Summary

Intracerebroventrikulær Viral Injeksjon av Neonatal Mouse Brain for Vedvarende og Utbredt Neuronal Transduksjon

Published: September 15, 2014
doi:

Summary

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Abstract

Med tempoet i den vitenskapelige framgang akselererer raskt, er nye metoder som trengs for eksperimentell nevrovitenskap å raskt og enkelt manipulere genuttrykket i musen hjernen. Her beskriver vi en teknikk først introdusert av Passini og Wolfe for direkte intrakraniell levering av viralt-kodede transgener inn i neonatal mus hjernen. I sin mest grunnleggende form, fremgangsmåten krever bare en is bøtte og en mikroliter sprøyte. Imidlertid kan protokollen også tilpasses for bruk med stereotaksiske rammer for å forbedre konsistens for forskere nye å teknikken. Metoden er avhengig av evnen av adenoassosiert virus (AAV) til å bevege seg fritt fra cerebral ventrikkel inn i hjernen parenchyma mens ependymal foring fremdeles er umoden under den første 12-24 timer etter fødselen. Intraventrikulært injeksjon av AAV i denne alderen fører til utbredt transduksjon av nerveceller i hele hjernen. Expression begynner innen dager etter injeksjon og vedvarer for lifetime av dyret. Viral titer kan justeres for å kontrollere tettheten av transduserte neuroner, mens ko-ekspresjon av et fluorescerende protein gir en viktig etikett av transduserte celler. Med den økende tilgjengeligheten av viruskjernefasiliteter for å gi både off-the-sokkel, pre-pakket reagenser og tilpassede viral forberedelse, denne tilnærmingen gir en betimelig metode for å manipulere genuttrykket i musen hjernen som er rask, enkel og langt rimeligere enn tradisjonelle germline engineering.

Introduction

Tradisjonelle metoder for å endre nevrale genuttrykk krever tidkrevende og dyre germline manipulasjoner. Alternativt de novo tilnærminger, for eksempel in utero elektroporering eller stereotaksisk injeksjon lentiviral gi raskere resultater og er mindre kostbare, men har den ulempe at det krever kompliserte kirurgiske inngrep 1-3. Videre er transgene ekspresjon en begrenset romlig rekkevidde med disse metodene. Heri beskriver vi en rask, enkel og økonomisk metode for utbredt neuronal manipulasjon via intraventrikulært injeksjon av adenoassosiert virus (AAV) i neonatal mus hjernen. Metoden ble først beskrevet av John Wolfe og Marco Passini i 2001, der de foreslo liten partikkelstørrelse på AAV latt det diffuse i cerebrospinalvæsken når den passerer fra sideventriklene gjennom umoden ependymal barriere og inn i hjernen parenchyma 4, 5. Intraventrikulær injeksjon av AAV i first 24 timer etter fødselen avkastning utbredt viral transduksjon av nevrale undergrupper spenner hver region av hjernen, fra olfactory pærer til hjernestammen 6,7. Viralt-levert transgener uttrykkes og aktiv innen dager etter injeksjon og vare i opptil et år etter transduksjon. Dermed gjør denne allsidige manipulasjon studier som spenner fra tidlig postnatal utvikling av hjernen til aldring og degenerasjon i den voksne.

I å tilpasse teknikken til våre spesifikke eksperimentelle behov, har vi fokusert primært på AAV8 serotype fordi det er den mest effektive på transducing nevroner seks. Vi viser at viral titer kan fortynnes for å styre tettheten av transduserte neuroner for eksperimenter testcelle iboende konsekvenser av genetisk manipulering. I tillegg, viser vi at to virusene kan bli ko-injiseres for å oppnå uttrykk mønstre som er forutinntatt mot distinkte eller overlappende sett av nevroner, avhengig av serotypene som er valgt forviral emballasje. Vårt arbeid utvider allsidigheten til denne teknikken til bruk i et bredt spekter av eksperimentelle nevrovitenskap innstillinger.

Protocol

Utfør alle prosedyrer og protokoller som involverer dyr i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Prosedyrene som beskrives her ble gjennomgått og godkjent av Baylor College of Medicine Institutional Animal Care og bruk komité. Replication-inkompetent adenoassosiert virus (AAV) vektorer for transgenet levering i gnager hjernen er godkjent for biosikkerhet Level 1 bruk. Referere til CDC nettsted for den amerikanske regjeringen publikasjonen "…

Representative Results

Vellykket intraventrikulære viral injeksjon avkastning utbredt og robust neuronal uttrykk. Her har vi evaluert viral transduksjon bruker YFP eller tdTomato fluorescerende gener under kontroll av kylling beta aktin promoter (CBA promoter). Disse konstruksjonene ble pakket inn AAV8 og injiseres i sideventriklene av neonatal (P0) ICR mus. Høye virale titre (10 10 partikler per halvkule) resulterte i tett merking av luktelappen, striatum, cerebral cortex, hippocampus og lillehjernen (Figur 1a, …

Discussion

Vi har beskrevet en allsidig fremgangsmåte for manipulering av neuronal genekspresjon ved å bruke AAV som et redskap for utbredt levering inn i den neonatale mus hjernen. Sammenlignet med andre fremgangsmåter for neuronal transgenesis som in utero elektroporering eller en stereotaksisk intrakranial injeksjon 2,3, er forholdsvis lett og enkelt viral neonatal injeksjon. Den grunnleggende fremgangsmåten kan utføres i løpet av minutter med bare en is bøtte og en mikroliter sprøyte. Optimal over…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was supported by the Robert A. and Rene E. Belfer Family Foundation, NIA R21 AG038856 (JLJ), BrightFocus Foundation Alzheimer’s Disease research grant A2010097 (JLJ), and NIA Biology of Aging Training grant T32 AG000183 (support for SDG).

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
ICR outbred mice Harlan Hsd:ICR (CD-1) This strain is also known as CD-1
FVB inbred mice The Jackson Laboratory 1800 5-6 weeks of age
Nestlets Lab Supply NESTLETS
Shepherd shacks Lab Supply SS-mouse
High fat rodent chow Purina Mills PicoLab Mouse diet 20, #5058 This is our standard breeder chow
High fat rodent chow (alternative) Harlan Laboratories Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed
Injection syringe Hamilton 7653-01 10 ml syringe
Injection needles Hamilton 7803-04, RN 6PK PT4 32 gauge, for standard P0 injections
Metal plate for cryoanesthesia McMaster Carr 8975K439 Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop
Small animal stereotaxic device with digital readout David Kopf Instruments Model 940
Universal syringe holder with needle support foot David Kopf Instruments Model 1772-F1
Neonatal frame Stoelting 51625 Officially called a mouse and neonatal rat adaptor
Biohazard disposal bags with sterile indicator VWR 14220-030 Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal

References

  1. De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Progress in neurobiology. 92, 227-244 (2010).
  2. Sun, B., Gan, L. Manipulation of gene expression in the central nervous system with lentiviral vectors. Methods Mol Biol. 670, 155-168 (2011).
  3. Puntel, M., et al. Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors. Curr Protoc Neurosci. 4, (2010).
  4. Passini, M. A., Wolfe, J. H. Widespread gene delivery and structure-specific patterns of expression in the brain after intraventricular injections of neonatal mice with an adeno-associated virus vector. J Virol. 75, 12382-12392 (2001).
  5. Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77, 7034-7040 (2003).
  6. Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37, 1203-1220 (2013).
  7. Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PloS one. 8, (2013).
  8. Croyle, M. A., Cheng, X., Wilson, J. M. Development of formulations that enhance physical stability of viral vectors for gene therapy. Gene therapy. 8, 1281-1290 (2001).
  9. Bauer, H. C., Bauer, H. Neural induction of the blood-brain barrier: still an enigma. Cellular and molecular neurobiology. 20, 13-28 (2000).
  10. Cearley, C. N., et al. Expanded repertoire of AAV vector serotypes mediate unique patterns of transduction in mouse brain. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1710-1718 (2008).
  11. Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J Virol. 82, 5887-5911 (2008).

Play Video

Cite This Article
Kim, J., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. J. Vis. Exp. (91), e51863, doi:10.3791/51863 (2014).

View Video