Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

פרוטוקול Microarray רקמות הדור הבא (ngTMA) לביומרקר לימודים

doi: 10.3791/51893 Published: September 23, 2014

Summary

הפרוטוקול שמטרתו לייעל את הבנייה ואיכות של microarrays רקמות למחקר סמן ביולוגי. הוא כולל היבטים של תכנון ועיצוב, פתולוגיה הדיגיטלית, ביאור שקופיות וירטואלי, וarraying רקמות האוטומטית.

Abstract

מחקר סמן ביולוגי מסתמך על microarrays רקמות (TMA). TMAs מיוצר על ידי העברה חוזרת ונשנית של ליבות רקמה קטנות מבלוק 'תורם' לגוש 'נמען' ולאחר מכן משמש למגוון רחב של יישומי סמן ביולוגי. הבנייה של TMAs הקונבנציונלי היא עבודה אינטנסיבית, לא מדויק, וגוזל זמן. הנה, פרוטוקול באמצעות מערכי רקמות הדור הבא (ngTMA) מתואר. ngTMA מתבסס על תכנון TMA ועיצוב, פתולוגיה הדיגיטלית, וmicroarraying רקמות אוטומטית. הפרוטוקול בא לידי ביטוי באמצעות דוגמא של 134 חולי סרטן מעי גס גרורתי. היבטים היסטולוגית, סטטיסטיים ולוגיסטיים נחשבים, כגון סוג הרקמה, אזורים היסטולוגית ספציפיים, וסוגי תאים לצורך ההכללה בTMA, מספר כתמי רקמה, גודל מדגם, ניתוח סטטיסטי, ומספר עותקי TMA. שקופיות היסטולוגית לכל מטופל נסרקות והועלו פלטפורמה דיגיטלית מבוסס אינטרנט. שם, הם נתפסים ואןotated (מסומן) באמצעות כלי קוטר .6-2.0 מ"מ, מספר פעמים תוך שימוש בצבעים שונים כדי להבחין אזורי רקמות. בלוקים תורם ו12 לוקים 'נמען' נטענים לתוך המכשיר. שקופיות דיגיטליות אחזור והתאמה לתמונות בלוק תורם. arraying חוזר ונשנה של אזורים מבואר באופן אוטומטי מתבצע וכתוצאה מכך ngTMA. בדוגמא זו, שש ngTMAs מתוכננים מכיל שישה סוגים שונים של רקמות / אזורים היסטולוגית. שני עותקים של ngTMAs הם רצויים. שלוש עד ארבע שקופיות לכל מטופל נסרקים; 3 ריצות סריקה נחוצות ובוצע בין לילה. כל השקופיות מבוארת; צבעים שונים משמשים כדי לייצג את הרקמות / אזורים השונים, כלומר מרכז גידול, מול פלישה, גידול / סטרומה, גרורות בלוטה לימפה, גרורות בכבד, ורקמות נורמליות. 17 הסברים / מקרה נעשים; זמן להסברים הוא 2-3 דק '/ מקרה. 12 ngTMAs מיוצר מכיל 4,556 נקודות. Arraying זמן הוא 15-20 שעה. בשל הדיוק, הגמישות והמהירות שלו, ngTMA היא רב עוצמהכלי לשיפור איכות TMAs נוסף המשמש במחקר קליני וtranslational.

Introduction

במהלך שני העשורים האחרונים, microarrays רקמות (TMAs) יש לו השפעה יוצאת דופן על מחקרי חקירת סמן ביולוגי. TMAs הוא בעצם "ארכיון" המיוצר על ידי ההעברה החוזרת ונשנית של ליבות רקמה קטנות, בדרך כלל החל בגודל .6-2.0 מ"מ קוטר רקמה, מקוביות "תורם" פרפין המוטבע לתוך בלוק אחד TMA 'נמען' (איור 1) 1. שימוש בגודל ליבה קטן, כ 500 כתמי רקמות שונים מחולים שונים מעט או רבים יכולים להיות ערוך לאחד TMA 2.

השימוש בTMAs ללימודי סמן ביולוגי פרוגנוסטיים או חזוי יש יתרונות רבים. קחו למשל את הדוגמא שבה ביטוי של סמנים ביולוגיים חלבון על ידי אימונוהיסטוכימיה הוא להיות מוערך על 450 חולים. במקום ביצוע 450 כתמי immunohistochemical על 450 שקופיות מטופל מחולק מאותו מספר בלוקים, ניתן ערוכות ליבות קטנות מכל מדגם על T בודדבלוק MA. גם אם ליבות מרובות לקוחים מכל מטופל באופן אישי, מספר מינימאלי של בלוקים מיוצר. יש לכך ההשפעה הניכרת של אופן דרסטי פוחת עלויות ומשאבים אחרים, כמו גם הפחתת הרס רקמות. מחקרים בנוסף זה מאפשר מופעל כראוי באמצעות מספר רב של רקמות כדי להיות מוערכים באותם תנאי הניסוי.

יש לי TMAs יישומים רבים ושונים. לדוגמא, הם יכולים לשמש כדי לחקור מורפולוגיה, ביטוי חלבון, ביטוי RNA וסטיות DNA הבא צביעה עם צבעים שונים, או לאחר אימונוהיסטוכימיה או chromogenic ואפילו הקרינה הכלאה באתר 3-7. גם מחקרים שנעשו לאחרונה שימוש TMAs לבדוק וריאציה הפנים ומעבדתיות בפרוטוקולים מכתים, להקים סגוליות או רגישות של נוגדנים למוטציות גנטיות ספציפיות, ולקבוע את שחזור interobserver של ביטוי חלבון בשיתופי פעולה בינלאומי

הבנייה של TMAs המסורתי באמצעות רקמות המופק ממטופל היא הליך צעד רב ארוך (איור 2). זה מתחיל בחיפוש אחר מקרים מתאימים אפשריים ובחירה של שקופיות אבחון מהארכיונים במכון לפתולוגיה, או מוסד אחר, מהמקום שבו הם תוחזר. פתולוג מעריך כל שקופית לכל מקרה ובוחר את השקופית המייצגת ביותר למטרות המחקר. בשלב הבא, את האזור של עניין מסומן באמצעות עט ישירות מתחת למיקרוסקופ. זה הוא לעתים קרובות מאתגר ולא מדויק ותוצאות רק ב" הערכה "של איפה יש לנקוט אגרופים רקמה מ. בשלב בא, בלוקים פרפין המתאימים לשקופיות מסומנות אלה שנאספו מהארכיון. השוואה מהירה בין הבלוק והשקופיות נעשתה. באמצעות arrayer רקמה חצי אוטומטי או תוצרת בית, בלוק תורם אגרוף באזור המשוער של ריבית והועבר לגוש TMA נמען. בנייה של TMAs באמצעות טכניקת arraying זו היא עבודה אינטנסיבית, זמן רב, לא מדויקת, ולא גמישה. הכנת TMA של 475 נקודות ב 3 עותקים היא מוערכת לקחת על 84 שעות של עבודה.

גישה חדשה לבנייה של TMAs הוצגה לאחרונה על ידי המכון לפתולוגיה, האוניברסיטה ברן שמסתמכת על שלושה מרכיבים: תכנון ועיצוב (או ייעוץ), פתולוגיה הדיגיטלית בשילוב עם מומחיות בהיסטולוגיה וTMA האוטומטי arraying 12. יחד, מושג זה נקרא רקמות הדור הבא Microarray (ngTMA). להלן, פרוטוקול לngTMA מתואר מבוסס על דוגמא של 134 חולים עם סרטן מעי גס גרורתי. כאן, גידולים ראשוניים, כמו גם גרורות בלוטה לימפה וגרורות בכבד יש ערוכים לngTMAs לניתוח סמן ביולוגי שלאחר מכן. בנוסף, ליבות רקמה קטנות מכל מטופל הן רצויים להפקת חומצת גרעין עתיד.

Protocol

הערה: מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה המקומית של בית החולים Insel, ברן, שוויץ (07-10-13). רקמות התקבלו מבנק הגידול ברן, המכון לפתולוגיה, האוניברסיטה ברן.

.1 תכנון ועיצוב (ייעוץ)

  1. תחשוב על שאלת המחקר להיות ענה. החלט על סוגי הרקמות להיכלל בפרויקט. לקבוע מה מבנים היסטולוגית חשובים לענות על השאלה.
  2. לברר את קוטר הליבה השימושי ביותר ואת מספר הליבות לחולה לפרויקט. החלט על מספר העותקים של מערך מיקרו רקמות של הדור הבא (ngTMA) המבוססים על הסכום של סמנים ביולוגיים להיחקר.
  3. לשקול היבטים סטטיסטיים כגון גודל מדגם וניתוח לאחר microarray הרקמות (TMA) בנוי. לקבוע את מספרם של חולים להכללה במחקר ולהקים רקמות שליטה למערך.
  4. אחזר את היסטולוגית (אוהאבחון) Haematoxylin וEosin (H & E) שקופיות של כל מטופל. תסקור בקצרה את השקופיות ולזהות את אלה המכילים מידע רלוונטי והיסטולוגיה לפרויקט.
    הערה: הפוך קטעים חדשים של בלוקים פרפין, אם כתם מיוחד או שקופיות אימונוהיסטוכימיה הוא רצויים לסריקת שקופיות והסברים, במקום שקופיות H & E

סריקת .2 החלק

  1. הפעל את מחשב וסורק שקופיות ותוכנת סריקה פתוחה. בחר באפשרות "מצב אוטומטי" לסריקת שדה בהירה מהמסך התצוגה המקדימה.
  2. לחץ על "אפשרויות סריקה" כדי להתאים את הפרמטרים איכות שקופיות. בשלב זה, לבחור אם שקופיות לסריקה ישירות לפלטפורמה הדיגיטלית נגישה על ידי אינטרנט או בכונן מקומי (או כונן חיצוני) ולהגדיר את סוגי סריקה ומספר נקודות פוקוס.
  3. לחץ על "פרמטרי שרת" כדי לסרוק ל" מרכז המקרה ". בשלב זה, להוסיף עוד מגזינים, לתייג כל השקופיות ולהגדירהתיקייה במקרה שבו מרכז צריכים להיות מאוחסנות השקופיות. כל מגזין מכיל עד 25 שקופיות.
  4. איכות בדיקה / ניקיון של שקופיות היסטולוגית בפועל לסריקה. אם שקופיות הדרושות, נקיות עם 70% אתנול.
  5. טען עד 25 שקופיות למגזין עם התוויות מצביעות פנימה (איור 3 א)
  6. מניחים את המגזין בסורק. למגזין אחד או יותר, מניח אותם על גבי זה.
  7. להתחיל לסרוק שקופיות על ידי לחיצה על החץ הירוק (איור 3 ב). כאשר כל השקופיות נסרקות, לפרוק את המגזינים וסגר את סורק תכנית, מחשב ושקופיות.

.3 החלק דיגיטלי ביאור

  1. הזן את הכתובת של הדפדפן למרכז דיגיטלי ניהול שקופיות ולהוריד את תוכנת הצופה שקופיות הדיגיטלית החופשית.
  2. פתח את תוכנת הצופה שקופיות הדיגיטלית ובחר את התיקייה המכילה את השקופיות הדיגיטליות (איור 4 א).
  3. הוסף הערות, לסדר מחדש ולנהל את digitaתיקיית l שקופיות או להמחות את זכויות משתמש עמיתים או להוסיף קבצים מצורפים לתיקייה.
  4. לחץ על שקופית דיגיטלית רצויה שמופיעה בתצוגה השקופיות הדיגיטלית.
  5. שימוש בכלי הגדלה, להעריך את השקופית ולמצוא את תחומי העניין להשתלבות ngTMA.
  6. באמצעות 'כלי ביאור TMA', בחר את הגודל של הליבה הרצויה ואת הצבע של הביאור. הנח את הביאור בשקופית הדיגיטלית על ידי לחיצה עליו (איור 4).
  7. הזז את הביאור למבנים היסטולוגית הרצויים לשילובם בngTMA (איור 4C).
  8. חזור על תהליך זה של ביאור שוב על ידי שימוש בכלי הביאור, בחירת גודל ליבה וצבע ביאור רצוי. חזור על הצפייה השקופיות והסברים על כל השקופיות בתיקייה.
  9. לחלופין, למקם את ליבות רקמה לPCR ל0.2 מ"ל צינורות במקום השתלבות TMA. סמן בשקופיות באמצעות צבע שונה לזיהויכתמים אלה לניתוח מולקולרי נוסף.
  10. צור רשימה של כל המקרים עם הביאורים המקבילים שלהם ובצבעים.

בניית Microarray .4 רקמות

  1. אחזר את לוקי רקמות פרפין המתאימים לכל שקופיות הדיגיטליות המבואר, למיין בלוקים לפי הסדר הרצוי לmicroarraying רקמה.
  2. ודא שיש לי לוקי הרקמות מינימליים של עובי 4 מ"מ. אם לא, reembedding של רקמה יש צורך.
  3. הפעל את המחשב "ON" ומכשיר microarrayer רקמות אוטומטיות. פתח את תוכנת microarrayer הרקמה ולספק שם לפרויקט
  4. לבצע "כלי שינוי" ובחר את קוטר כלי הנדרש לפרויקט (כלומר, 0.6, 1.0, 1.5, או 2.0 מ"מ).
  5. טען עד 12 לוקים 'הנמען' TMA לתוך המכונה. תן תעודת זהות לכל אחד מהלוקים 12
  6. ליצור פריסת TMA עבור כל בלוק נמען. שים לב עיצוב TMA עם מספר שורות, עמודות, ולרומם אתקווי y כמו גם מרחק בין ליבות. ליצור פריסה חדשה עבור כל בלוק נמען או להשתמש באותה הפריסה שוב ושוב.
  7. הצב את הסמן על פריסת בלוק הנמען לקחת הליבה הראשונה.
  8. בשלב בא, לטעון עד 60 לוקי תורם לmicroarrayer הרקמה (איור 5A). הנח עשרה בלוקים בכל שורה לפ תן לכל בלוק זיהוי תורם. שים לב תמונות של כל בלוק תורם על מסך המחשב שנרכש באופן אוטומטי על ידי microarrayer הרקמה.
  9. החל מהבלוק הראשון, לחץ על "Slide". שים לב לשקופית המבואר הדיגיטלית המאוחסנת במרכז הדיגיטלי ניהול שקופיות (או על הכונן החיצוני) שימוש בתצוגת השקופיות הדיגיטלית. הצג את התמונה של בלוק התורם וצד Side-by-שקופיות דיגיטליות.
  10. נקודות התייחסות בחרו בתמונת הבלוק כדי להרכיב את תמונת בלוק תורם עם השקופיות הדיגיטליות
  11. לאחר לחיצה על "הבא", להתבונן ההסברים על תמונה מוגדלת של הבלוק. (איור 5 ב </ Strong>). לחץ על חלקו העליון של ההסברים כדי לאשר ולחץ על "התחל".
    הערה: זו מבקשת microarrayer הרקמה להתחיל קידוח חור של 0.6 מ"מ קוטר בבלוק הנמען בנקודת המוצא שנבחרה. לאחר מכן, בשלב שני, תוך שימוש בכלי הניקוב, מכשיר אגרופים חור ברקמה מגוש התורם שנבחר באזור המבואר ואישר המדויק. אז ליבות מועברות מהתורם לבלוק הנמען.
  12. לאחר כ 500 ליבות, לנקות את כלי הקידוח וחבטות באמצעות ספוגית של קסילן.
  13. אם ליבות רקמה רצויה (ולא אגרופים לתוך ngTMA), לחץ על האפשרות "PCR" לבלוק, לאשר עד 4 הסברים ופגעו "התחל". זה אגרוף ולהעביר את הליבות לתוך צינור 0.2 מ"ל.
  14. נקודה חזור 4.9-4.11 עם בלוק התורם השני, וכן הלאה.
  15. לאחר שימוש בכל אבני התורם, להיכנס לסיבוב שני של בלוקים תורם (61-120) לmicroarray הרקמותאה ותמשיך לבצע צעדים 4.8-4.11.
  16. רענן תמונות תורם ולחסום נמען תוך התקדמות הפרויקט בזמן קידוח והניקוב מתרחשים (איור 5 ג).
  17. לבצע "יצוא" לאחר השלמת הפרויקט. אתר את קובץ .xslx עם תעודות הזהות של התורם ומקבל בלוק, הלוקליזציה של כל האגרופים בתוך TMA כמו גם פריסת TMA / העיצוב, בתיקייה מיוצאת. שמור את כל תמונות בלוק התורם עם כל הסברים על גבי כתמונות jpg בתיקייה מיוצאת (איור 5D). בלוק TMA הסופי הוא אז מוכן.

Representative Results

תכנון ועיצוב

הנה הדוגמא של 134 חולים עם סרטן מעי גס גרורתי, כי הם נחקרים בחשד לסדרה מסוימת של סמנים ביולוגיים הייתה בשימוש. לא רק ngTMA מתוכנן לחולים אלה, אך מיצוי DNA ואחריו ניתוח מוטאציות לכמה גנים שצוינו.

במהלך שלב תכנון ועיצוב של ngTMA, ההיבטים הבאים כבר החליטו. כל אחד מחולים, 6 אזורים היסטולוגית שונים ייחקרו: מרכז גידול, מול פלישת גידול, אזורים של גידול הצפוף ניצנים (גידול / stroma אינטראקציה), רקמה נורמלית, גרורות בלוטה לימפה וגרורות בכבד. שלושה כתמי גידול לאזור רקמת גידול ושני כתמים נורמלים רקמה הם להיכלל בפרויקט (n = 17 נקודות לחולה). מאז זה מתוכנן כי יותר מ -50 סמנים ביולוגיים להיחקר על חומר החולה הזה, שני עותקים של ngTMA הסופי רצויים. בשל גודלו הקטן האפשרי של בלוטה לימפה וdistanגרורות t, קוטר ליבה קטן של 0.6 מ"מ לבניית TMA לכל הרקמות נבחרה.

בנוסף, הוא מתוכנן כי כל אזור יהיה ערוך בנפרד, כך ש6 ngTMAs המכיל אזורים היסטולוגית שונים יופק: ngTMA המכיל רקמות ממרכז הגידול), ב) מול פלישה, אזורי ג) גידול ניצנים, ד) רקמה נורמלית , ה) גרורות בלוטות לימפה, וו) גרורות בכבד.

לעיצוב TMA באמצעות כלי 0.6 מ"מ, מרחק נוח של 0.4 מ"מ בין האגרופים ייבחר. בגלל ההערכה של נקודות רקמות בשורות ובטורים ארוכות היא לעתים קרובות מייגע, שני עיצובים שונים שנבחרו. עבור בלוקים גידול עם 3 אגרופים לכל אזור רקמה, עיצוב המכיל שישה חלקים נוצר. זה מוביל למספר כולל של 402 אגרופים רקמה. לאגרופי רקמה נורמלים, 2 אגרופים לכל מקרה יש לכלול. פריסה המתאימה 432 אגרופים בסך הכל נבחרה.

יתר על כן, לכל מקרה ומקרה, עד 4ליבות ב0.6 מ"מ תהיה בנוסף להיות חבטו החוצה והניחו לתוך 0.2 צינורות מ"ל. ליבות רקמות אלה תהיינה גם מבוארת.

לסיכום, 6 ngTMAs של רקמות שונות יופק (5 מערכי גידול x 3 אגרופים x 134 חולים; 1 מערך רקמות נורמלי x 2 אגרופים x 134 חולים) בנוסף ל4 ליבות לכל מטופל לצינורות. יחדיו, 2,814 הסברים ייעשו.

בשלב בא, שקופיות H & E המתאימות מחולים שנבחרו שנאספו מארכיון השקופיות. כל מקרה נבחן לזמן קצר על ידי פתולוג, ורוב שקופיות נציג של כל אחד מסוגי רקמות נבחרות.

סריקה

שקופיות דיגיטליות של כל סעיף היסטולוגית נעשות ליאור עתיד. לצורך המחקר, 3-4 שקופיות רקמה הן לסריקה בכל מקרה, כלומר, סרטן מעי גס ראשוני, עם או בלי רקמות סמוכות נורמליות, גרורות בלוטה לימפה וגרורות בכבד ואולי קון שקופית נוסףTaining רירית נורמלית.

ניתן לטעון עד 10 מגזינים שונים במלואו לתוך סורק השקופיות; לכן ניתן לסרוק 250 שקופיות בטווח אחת. זמן לסריקה ולגודל שקופיות דיגיטלי משתנה עם הממדים של הרקמות וגורם האיכות רצויה. טווחי גורם האיכות בין 0 ל 100. כאן, גורם איכות של 60 נבחר, שכן הוא מייצר גודל קובץ סריקה קטן יותר ללא אובדן ניכר של איכות סריקה. ניתן לסרוק בביופסיות קטנות מתחת 30 שניות בזמן שחלקים שלמות של רקמות, כמו אלה המשמשים בדוגמא זו עשויה להימשך בין 2 ו10 דקות. גודל שקופיות דיגיטלי יכול גם לנוע בין 2 MB 2 GB. שימוש בגורם איכות של 60, סורק בין 600 MB ו1 GB מיוצרים.

בין 402 ו536 שקופיות נדרשות לפרויקט זה בהיקף של 3 ריצות סריקה. כל ריצה מתבצעת בין לילה. כ 500 GB של שטח אחסון דרוש. שקופיות נסרקות ישירות על גבי פלטפורמה דיגיטלית בשם קייס מרכז (ngtma.unibe.pathcasecenter). מקרה המרכז הוא נגיש מכל מקום עם גישה לאינטרנט על ידי הזנת שם המשתמש וסיסמא הייעודיים.

ביאור

לביאור, שני היבטים יש לשקול: 1) יש לתת אזורי רקמות שונים בצבעים שונים וביאור 2) מספר ההסברים צריך לשקף את מספר העותקים הרצויים של ngTMA הסופי.

במקרה זה, 3 נקודות לאזור גידול לעותק יחיד שנבחרו. ל2 עותקים, כל אזור יש מבואר באמצעות 6 נקודות. השימושי הם בצבע ירוק לרקמות נורמליות, כחולים למרכז הגידול, צהובים לחזית פלישת גידול, אדומים לאזורים של גידול ניצני אינטראקציה (גידול / סטרומה), שחורה לגרורות בלוטה לימפה, טורקיז לגרורות מרוחקות ולבנה סוף סוף לאזורים להיות המשמש לצינורות. ביאור של כל מקרה ומקרה דורש 2-3 דק '.

בניית ngTMA

מחקר זה דורש 6 t לוקי ngTMAo יוקם ב2 עותקים, וכתוצאה מכך 12 לוקים סופיים. המספר המרבי של בלוקים נמען שיכול להיות נתמך על ידי arrayer הוא 12. כל בלוק גידול יכיל 402 כתמי רקמה וכל בלוק רקמה נורמלי יכיל 268 כתמים, בהיקף של 4,556 נקודות בכל הפרויקט.

פריסת TMA נוצרה עבור כל בלוק נמען והפרויקט נשמר (6A דמויות, 6B). ניתן לטעון 60 לוקי רקמה לתוך microarrayer הרקמה במקביל; תמונה של כל בלוק תורם נלקחה. החל מבלוק התורם הראשון, השקופיות הדיגיטליות המבואר המקבילות מאוחזר מקייס המרכז. התאמת שקופיות מתבצעת, אשר יכול לקחת בין 1-3 דק '. הסברים הם אישרו וarrayer מתבקש להתחיל חבטות (איור 7). זמן חבטות והעברת ליבה הוא כ 12 שניות. הפסד של ליבות במהלך הליך זה הוא מינימאלי. סה"כ זמן לarraying פרויקט זה הוא כ 24 שעות, כולל זמן לSLIדה / התאמת בלוק וטעה מחדש של המכשיר. כמה דוגמאות של ngTMA מומחשות ב8A איור. יכולות להיות גם חבטו החוצה ליבות לניתוח מולקולרי שלאחר מכן בשלב זה (איור 8 ב).

איור 1
איור 1 בלוק) 'תורם'. ליבות מגוש התורם חבטו החוצה ומועברות לתוך B) בלוק נמען, או microarray רקמות (TMA).

איור 2
איור 2 זרימת העבודה microarray רקמות הקונבנציונלית.) שקופיות היסטולוגית תאוחזרנה מהארכיון וארוחת בוקר) הניתן לf פתולוג או סקירה. הסברים CD) נעשים בשקופיות המציינות את האזור "המוערך" להעברה. E) בלוקים הרקמה המקביל תאוחזרנה. F) בלוק ושקופיות בהשוואה להתאמה, אשר יכולים G) לפעמים להיות משימה מאתגרת. HJ ליבות) microarraying רקמות ואז לוקח מקום. K) מועברות שוב ושוב וL) TMA סופי בנוי.

איור 3
איור 3) עד 25 שקופיות יכול להיות ממוקם בכל מגזין לסריקה. B) התאמות לגורם האיכות וגודל יכול להתבצע. ניתן לנטר את התקדמות סריקה.

"Src =" / קבצים / ftp_upload / 51893 / "width =" 51893fig4highres.jpg 600 "/>
ניתן להעלות שקופיות איור 4) סרוק על גבי הפלטפורמה מבוססת האינטרנט, Case המרכז. ב ') ניתן לצפות בשקופיות דיגיטליות. כלי ביאור TMA מאפשר למשתמש לבחור את גודל הליבה וצבע הנדרש להסברים. C) ניתן להציב הערות ישירות על גבי השקופיות הדיגיטליות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5) עד 60 לוקים יכול נטען לתוך microarrayer הרקמות, כלומר 10 לוקי תורם לשורה ו12 לוקי המקבלים כמו גם. B) תמונה של כל בלוק תורם נלקח, digitaאני מחליק מאוחזר. התאמה של בלוק ושקופיות נעשה וביאורים המשמשים לחבטות בלוק. C) ההתקדמות של arraying ניתן לנטר בזמן שמכשיר החבטות. ד) לאחר הניקוב מתבצע, יצוא של המיקום של כל נקודה בפריסה אבל גם תמונה של כל בלוק תורם עם ביאורים מקביל הוא עשה.

איור 6
איור 6. פריסות TMA אלו שמשו לarraying בלוקים) גידול וארוחת בוקר) ברקמות נורמליות.

איור 7
איור 7. מסך של תוכנת microarrayer הרקמה. משמאל, 12 מחדשניתן להציב בלוקים cipient במכשיר. בתחתית, תמונות של כל בלוק תורם נלקחות. במרכז, פריסת TMA, ההתקדמות של החבטות, כמו גם תמונות מוגדלות של כל בלוק תורם עם ביאורים נמצאת.

איור 8
איור 8) כמה דוגמאות של בלוקים ngTMA חדשים שנוצרו. B) אגרופים רקמות נוספים שניתן לנקוט לצורך הניתוח מולקולרי שלאחר מכן. ליבות אלה חבטו החוצה והניחו ב0.2 צינורות מ"ל.

איור 9
איור 9 דוגמאות של יישומי סמן ביולוגי ngTMA. מכתים) אימונוהיסטוכימיה של Ki67 בסרטן מעי גס. הכפול HEאימונוהיסטוכימיה R2 / באתר assay ההכלאה מראה B) ביטוי נמוך של חלבון (חום) ולא הגברה של גן Her2 (שחור) ביחס לcentromere (אדום); C) ביטוי גבוה של החלבון (חום) והגברת גן Her2 ( ) ביחס שחור לcentromere (אדום). D) Chromogenic הכלאה באתר של HER2 מראה תעתיקי mRNA בודדים בסרטן שד ngTMA. E) אימונוהיסטוכימיה לCD8 בסרטן מעי גס. F) כתם אימונוהיסטוכימיה זוגי לסמן הפאן cytokeratin AE1 / AE3 (חום; תאי גידול) וCD68 (אדום;. מקרופאגים) הדגשת microenvironment גידול בסרטן מעי גס, אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

במאמר זה, פרוטוקול לngTMA מתואר. ngTMA הוא מושג חדש שהוקם לmicroarraying הרקמה מעורב בתכנון ועיצוב, פתולוגיה הדיגיטלית וביאור שקופיות, כמו גם אוטומטי microarraying הרקמה 12.

בהשוואה לmicroarraying רקמה הקונבנציונלית, ngTMA מציע יתרונות רבים. בשלב ראשון, שלב תכנון והעיצוב הוא קריטי. הדגש הוא על מענה לשאלת מחקר ממוקד. זה צריך לקחת בחשבון את הנושאים היסטולוגית (למשל, שאזורים וכמה כתמים אני רוצה לכלול?), תכנון הסטטיסטי (למשל, גודל מדגם? כיצד לנתח הדגימות שלי מאוחר יותר?) ושיקולים לוגיסטיים (למשל, איך סמנים ביולוגיים רבים ולכן כמה עותקי ngTMA רבים?). NgTMA ספציפי הוא עשה עבור הצרכים ספציפיים, בין אם זה להקרנת סמן ביולוגי ותפוקה גבוהה או מיועד ללמוד היבטים היסטולוגית ספציפיים על רק cas נבחר גם כמהes.

אחת, אם לא, חסרון החשוב ביותר של microarraying רקמה הקונבנציונלית הוא הדיוק הנמוך שבה סימונים על השקופיות היסטולוגית נעשים. המחקר של ספציפיים מבנים, תאים או אזורים היסטולוגית נעשה כמעט בלתי אפשרי. ngTMA מאפשר רמת דיוק גבוהה, כי הסברים מונחים ישירות על השקופיות הדיגיטליות. זה מאפשר לחוקר לבחור דווקא האזורים לחטוף מכות, כולל תאים ספציפיים. בדוגמא זו, אזורים שונים בתוך אותו גוש הרקמה נחתכים החוצה לarraying, כגון מרכז הגידול, מול הפלישה ותחומים של אינטראקציה הגידול / stroma המודגש על ידי הנוכחות של צבירי תאים סרטניים קטנים או אפילו תאים בודדים. דיוק זו יכול להיות מושגת רק באמצעות ngTMA. שלישית, משום ששקופיות נסרקות על גבי פלטפורמה דיגיטלית מבוסס אינטרנט, החלק את הצפייה והוספת הערות יכולות להתבצע דרך המחשב ולא עם מיקרוסקופ. תוכנת arraying הרקמה מספקת ידידותי למשתמשממשק עם רמה גבוהה של גמישות, פריסות שונות ולכן ועיצוב ngTMA יכול להיות מושגת. מאז בניית TMA מתבצעת באופן אוטומטי על ידי קידוח, יש צורך קטן לידות על תמרון ואת משך זמן לבנייה מצטמצמת משמעותית. הזמן לבניית TMA בדוגמא כאן הוא בין 24 שעות. שימוש בגישה TMA קונבנציונלית והערכת 15 אגרופים לשעה, הפרויקט הזה היה לוקח כ 304 שעה.

יכול להיות מיושם ngTMA ללמוד ביטוי חלבון, mRNA או DNA, כמו גם שילובים של אלה. איור 9 ממחיש כמה של יישומים אלה לסמנים ביולוגיים פוטנציאליים. אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית יכולה להיות מיושמת על מנת לקבוע את מדד ההתפשטות של סרטן באמצעות קי 67. גישה משולבת לחקור ביטוי חלבון והגברת DNA לגנים כגון HER2 ניתן להשתמש. יכולות להיות שנאספו רקמות יחד על ngTMA אחד כדי להפחית את העלויות, שימוש ברקמות ומשאבים אחריםים. בנוסף, mRNA chromogenic הכלאה באתר לHER2 וגנים אחרים ניתן לבצע כדי לזהות תעתיקי mRNA בודדים במספר רב של מקרים תוך שימוש במספר מינימאלי של שקופיות רקמות. אימונוהיסטוכימיה של סמנים חיסוניים כגון CD8 ניתן דמיין בהקשר של microenvironment הגידול. גם אימונוהיסטוכימיה זוגית יכולה לשמש כדי להדגיש אזורים מסוימים של עניין, כגון יחסי גומלין בין תאי מערכת חיסון (שכותרת באדום) ותאים סרטניים (שכותרתו בחום) בחזית הפלישה של סרטן. כגון אזור של עניין לא ניתן היה נתפס באמצעות microarraying רקמה קונבנציונלית.

עם זאת, פרוטוקול זה מכיל כמה מגבלות. האתגר החשוב ביותר הוא החפיפה בין בלוק תורם ושקופיות דיגיטליות. מספר גורמים יכולים להשפיע על שלב זה. ראשית, הסעיף האחרון מהבלוק צריך לשמש לסריקת שקופיות. במקרים רבים, H & E היא לא החלק האחרון של בלוק תורם, rather זה immunohistochemical או אחר כתם. במקרה זה, גם שקופיות מוכתמות יכולות לשמש עוד ככתם האחרון נסרק ומבואר או H & E חדשים צריך להיעשות. צריכה גם להיזהר בעת סעיפי רקמות נעשים כרקמות עשויות להתרחב באמבט המים שמוביל להתאמה מאתגרת של שקופיות ובלוק. שנית, ברגע פרויקטים מוגבלים ללוקי TMA נמען 12 מעובד בכל פעם אחת. פרויקטים גדולים העולים על 12 TMAs יש להקצות לשם פרויקט שני. שלישית, בלוקים התורם חייבים להיעשות באמצעות תבניות סטנדרטי וקלטות כמכשיר לא יכול להתאים את עצמו לגדלים שונים. לבסוף, בלוקים תורם חייבים לעלות על הגובה המינימלי (4 מ"מ) כדי להשיג קידוח אופטימלי. בחלק מהמקרים, זה דורש reembedding של רקמות.

מאות פרסומים בשנים האחרונות להדגיש את TMA ככלי רב ערך למחקר סמן ביולוגי. TMAs היה בשימוש ללמוד ריאות 13, מעי גס 7, BREAST 14, ערמונית 15, לבלב 16, שלפוחית ​​השתן 17, ו18 סרטן הקיבה, עד כמה שם. מספר גדל והולך של סופרים שילבו השימוש בTMAs עם ניתוח תמונה וצעדים משמעותיים שנעשים בכיוון זה 19-21. עם זאת, לצד קומץ קבוצות מחקר שפרסמו את רעיונות TMA חדשניים 22-24, מעט תשומת לב ניתנה כדי לייעל את טכניקת TMA עצמו. microarrayers רקמה אוטומטית, כגון ATA-27 ידי Estigen / יצ'ר לעשות מספק עיצוב פריסה וחבטות רקמה רצויות ואוטומטיות. זה מייצג זאת היבט 1 בלבד של מושג ngTMA.

ngTMA הוא שיפור משמעותי על פני שיטות microarraying הרקמה קונבנציונליות. היא משלבת מומחיות בהיסטולוגיה ועיצוב TMA עם הגמישות של הפתולוגיה דיגיטלית והדיוק של הסברים דיגיטליים עם המהירות ואמינות של בניית TMA אוטומטית. השילוב של ngTMוניתוח תמונה להערכת סמנים ביולוגיים חלבון ומולקולרי יהיו כלי רב עוצמה כדי לשפר את איכות המחקר קליני וtranslational בעתיד עוד יותר.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לצוות הטכני של Translational יחידת המחקר; מרי Economou, José Galván, קרוליין האמר, דומיניק מילר, ליליאן Schöni והקבוצות מידענות במכון לפתולוגיה, האוניברסיטה ברן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pannoramic 250 Flash II 3DHistech Slide scanner
TMA Grandmaster 3DHistech Tissue Microarrayer
Pannoramic Viewer 3DHistech free Slide viewing software
Case Center 3DHistech Digital slide platform

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4, 844-847 (1998).
  2. Tzankov, A., Went, P., Zimpfer, A., Dirnhofer, S. Tissue microarray technology: principles, pitfalls and perspectives--lessons learned from hematological malignancies. Exp Gerontol. 40, 737-744 (2005).
  3. Barlund, M., et al. Detecting activation of ribosomal protein S6 kinase by complementary DNA and tissue microarray analysis. J Natl Cancer Inst. 92, 1252-1259 (2000).
  4. Bubendorf, L., et al. Survey of gene amplifications during prostate cancer progression by high-throughout fluorescence in situ hybridization on tissue microarrays. Cancer Res. 59, 803-806 (1999).
  5. Garcia-Caballero, T., et al. Dual-colour CISH is a reliable alternative to FISH for assessment of topoisomerase 2-alpha amplification in breast carcinomas. Breast Cancer Res Treat. 81-89 (2014).
  6. Schraml, P., et al. Tissue microarrays for gene amplification surveys in many different tumor types. Clin Cancer Res. 5, 1966-1975 (1999).
  7. Zlobec, I., et al. Role of RHAMM within the hierarchy of well-established prognostic factors in colorectal cancer. Gut. 57, 1413-1419 (2008).
  8. Hsu, F. D., et al. Tissue microarrays are an effective quality assurance tool for diagnostic immunohistochemistry. Mod Pathol. 15, 1374-1380 (2002).
  9. Marin, C., et al. Detection of BRAF p.V600E Mutations in Melanoma by Immunohistochemistry Has a Good Interobserver Reproducibility. Arch Pathol Lab Med. 71-75 (2014).
  10. Polley, M. Y., et al. An International Ki67 Reproducibility Study. J Natl Cancer Inst. 1897-1906 (2013).
  11. Zlobec, I., Terracciano, L., Jass, J. R., Lugli, A. Value of staining intensity in the interpretation of immunohistochemistry for tumor markers in colorectal cancer. Virchows Arch. 451, 763-769 (2007).
  12. Zlobec, I., Koelzer, V. H., Dawson, H., Perren, A., Lugli, A. Next-generation tissue microarray (ngTMA) increases the quality of biomarker studies: an example using CD3, CD8, and CD45RO in the tumor microenvironment of six different solid tumor types. J Transl Med. 11, 104 (2013).
  13. Yoshida, A., et al. Immunohistochemical detection of ROS1 is useful for identifying ROS1 rearrangements in lung cancers. Mod Pathol. 711-720 (2014).
  14. Droeser, R., et al. Differential pattern and prognostic significance of CD4+, FOXP3+ and IL-17+ tumor infiltrating lymphocytes in ductal and lobular breast cancers. BMC Cancer. 12, 134 (2012).
  15. Fleischmann, A., et al. Androgen receptors are differentially expressed in Gleason patterns of prostate cancer and down-regulated in matched lymph node metastases. Prostate. 71, 453-460 (2011).
  16. Wang, T., et al. Pattern of breast cancer susceptibility gene 1 expression is a potential prognostic biomarker in resectable pancreatic ductal adenocarcinoma. Pancreas. 42, 977-982 (2013).
  17. Fleischmann, A., Rotzer, D., Seiler, R., Studer, U. E., Thalmann, G. N. Her2 amplification is significantly more frequent in lymph node metastases from urothelial bladder cancer than in the primary tumours. Eur Urol. 60, 350-357 (2011).
  18. Zhang, Z. Q., et al. Identification of Annexin A1 protein expression in human gastric adenocarcinoma using proteomics and tissue microarray. World J Gastroenterol. 19, 7795-7803 (2013).
  19. Chaux, A., et al. The epidermal growth factor receptor is frequently overexpressed in penile squamous cell carcinomas: a tissue microarray and digital image analysis study of 112 cases. Hum Pathol. 44, 2690-2695 (2013).
  20. McKenna, S. J., Amaral, T., Akbar, S., Jordan, L., Thompson, A. Immunohistochemical analysis of breast tissue microarray images using contextual classifiers. J Pathol Inform. 4, S13 (2013).
  21. Pages, F., et al. Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer. N Engl J Med. 353, 2654-2666 (2005).
  22. Komiya, A., et al. Application of a new technique, spiral tissue microarrays constructed using needle biopsy specimens, to prostate cancer research. Int J Oncol. 44, 195-202 (2014).
  23. Quintayo, M. A., et al. Virtual tissue microarrays: A novel and viable approach to optimising tissue micro-arrays for biomarker research applied to Ductal Carcinoma in Situ (DCIS). Histopathology. 2-8 (2014).
  24. Torata, N., et al. Tissue tablet method: an efficient tissue banking procedure applicable to both molecular analysis and frozen tissue microarray. Hum Pathol. 45, 143-152 (2014).
פרוטוקול Microarray רקמות הדור הבא (ngTMA) לביומרקר לימודים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies. J. Vis. Exp. (91), e51893, doi:10.3791/51893 (2014).More

Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies. J. Vis. Exp. (91), e51893, doi:10.3791/51893 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter