीई मैब उपयोग करते हुए पाया गया था प्रोटोकॉल खंड में वर्णित के रूप में प्रदर्शन किया गया था (एंटी फैस) (एसई प्रोटोकॉल देखना एक विरोधी माउस आईजीएम FITC मैब के साथ पाया गया थाction 2.2) (ब्लू लाइन). भरा काला रेखांकन क्रमशः विरोधी माउस IgG1 पीई मैब या विरोधी माउस आईजीएम FITC मैब, साथ दाग खाली मोती का प्रतिनिधित्व करते हैं. ऊपरी दाहिने कोने में संख्या मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता (एमएफआई) से संकेत मिलता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
- एक नए बाँझ कांच की शीशी में पेप्टाइड लोडिंग स्थानांतरण 20 x 10 6 KaAPC के लिए, 2 मिनट के लिए एक चुंबक पर जगह, 5 ग्राम पेप्टाइड के साथ 500 μl ताजा पीबीएस में महाप्राण पीबीएस और resuspend मोती (ध्यान रखें, केवल एचएलए-A2 प्रतिबंधित पेप्टाइड्स होगा डिमर पर बाँध!).
- स्टोर एचएलए-A2 पुलिस महानिरीक्षक डिमर पर पर्याप्त पेप्टाइड लोडिंग अनुमति देने के लिए कम से कम 3 दिन के लिए, उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर KaAPC भरा हुआ है.
- उपयोग करने के तुरंत पहले, 1.14 में संकेत के रूप में KaAPC लोड पेप्टाइड धो; इस चरण में कम से कम 6x दोहराएँ.
नोट: इस मुफ्त पेप्टाइड टी है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम हैओ झूठी सकारात्मक हत्या परिणामों से बचने के लिए पूरी तरह से हटाया जा; अवशिष्ट मुक्त पेप्टाइड प्रतिजन विशेष टी सेल संस्कृतियों 9 में apoptosis प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है. एक घुलनशील पेप्टाइड प्रभाव से इनकार करने, लोड पेप्टाइड की सतह पर तैरनेवाला नियंत्रण नमूने चलाने और KaAPC (3.8 देखें) धोया. - Hemocytometer का उपयोग मोती गणना और पेप्टाइड और एकाग्रता की तारीख, नाम के साथ लेबल.
नोट: भरा KaAPC कम से कम एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कार्यात्मक रहते हैं. एक महीने के बाद, एक ही पेप्टाइड के साथ फिर से लोड हो रहा है KaAPC एक साल तक के लिए उपयोग किया जा करने के लिए अनुमति देता है.
3 KaAPC इन विट्रो हत्या परख
- सह संस्कृति मीडिया तैयार करें. और 3% दाता ऑटोलॉगस प्लाज्मा (प्रयोगशाला 6 में किए गए) 3% टी सेल वृद्धि कारक के साथ पूरक पूरा RPMI मध्यम तैयार करें. दाता ऑटोलॉगस प्लाज्मा अनुपलब्ध है, तो गर्मी निष्क्रिय मानव अटल बिहारी सीरम का उपयोग करें.
- AnnexinV बाध्यकारी बफर तैयार करने को तैयार है. 8.12 ग्राम सोडियम क्लोराइड (NaCl) और 0.12 ग्राम Calc भंग990 मिलीलीटर DDH 2 में IUM क्लोराइड (2 CaCl) 10 मिलीलीटर 1M Hepes बफर O.Add.
- मानव प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं को उत्पन्न. (एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए कृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं पेश (aAPC) का उपयोग पिछले एक प्रकाशन 7 देखें). कि पेप्टाइड विशिष्टता टेट्रामर धुंधला द्वारा निर्धारित रूप में कम से कम> 75% है सुनिश्चित करें.
- एक humidified इनक्यूबेटर में 48 घंटे के लिए KaAPC साथ 1 अनुपात 37 डिग्री पर: प्रत्येक नमूना के लिए 2 एक्स 10 5 प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं / अच्छी तरह से (एक साथ 96 दौर नीचे की थाली में) एक 1 पर सह संस्कृति के माध्यम से 200 μl में सेते सेल्सियस और 5% सीओ 2.
- फसल के नमूने और एक FACS ट्यूब में स्थानांतरण; , 1 मिलीलीटर AnnexinV बाध्यकारी बफर के साथ धोने 5 मिनट के लिए 300 XG पर नीचे स्पिन, AnnexinV बाध्यकारी बफर के 100 μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend त्यागें
- 1 μl AnnexinV FITC और आरटी पर 10-15 मिनट के लिए 5 μl 7 AAD के साथ दाग नमूने, 1 मिलीलीटर AnnexinV बाध्यकारी बफर के साथ धोने; , 5 मिनट के लिए 300 XG पर नीचे स्पिन सतह पर तैरनेवाला एक त्यागने250 μl AnnexinV बाध्यकारी बफर में डी resuspend
- प्रवाह पर तुरंत नमूने कोशिकामापी पढ़ें.
- KaAPC द्वारा विशिष्ट प्रतिजन हत्या निर्धारित करने के लिए निम्न नमूने तैयार: टी कोशिकाओं ही; टी कोशिकाओं + घुलनशील विरोधी CD95; टी कोशिकाओं KaAPC उतार +; टी कोशिकाओं + गैर आत्मीय पेप्टाइड KaAPC लोड; टी कोशिकाओं + आत्मीय पेप्टाइड KaAPC लोड; आत्मीय पेप्टाइड की टी कोशिकाओं + सतह पर तैरनेवाला KaAPC भरा हुआ है.
., CMVpp65 विशेष टी कोशिकाओं (~ 80%) के साथ 1 अनुपात काटा और बाद में AnnexinV साथ दाग: चित्रा 2 KaAPC हत्या परख पेप्टाइड एक 1 पर 48 घंटे के लिए सुसंस्कृत KaAPC या नियंत्रण मोती (एचएलए-A2 पुलिस महानिरीक्षक केवल मोतियों) थे भरी हुई और propidium आयोडाइड (पीआई). फ्लो (देखें प्रोटोकॉल खंड 3.3-3.7) द्वारा "आत्मीय" apoptosis निर्धारित होने के लिए "गैर आत्मीय" CMVpp65 और साथ लोड मोतियों को संदर्भित करता है के लिएमार्ट -1 पेप्टाइड के साथ लोड विज्ञापन. संख्या एक साजिश के निचले बाएँ चक्र में व्यवहार्य टी कोशिकाओं का प्रतिशत संकेत मिलता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
- , Crisscross-प्रयोगों प्रदर्शन दो अलग specificities के प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए.
- इसके अलावा विषम टी सेल की आबादी में टी कोशिकाओं के प्रतिजन विशेष उन्मूलन का एक साथ विश्लेषण के साथ KaAPC के प्रतिजन विशेष रिक्तीकरण-क्षमताओं का मूल्यांकन. (एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए SCHUTZ एट अल देखें. 10).
Representative Results
इस प्रोटोकॉल की सुविधाओं सेल आधारित दृष्टिकोण की तुलना में कोटिंग द्वारा बदला नहीं है जो एक ही समय में एचएलए-A2 पुलिस महानिरीक्षक (संकेत 1) और विरोधी फैस मैब (apoptosis संकेत), प्रदर्शित करता है कि एक KaAPC फेनोटाइप परिभाषित पीढ़ी शामिल या पारगमन efficacies और आसानी से उत्पादन (चित्रा 1) के दौरान संग्राहक जा सकता है. इसके अलावा, KaAPC, टी कोशिकाओं की साइटोटॉक्सिक प्रेरक कार्यों के प्रति संवेदनशील नहीं हैं और उनकी कार्यक्षमता विट्रो हेरफेर में से पहले और बाद ऑटोलॉगस प्रतिजन कोशिकाओं पेश की गुणवत्ता पर निर्भर नहीं है.
KaAPC गैर आत्मीय KaAPC टी कोशिकाओं (चित्रा 2) ख़ाली नहीं करेंगे भरी हुई है, जबकि आत्मीय पेप्टाइड के साथ भरी हुई जब इन विट्रो में प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं घट करने में सक्षम हैं. इसलिए, KaAPC एक प्रतिजन विशेष ढंग से टी सेल apoptosis प्रेरित. बाद में, हम विभिन्न टी सेल विशेष के मिश्रण से प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं के चयनात्मक कमी के लिए KaAPC इस्तेमाल कियाकेवल न्यूनतम cytotoxicity पड़ोसी टी कोशिकाओं में लीक कर रहा था कि प्रदर्शन cificities, (चित्रा 3). इस प्रकार, KaAPC autoimmune रोग और allograft rejections के उपचार के लिए संभावित नैदानिक प्रयोज्यता के साथ मानव सक्रिय प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं की इन विट्रो प्रतिजन विशेष कमी के लिए एक उत्तम उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं.
Discussion
प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम संकेत 1 (पेप्टाइड MHC) और संकेत 2 (एंटी फैस एमएबी) के उचित अनुपात सुनिश्चित करने के लिए है. हम संकेत 1 और 2 के लिए एकदम सही अनुपात को परिभाषित करने के लिए गहन अनुमापन प्रयोगों प्रदर्शन किया है; यह कारण एचएलए-A2 पुलिस महानिरीक्षक डिमर या विरोधी फैस मैब सांद्रता में मतभेदों को कम से कम विविधताओं KaAPC की कार्यक्षमता के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कि स्पष्ट हो गया. इस प्रकार, दोनों संकेतों की एकाग्रता हमेशा सत्यापित किया जाना चाहिए और दोनों प्रोटीन की गुणवत्ता में अक्सर यह एक वाणिज्यिक स्रोत से आदेश दिया गया था, भले ही परीक्षण किया जाना चाहिए. अलग पहचान assays के विभिन्न सांद्रता में परिणाम हो सकता है के रूप में इसके अलावा, सांद्रता हमेशा एक ही परख द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए. एचएलए-A2 पुलिस महानिरीक्षक की कार्यक्षमता भी कारण अधूरा refolding और / या अक्षम पेप्टाइड लोडिंग को प्रभावित किया जा सकता है. इसके अलावा डिमर अणुओं प्रोटीन की कार्यात्मक गतिविधि पर प्रभाव पड़ सकता है, जो विभिन्न डिग्री, के लिए कुल कर सकते हैं. इसलिए, actuडिमर के अल राशि भिन्न हो सकते हैं एक कार्यात्मक और विशिष्ट KaAPC की पीढ़ी के लिए की जरूरत है. इसके अलावा, हम KaAPC पर संकेत विरोधी फैस मैब उत्प्रेरण मौत के लिए आदर्श रेंज बेहद तंग है कि पाया. हमारे हाथ मात्रा में अधिक से अधिक 3.64 माइक्रोग्राम / एमएल नीचे मात्रा एक खुराक पर निर्भर करता है कम हत्या गतिविधि में हुई जबकि मिलीलीटर फैस सकारात्मक टी कोशिकाओं की गैर विशिष्ट हत्या करने के लिए नेतृत्व / 3.64 माइक्रोग्राम. इन स्थितियों में काफी तंग लगता है, इन विवरण के लिए ध्यान एक कार्यात्मक और विशिष्ट KaAPC की पीढ़ी में परिणाम होगा.
वर्तमान KaAPC फेनोटाइप भोले या आराम प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं को लक्षित सक्रिय प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं, प्रारंभिक प्रयोगों की कमी के लिए कार्यात्मक है जबकि इन आबादियों फैस अभिव्यक्ति कम कर दिया है के रूप में विशिष्ट प्रतिजन apoptosis की कोई महत्वपूर्ण प्रेरण का प्रदर्शन किया. इसलिए, उन्हें एक बारी बनाने के लिए टी कोशिकाओं आराम पर फैस के ऊपर विनियमन के लिए प्रेरित करने के लिए KaAPC पर एक सह उत्तेजक संकेत जोड़ने कल्पना कर सकते हैंKaAPC के लिए एक लक्ष्य में. यह संभव है जबकि सभी तीन संकेतों सावधानी से एक कार्यात्मक KaAPC फेनोटाइप सुनिश्चित करने के लिए titrated करना होगा.
एक biocompatible या biodegradable मैट्रिक्स के लिए मनका मंच समायोजन विवो प्रयोज्यता में KaAPC में वृद्धि होगी. हाल ही में, शेन एट अल. KaAPC -TRP2 11 बी विरोधी फैस (क्लोन Jo2) और विरोधी उनकी / एच 2 कश्मीर संयुग्मित 5 माइक्रोन लेटेक्स मोती के उपयोग के विवो उपयोग करने में सफल सूचना दी है. हम कृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं पेश (aAPC) की सामान्य अवधारणा को सफलतापूर्वक एनएम आकार के कणों से 12 आकार माइक्रोन से स्थानांतरित किया जा सकता है और कार्यक्षमता है कि कण ज्यामिति 13 से प्रभावित है कि दिखाने के लिए सक्षम किया गया है. इस प्रकार, आकार और / या भविष्य KaAPC का आकार अलग से एक अंग विशिष्ट autoimmune रोग का सफल उपचार के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है जो इन विवो कार्यक्षमता और जैव वितरण, पर असर करने में सक्षम हो सकता है डिजाइन.
2, मैं आगे बढ़ाने के लिए और की प्रयोज्यता व्यापक होगा अणुओं के साथ ही नए autoimmune प्रासंगिक एंटीजन के चल रहे पहचान डिमर अतिरिक्त एचएलए वर्ग के विकास की पहचान की गई है KaAPC. इसके अलावा एक साथ कई एंटीजन को लक्षित करने के लिए विभिन्न epitopes पर निर्देशित KaAPC का उपयोग कर के बारे में सोच सकता है.
संक्षेप में, KaAPC एक के लिए एक लचीला मंच प्रौद्योगिकी का प्रतिनिधित्वtigen विशेष टी सेल रिक्तीकरण. उनके "लेगो की तरह" प्रकृति ऐसी व्यापक और इन विट्रो में और vivo प्रयोज्यता में उनके बाद में वृद्धि कर सकता है जो विभिन्न matrices पर ऐसे PD1 या निशान के रूप में अतिरिक्त सह उत्तेजक या निरोधात्मक संकेत के रूप में नए संकेतों के शामिल किए जाने के लिए सक्षम बनाता है. हम साथ साथ KaAPC, अलग specificities के टी सेल के मिश्रण से प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं के उन्मूलन के लिए पहला मनका आधारित दृष्टिकोण उत्पन्न करने के लिए कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं.
चित्रा 3 KaAPC एक प्रतिजन विशेष फैशन में सीटीएल को समाप्त एक 1 के लिए फैस + प्रेरक स्मृति सीटीएल सक्रिय PKH26 लेबल और मिश्रित थे वही दाता से CMVpp65 विशेष सीटीएल PKH67 लेबल:. CMVpp65 KaAPC साथ 1 अनुपात और सह सुसंस्कृत 48 घंटे के लिए. नियंत्रण संस्कृतियों उतार KaAPC, या 1 ग्राम / एमएल के साथ इलाज किया गयाके घुलनशील विरोधी फैस मैब (क्लोन CH11). व्यवहार्य कोशिकाओं का कम से कम नुकसान अनुपचारित मिश्रित सीटीएल संस्कृतियों (टी मिक्स) में निर्धारित किया गया था. टी मिश्रण के प्रत्येक सीटीएल आबादी के लिए मूल FACS डेटा दिखाए जाते हैं. पहले दोनों टी सेल आबादी 10 पर अलग gating द्वारा प्रकाशित के रूप में apoptosis के विश्लेषण किया गया था. ऊपरी बाएँ quadrants में दर्शाया संख्या कुल कोशिकाओं की% का प्रतिनिधित्व करता है. illustrating आंकड़ा तीन स्वतंत्र प्रयोगों के बाहर एक प्रतिनिधि प्रयोग से प्राप्त होता है. इस शोध मूल रूप से रक्त में प्रकाशित किया गया था. . SCHUTZ, सी एट अल खूनी कृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं पेश: एक उपन्यास रणनीति विशेष टी कोशिकाओं को नष्ट करने के लिए रक्त.. 2008; 111, 3546-52. कॉपीराइट रुधिर के अमेरिकन सोसायटी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Disclosures
सीएस और शेयरों में खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
NexImmune और जॉन्स हॉपकिंस विश्वविद्यालय, डीआरएस के बीच एक लाइसेंस समझौते के तहत. Schneck और Oelke इस आलेख में वर्णित aAPC उत्पादों की बिक्री पर विश्वविद्यालय द्वारा प्राप्त रॉयल्टी के शेयरों के हकदार हैं. उन्होंने यह भी विश्वविद्यालय नीति के तहत कुछ प्रतिबंध के अधीन है जो NexImmune शेयर, के मालिक हैं. डॉ Schneck कंपनी 'के निदेशक मंडल और वैज्ञानिक सलाहकार बोर्ड के एक सदस्य है. इस व्यवस्था के संदर्भ ब्याज नीतियों के अपने संघर्ष के अनुसार जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय द्वारा प्रबंधित किया जा रहा है.
Acknowledgments
यह काम जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (सीएस) और KFO 146 (एमएफ) द्वारा समर्थित किया गया है, रक्षा अनुदान पीसी की डीओडी विभाग 040972 (एमओ) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान RO1 CA108835 अनुदान , RO1 Ai44129 (JPS)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Human AB serum | Atlanta biologicals | S40110 | |
| EDTA | Sigma/Aldrich | E5134 | |
| Sodium azide | Sigma/Aldrich | 71289 | |
| M-450 epoxybeads | Invitrogen/Dynal | 14011 | |
| MPC-1 magnet | Invitrogen/Dynal | 12001D | |
| Screw top glass vial | Fisher Scientific | 03-338AA | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| anti-CD95 (clone CH11) | Milliore | 05-201 | |
| HLA-A2-Ig dimer | BD/Pharmingen | 551263 | |
| Cryo-tube 2 ml | Corning | 430488 | |
| anti-mouse IgG1 PE | BD/Pharmingen | 559320 | |
| anti-mouse IgM FITC | BD/Pharmingen | 553408 | |
| Sodium chloride | Merck | S271-3 | |
| Calcium chloride | Sigma/Aldrich | C5080 | |
| HEPES | cellgro/Mediatech | 25-060-CI | |
| RPMI | gibco/life technologies | 11875-085 | |
| 96-well Round bottom plate | Falcon | 353077 | |
| AnnexinV FITC | PromoKine | PK-CA577-1001-1000 | |
| 7-AAD | BD/Pharmingen | 51-68981E | |
| FACS tubes | Falcon | 352008 |
References
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