Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.
Med tempoet i den vitenskapelige framgang akselererer raskt, er nye metoder som trengs for eksperimentell nevrovitenskap å raskt og enkelt manipulere genuttrykket i musen hjernen. Her beskriver vi en teknikk først introdusert av Passini og Wolfe for direkte intrakraniell levering av viralt-kodede transgener inn i neonatal mus hjernen. I sin mest grunnleggende form, fremgangsmåten krever bare en is bøtte og en mikroliter sprøyte. Imidlertid kan protokollen også tilpasses for bruk med stereotaksiske rammer for å forbedre konsistens for forskere nye å teknikken. Metoden er avhengig av evnen av adenoassosiert virus (AAV) til å bevege seg fritt fra cerebral ventrikkel inn i hjernen parenchyma mens ependymal foring fremdeles er umoden under den første 12-24 timer etter fødselen. Intraventrikulært injeksjon av AAV i denne alderen fører til utbredt transduksjon av nerveceller i hele hjernen. Expression begynner innen dager etter injeksjon og vedvarer for lifetime av dyret. Viral titer kan justeres for å kontrollere tettheten av transduserte neuroner, mens ko-ekspresjon av et fluorescerende protein gir en viktig etikett av transduserte celler. Med den økende tilgjengeligheten av viruskjernefasiliteter for å gi både off-the-sokkel, pre-pakket reagenser og tilpassede viral forberedelse, denne tilnærmingen gir en betimelig metode for å manipulere genuttrykket i musen hjernen som er rask, enkel og langt rimeligere enn tradisjonelle germline engineering.
Tradisjonelle metoder for å endre nevrale genuttrykk krever tidkrevende og dyre germline manipulasjoner. Alternativt de novo tilnærminger, for eksempel in utero elektroporering eller stereotaksisk injeksjon lentiviral gi raskere resultater og er mindre kostbare, men har den ulempe at det krever kompliserte kirurgiske inngrep 1-3. Videre er transgene ekspresjon en begrenset romlig rekkevidde med disse metodene. Heri beskriver vi en rask, enkel og økonomisk metode for utbredt neuronal manipulasjon via intraventrikulært injeksjon av adenoassosiert virus (AAV) i neonatal mus hjernen. Metoden ble først beskrevet av John Wolfe og Marco Passini i 2001, der de foreslo liten partikkelstørrelse på AAV latt det diffuse i cerebrospinalvæsken når den passerer fra sideventriklene gjennom umoden ependymal barriere og inn i hjernen parenchyma 4, 5. Intraventrikulær injeksjon av AAV i first 24 timer etter fødselen avkastning utbredt viral transduksjon av nevrale undergrupper spenner hver region av hjernen, fra olfactory pærer til hjernestammen 6,7. Viralt-levert transgener uttrykkes og aktiv innen dager etter injeksjon og vare i opptil et år etter transduksjon. Dermed gjør denne allsidige manipulasjon studier som spenner fra tidlig postnatal utvikling av hjernen til aldring og degenerasjon i den voksne.
I å tilpasse teknikken til våre spesifikke eksperimentelle behov, har vi fokusert primært på AAV8 serotype fordi det er den mest effektive på transducing nevroner seks. Vi viser at viral titer kan fortynnes for å styre tettheten av transduserte neuroner for eksperimenter testcelle iboende konsekvenser av genetisk manipulering. I tillegg, viser vi at to virusene kan bli ko-injiseres for å oppnå uttrykk mønstre som er forutinntatt mot distinkte eller overlappende sett av nevroner, avhengig av serotypene som er valgt forviral emballasje. Vårt arbeid utvider allsidigheten til denne teknikken til bruk i et bredt spekter av eksperimentelle nevrovitenskap innstillinger.
Vi har beskrevet en allsidig fremgangsmåte for manipulering av neuronal genekspresjon ved å bruke AAV som et redskap for utbredt levering inn i den neonatale mus hjernen. Sammenlignet med andre fremgangsmåter for neuronal transgenesis som in utero elektroporering eller en stereotaksisk intrakranial injeksjon 2,3, er forholdsvis lett og enkelt viral neonatal injeksjon. Den grunnleggende fremgangsmåten kan utføres i løpet av minutter med bare en is bøtte og en mikroliter sprøyte. Optimal over…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the Robert A. and Rene E. Belfer Family Foundation, NIA R21 AG038856 (JLJ), BrightFocus Foundation Alzheimer’s Disease research grant A2010097 (JLJ), and NIA Biology of Aging Training grant T32 AG000183 (support for SDG).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
ICR outbred mice | Harlan | Hsd:ICR (CD-1) | This strain is also known as CD-1 |
FVB inbred mice | The Jackson Laboratory | 1800 | 5-6 weeks of age |
Nestlets | Lab Supply | NESTLETS | |
Shepherd shacks | Lab Supply | SS-mouse | |
High fat rodent chow | Purina Mills | PicoLab Mouse diet 20, #5058 | This is our standard breeder chow |
High fat rodent chow (alternative) | Harlan Laboratories | Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S | If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed |
Injection syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 ml syringe |
Injection needles | Hamilton | 7803-04, RN 6PK PT4 | 32 gauge, for standard P0 injections |
Metal plate for cryoanesthesia | McMaster Carr | 8975K439 | Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop |
Small animal stereotaxic device with digital readout | David Kopf Instruments | Model 940 | |
Universal syringe holder with needle support foot | David Kopf Instruments | Model 1772-F1 | |
Neonatal frame | Stoelting | 51625 | Officially called a mouse and neonatal rat adaptor |
Biohazard disposal bags with sterile indicator | VWR | 14220-030 | Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal |