Summary
We beschrijven hier een verbeterde werkwijze Luminescentie Resonance Energy Transfer (LRET) waarin we introduceren protease splitsingsplaats tussen de donor en acceptor fluorofoor sites. Deze modificatie kunnen wij specifieke LRET signalen die door membraaneiwitten plaats, waardoor de studie van membraaneiwitten zonder eiwitzuivering verkrijgen.
Abstract
Luminescentie Resonance Energy Transfer, of LRET, is een krachtige techniek die wordt gebruikt om afstanden tussen twee locaties in eiwitten binnen de afstand bereik van 10-100 een maatregel. Door het meten van de afstanden onder verschillende omstandigheden geligeerd kunnen conformatieveranderingen van het eiwit gemakkelijk worden bepaald. Met LRET, een lanthanide, meestal chelaat terbium wordt gebruikt als de donor fluorofoor, bieden voordelen zoals een langere only donor emissie levensduur, de flexibiliteit om meerdere acceptor fluoroforen gebruikt, en de mogelijkheid voor overgevoelige acceptor emissie detecteren als een makkelijke manier om energieoverdracht zonder het risico ook detecteren alleen donor-signaal te meten. Hier beschrijven we een werkwijze te gebruiken op LRET membraaneiwitten expressie gebracht en getest op het oppervlak van intacte zoogdiercellen. We introduceren een proteasesplitsingsplaats tussen de LRET fluorofoor paar. Na het verkrijgen van het oorspronkelijke signaal LRET splitsing op die plaats verwijdert het specifieke LRET signaal van het eiwit vanbelang waardoor we kwantitatief aftrekken van de achtergrond signaal dat overblijft na splitsing. Deze methode zorgt voor meer fysiologisch relevante metingen kunnen worden uitgevoerd zonder de noodzaak voor zuivering van eiwitten.
Introduction
Luminescentie Resonance Energy Transfer (LRET) is een afgeleide van de bekende Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) techniek 1. Vergelijkbaar met FRET kan LRET worden gebruikt om afstanden en veranderingen afstand tussen donor en acceptor fluoroforen aan specifieke plaatsen op het eiwit van belang in het traject van 10-100 A 1-3 meten. De principes van LRET zijn ook gelijkwaardig aan FRET doordat resonantie energieoverdracht plaatsvindt tussen twee proximale fluoroforen wanneer het emissiespectrum van de donor fluorofoor overlapt met het absorptiespectrum van de acceptor fluorofoor. De efficiëntie van deze overdracht is gerelateerd aan de afstand tussen de twee fluoroforen door de volgende vergelijking:
Eq. 1
waarbij R de afstand tussen de twee fluoroforen, E het rendement van engie-overdracht, en R 0, hieronder besproken, is de Förster straal voor de fluorofoor paar, dat wil zeggen de afstand waarop de efficiëntie van de overdracht is halfmaximale. Uit deze vergelijking kan men zien dat de efficiëntie is gerelateerd aan de grootte van de afstand verhoogd tot de inverse zesde macht 1. Hierdoor omgekeerde zesde macht afhankelijkheid waardoor FRET en LRET metingen uiterst gevoelig, zelfs voor kleine veranderingen afstand wanneer bij R 0 van het FRET paar. Het vermogen specifiek label gewenste plaatsen op eiwitten of andere macromoleculen kan men profiteren van deze gevoeligheid voor conformationele veranderingen volgen.
Vergeleken met FRET, die gebruikelijk organische kleurstofmoleculen gebruikt, LRET biedt extra voordelen. In LRET, in plaats van een organische kleurstof als de donor fluorofoor, een lanthanide serie kation typisch Tb 3 + of Eu3 + wordt gebruikt 1,4-6. Fluoroforen dat u vallennder categorie, bijvoorbeeld terbium chelaat, zijn ook zeer veelzijdig omdat ze kunnen worden gebruikt met een uitgebreide lijst van acceptor fluoroforen. Deze flexibiliteit is mogelijk omdat de emissiespectra van chelaten lanthaniden meerdere scherpe emissiepieken bevatten, waardoor een enkele soort donor fluorofoor te gebruiken met een van een groot aantal acceptor fluoroforen. Zo kan gesensibiliseerd acceptor emissie worden waargenomen, zonder enige vrees voor besmetting door-bloeding van donor emissie 5. De experimentator selecteert de specifieke acceptor gebaseerd op de verwachte afstand tussen de twee fluoroforen (Figuur 1 en Tabel 1). In deze lanthanide chelaat fluoroforen, is het metaalion gechelateerd door een molecuul dat een antenne groep die de normaal slecht absorberende lanthanide sensibiliseert zo goed excitatie een bioreactieve functionele groep om het ion tether een specifieke functionele groep op de 1 macromolecuul bevat, 5,6. Once opgewonden, lanthaniden ontspannen naar de grondtoestand door het vrijgeven van fotonen met een vervalsnelheid in milliseconden. Omdat het verval is noch een singlet-to-singlet ontspanning noch een triplet-to-singlet ontspanning, de emissie van fotonen kunnen niet goed worden fluorescentie of fosforescentie genoemd, maar is meer goed genoemd luminescentie 1. De lange verval van lanthanide luminescentie helpt enorm in leven metingen. Lifetime metingen kunnen vervolgens worden gebruikt om de efficiëntie via de volgende relatie te bepalen:
Eq. 2
waar, E is de efficiëntie van de overdracht, τ D is de levensduur van de donor (gecheleerde lanthanide) wanneer die niet deelnemen aan de energie-overdracht, en τ DA is de levensduur van de donor bij deelname aan de energie-overdracht met de acceptor. Met LRET, τ DA kan aldus worden gemeten als de levensduur van de gevoelige acceptor emissie omdat de levensduur terbium is zo veel groter dan een organische acceptorfluorofoor. De acceptor stoot met dezelfde levensduur als de aanzetten tot excitatie (donor lanthanide), en de eventuele bijdrage aan de levensduur van de acceptant eigen intrinsieke fluorescentie levensduur is relatief verwaarloosbaar. Door meting van de gesensibiliseerde emissie plaats donor emissie ook overbodig etikettering zorgen precies een 1: 1 verhouding van donor acceptor. Eiwitten kunnen in plaats daarvan gelijktijdig worden gemerkt met zowel acceptor en donor fluoroforen. Een heterogeen label bevolking zal leiden, maar dubbel-donor gelabelde eiwitten zal niet uitzenden in de acceptor golflengte en double-acceptor gelabelde eiwitten zullen niet enthousiast zijn. Bovendien dient de afstand tussen fluoroforen hetzelfde zijn, ongeacht welke cysteïne ter een gegeven fluorofoor hecht aan, vooral bij gebruik van de isotrope lanthaniden als donor, zodat de need naar een bepaalde site om ofwel de donor of acceptor is onnodig te specificeren. Intensiteit kan worden beïnvloed met een heterogene populatie, maar moet nog steeds ruim voldoende detecteerbaar zijn.
Bij het plannen experimenten, moet de keuze van fluoroforen worden gedicteerd door de R 0 waarde van het paar en het verwachte bereik afstand wordt gemeten. De R waarde 0 wordt gedefinieerd door de volgende vergelijking:
Eq. 3
wanneer R 0 het Förster radius in Angstrom, κ 2 de oriëntatie factor tussen de twee kleurstoffen (gewoonlijk aangenomen dat 2/3), φ D is de quantumopbrengst van de donor, J de spectrale overlap integraal tussen de donor emissiespectrum en de acceptant absorptie spectrum in M - 1cm -1 nm 4, en n de brekingsindex van het medium 1.
Ons laboratorium heeft een wijziging van de gebruikelijke techniek LRET toegevoegd door invoeging van een protease herkenningsplaats tussen de donor en acceptor label plaatsen op het eiwit wordt gesondeerd. Deze modificatie maakt onderzoek niet gezuiverde systemen als geheel zoogdiercellen 7. Deze techniek is bijzonder nuttig bij het gebruik cysteïnen als gebieden te kenmerken, aangezien het proces van labeling met maleïmide geconjugeerd kleurstoffen die binden aan cysteine sulfhydryl groepen, andere eiwitten op de cellen die moeten cysteïnen zijn ook gelabeld. Echter, door op protease splitsingsplaatsen op het eiwit van interesse en meten levensduur voor en na splitsing, de experimentator kan kwantitatief aftrekken van de achtergrond signaal nadat protease klieving van het grove signaal. Dit aftrekken isoleert het signaal gevolg van het eiwit van belang (Figure 2). Met de hierboven beschreven modificatie kan LRET worden om veranderingen afstand tussen de terbium chelaat donor en acceptor probe een eiwit meten toe te zien conformationele veranderingen in het eiwit dichtbij fysiologische toestand zonder de noodzaak voor zuivering.
Figuur 1.Het absorptie en emissie spectra van gecheleerd terbium in zwart, en een vertegenwoordiger acceptor, Alexa 488, in rood. Merk de meervoudige emissiepieken en scherpe, smalle emissiebereik voor elke piek van terbium chelaat. Dit patroon maakt terbium te gebruiken met verschillende acceptor fluoroforen en vergemakkelijkt de meting van gesensibiliseerde emissie binnen deze trajecten waar terbium vertoont geen emissie. Terbium's emissie piek bij 486 nm overlapt heel goed met de een bsorption piek van Alexa 488, waardoor resonantie energieoverdracht plaatsvindt tussen de twee fluoroforen. Een golflengte van 515 nm is een uitstekende keuze om gesensibiliseerd uitstoot te detecteren voor dit pair zoals het is in het dal tussen de terbium uitstoot pieken, en heel dicht Alexa 488's emissie piek van 520 nm. Let op dat in de buurt van de acceptor piek, hoewel wenselijk, niet noodzakelijk 565 nm nog kan Alexa 488 emissie detecteren, zonder ook het detecteren terbium emissie.
| Acceptorfluorofoor | R 0 (a) | Emissie golflengte (nm) |
| Atto 465 | 36 | 3px; "> 508|
| Fluoresceïne | 45 | 515 |
| Alexa 488 | 46 | 515 |
| Alexa 680 | 52 | 700 |
| Alexa 594 | 53 | 630 |
| Alexa 555 | 65 | 565 | 65 | 575 |
Tabel 1: Een overzicht van de meest gebruikte acceptorfluoroforen voor LRET gebruik terbium chelaat als de donor 11. De R 0-waarden werden gemeten wanneer de donor en acceptor werd aan de oplosbare agonist bindend domein van AMPA receptoren. Het is ideaal om de R 0 waarde opnieuw te meten voor elke nieuwe systeem wordt bestudeerd.
Figuur 2 een overzicht van de LRET methode gepresenteerd. (A) De AMPA receptor is een membraaneiwit dat conformationele veranderingen na ligandbinding ondergaat. De clamshell-vormige ligand-binding domein is hier rood omcirkeld. (B) Het ligandbindende gebied van AMPA wanneer niet gebonden aan eiwitten bekend in een open conformatie (links). Wanneer gebonden aan glutamaat ligand, het eiwit sluit rond de ligand (rechts). Door fluoroforen bewijskracht te plaatsen op het LBD, kan de aard van deze conformationele verandering gezien als de afstand tussen de fluoroforen veranderingen, die vervolgens invloed fluorescentie levensduur. (C) Etiketten gehele cellen, labeling van zowel het eiwit van belang en achtergrond membraaneiwitten kan (links) optreden. Na protease splitsing, zal LRET signaal van het eiwit van interesse verdwijnen door het vrijkomen van een oplosbaar fragment, waardoor achtergrondsignaal intact (rechts). Dit achtergrondsignaal kan vervolgens worden afgetrokken van het grove signaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Maak de construct, die het eiwit van belang
Kloon het gen tot expressie van het eiwit van belang in een geschikte vector. Gebruik vectoren zoals pcDNA series of pRK5 zoals ze zijn geschikt voor expressie in zoogdierlijke systemen zoals HEK293 en CHO-cellen.
2 Selecteer de sites op het eiwit te worden gelabeld met de Fluoroforen
- Kies labeling sites die zij mogelijke conformationele veranderingen in het eiwit weerspiegelen. Indien mogelijk, gebruik maken van een kristalstructuur van het eiwit of van een homologe eiwit om te helpen deze bepaling. Als er geen kristalstructuur, gebruik online software om de mogelijke structuur van het eiwit te voorspellen en derhalve ontvang inzicht in geschikte locaties.
- Kies residuen dat de zijketens van de geselecteerde residuen blootgestelde oppervlak en toegankelijk voor de fluoroforen zodat het eiwit worden gemerkt.
- Kies residuen diezijn niet kritisch voor eiwitfunctie, bijvoorbeeld gebieden die niet betrokken zijn bij ligand binding.
- Bij de invoering van cysteïne mutatie, de voorkeur geven aan sites die vergelijkbaar zijn, bijvoorbeeld serine, dat zou leiden tot minimale verstoring van de eiwitstructuur.
- Na het kiezen van het etiket plaatsen maken de mutaties te zorgen dat het eiwit geeft enige LRET uit deze bestemd sites. Gebruik standaard plaatsgerichte mutagenese protocollen weg muteren niet-disulfide-gebonden cysteïnen die zouden kunnen binden aan fluorescentielabels-maleïmide geconjugeerd. Niet weg muteren disulfide-gebonden cysteïnen en begraven vrije cysteïnen omdat zij niet reageren met fluorescente kleurstoffen in de gevouwen vorm van het eiwit.
- Breng cysteïneresten in de gewenste plaatsen door puntmutaties middels standaard plaatsgerichte mutagenese protocollen.
- Neem een protease splitsingsplaats die specifiek kunnen splitsen van een van de cysteïnen van het eiwit. Indien deeiwitsequentie toelaat, voeren de site van conservatief muteren van het eiwit aan een trombine hebben (herkenningssequentie LVPRGS) of Factor Xa (herkenningssequentie IDGR of IEGR) sequentie nabij het opgenomen cysteïne en toegankelijk voor splitsing protease; anders de tetra- of hexa-peptide sequentie kan worden ingebracht als geheel. Kies de locatie zodanig dat bij splitsing een van de ingevoerde cysteïnen dissocieert van de rest van het proteïne in sommige gevallen, kan twee splitsingsplaatsen flankeren gemuteerd cysteïne vereist.
3 Test de Expression en de functionaliteit van het eiwit
- Voer een western blot voor expressie van het gemuteerde eiwit te bevestigen.
- Voer een functionele test van het eiwit dat de mutaties de eiwitfunctie veranderd slechts minimaal, of helemaal te vermijden bestuderen conformatieveranderingen van een disfunctioneel proteïne.
OPMERKING: Aangezien alle eiwitten hebben verschillende functies, is er geen enkele f unctional assay die specifiek is voor LRET; Sommige voorbeelden van functionele assays omvatten assays voor enzymactiviteit enzymen, ligand-bindingstesten voor Receptoren en elektrofysiologische studies ionkanalen.
4 Selecteer de Fluoroforen worden gebruikt
Select fluoroforen gebaseerd op de verwachte bereik afstand wordt gemeten, zodat het traject tussen 0.5-1x de R 0 van de fluorofoor paar.
Opmerking: Dit maakt een eenvoudiger aftrekken van de achtergrond, dat typisch veel langere levensduur. Bijvoorbeeld, als het verwachte bereik afstand wordt gemeten ongeveer 35 Å, een geschikte fluorofoor paar te gebruiken zou terbium chelaat als donor en Alexa 594 als acceptor, omdat de R 0 voor dit pair 53 Å (tabel 1).
5 Druk de Protein door transiënte transfectie van de benodigde hoeveelheid van zoogdiercellen
ntent "> tijdelijk transfecteren het eiwit van belang in het gekozen zoogdiercellen met een van de gemeenschappelijke transfectie reagens typisch gebruik van vier 10-cm schalen per LRET experiment HEK en CHO cellijnen,. maar Dit bedrag kan variëren naargelang eiwitexpressie , stabiliteit, enzovoort. Laat de cellen om het eiwit tot expressie 36-48 uur voor de oogst.6 Label de Eiwitten
- Maak cellen van de kweekschaal. Trek HEK cellen door simpelweg pipetteren buffer tegen de bodem van de schaal. Los CHO-cellen met een cel schraper, het wassen van het materiaal af met extracellulaire buffer.
- Verzamel de cellen door centrifugatie bij 1100 g gedurende 3 minuten. Gebruik dezelfde centrifuge instellingen verzamelen cellen na labeling, en na de daaropvolgende wasbehandelingen.
- Suspendeer cellen in 3 ml extracellulair buffer, voeg donor en acceptor fluoroforen in equimolaire hoeveelheden tot een eindconcentratie van 100-300 nM. Incubeer op een rotator fof 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was deze gelabelde cellen 3-4x met extracellulaire buffer om ongebonden fluoroforen verwijderen en schorsen deze cellen in extracellulaire buffer (meestal 2 ml) voor LRET meting.
- Als controle label een aparte reeks cellen met slechts donorfluorofoor (terbium chelaat) zonder toevoeging van enige acceptor fluorofoor.
Opmerking gegevens uit deze experimenten alleen donor moet analye. Deze experimenten kunnen worden uitgevoerd op dezelfde of verschillende dagen. - Ook voeren validatie, ditmaal met gemerkte mutant eiwit, zoals het etiket werkwijze kan ook interfereren met de functie afhankelijk van de plaats die voor labeling.
Opmerking: Deze experimenten kunnen worden uitgevoerd op dezelfde of verschillende dagen.
7 Stel de LRET Experiment
- Plaats de cellen geresuspendeerd in een kwarts cuvet met een minimum volume van 1 ml.
- Zet de computer en het instrument en stel de parameters van de DAT-een acquisitie programma dienovereenkomstig.
- Stel de golflengte van de absorptie bereik van de donorfluorofoor (330-340 nm goed werkt voor terbium chelaat).
- Stel de emissie golflengte adequaat, in gedachten houden dat de acceptor emissie varieert op basis van de acceptor gebruikt. Belangrijker is, selecteert u een detectiegolflengte dat alleen de acceptor emissie meet en bevat geen door-bloeding van de emissie van de donor. Gebruik bijvoorbeeld een golflengte van 565 nm voor Alexa 555 als acceptor Tabel 1. Alleen voor donor-metingen, waarbij eiwit werd aangemerkt met alleen donor, maar zonder acceptor, gebruik dan een golflengte van 545 nm voor het meten van terbium chelaat emissie.
- Stel de lengte van de emissie-detectie om minstens drie keer de verwachte LRET leven zijn om ervoor te zorgen dat een lange levensduur component niet gemist zal worden.
- Voer de scan. Laat minstens drie scans van 99 sweeps om de consistentie van de resultaten te garanderen. Spaar the resultaten als een tekstbestand (* txt).
- Om conformatieveranderingen van een eiwit met betrekking tot verschillende omstandigheden (zoals de toevoeging van een ligand) te meten, veranderen deze omstandigheden en steeds ten minste drie scans van 99 zwaaien per uitvoeren op hetzelfde monster onder deze nieuwe voorwaarde. Bij het bestuderen van de effecten van glutamaat op de conformatie van glutamaatreceptoren, bijvoorbeeld glutamaat voeg 1 mM tot hetzelfde monster gescand in stap 7.3, en scan daarna.
- Voeg maximaal vijf eenheden van de geschikte protease en neem scans voortdurend tot splitsing is voltooid en er geen verdere verandering is te zien in het leven van drie opeenvolgende scans. Meestal splitsing voltooid in twee tot 3 uur. Als een factor Xa splitsingsplaats wordt gebruikt voor protease splitsing bijvoorbeeld voeg 3 ui van factor Xa aan het monster, en scan elke 30 min gedurende 3 uur.
8 Analyseren van de gegevens die zijn verkregen
- Open de data-analyse software.
- Laad de fluorescentielevensduurgegevens met behulp van Import ASCII om de tekstbestanden te openen. Laad alle replicaten en de uiteindelijke achtergrond metingen in een bestand.
- Middel de gegevens van alle scans voor elke experimentele conditie het uiteindelijke gegevens krijgen. Om dit te doen, selecteert u de kolommen die de individuele proeven bevatten, dan onder het menu Data in de menubalk, klik op Statistieken over Rijen naar de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de proeven, evenals de standaarddeviatie en standaardfout weer.
- Zet de gemiddelde waarden in een lijngrafiek met fluorescentie-intensiteit op de Y-as en de levensduur in microseconden op de X-as naar een curve die de levensduur van de gesensibiliseerde emissie van de acceptor voorstelt creëren. Wijzig de Y-as van de grafiek een logaritmische schaal, om een betere visualisatie van de data.
- Herhaal stap 8.3 op de achtergrond meetgegevens, het gemiddelde van de laatste scans die overlap vertonen wijst op een volledige splitsing.
- Geef het gemiddelde achtergrond gegevens over dehetzelfde perceel dat de gemiddelde ruwe data bevat. Om dit te doen, opent u het dialoogvenster Laagbeheer vinden onder het menu Plot. Dan, de overdracht van de gegevens die de achtergrond betekenen in de lijst van Layer Contents.
- Lijn de gemiddelde achtergrond gegevens naar de gemiddelde ruwe data. Om dit te doen, gebruik dan de Simple Math functie onder het menu Math te vermenigvuldigen of delen van de achtergrond gegevens zonodig om de staart van de achtergrond overlapt met de staart van de ruwe data.
Opmerking: In dit staart, de levensduur van het eiwit van belang moeten al helemaal vervallen veranderen; wat uitgelijnd eenvoudig de achtergrond signaal voor en na protease splitsing. - Trek de lijn achtergrond signaal van de eerste ruwe LRET signaal, opnieuw met behulp van de Simple Math functie.
- Monteer de data van een exponentiële verval (enkelvoudige of meervoudige exponenten, afhankelijk van de sites en proefopzet).
- Stel de start grens voor de montage te beginnen na het eindevan de laserpuls. Gebruik dezelfde startpunt voor alle volgende curve fittingen.
- In het selecteren Fitting Function dialoogvenster kiest exponentiële verval teneinde de levensduur past de volgende vergelijking voor een exponentieel verval:
Eq. 4
waar y staat voor de fluorescentie-intensiteit, y 0 de achtergrondintensiteit door lawaai van het systeem A1 is de signaalintensiteit, t is de fluorescentie levensduur, x is de tijd en x 0 is de tijdverschuiving. - Fix x 0-0, start de montage-functie, en past de gegevens.
OPMERKING: Als het experiment is ontworpen om signalen hebben slechts van een paar van de sites, moet de resulterende data past gemakkelijk door een enkele exponentiële verval 8 zijn. Het residu van de pasvorm is een goede methode om de goedheid van de fit te bepalen en of er extra verval levens zijn required.
- Met de verkregen gegevens levens om de afstand tussen fluoroforen met de Förster vergelijking (een herschikking van de vergelijkingen 1 en 2 hierboven) te berekenen:
Eq. 5
NB: alle variabelen zijn zoals hierboven vermeld met τ DA te zijn gemeten als de acceptor gesensibiliseerde emissie levensduur. Verdere details en voorbeelden op metingen van R 0 en R kan elders 7,9,10 te vinden. - Herhaal het experiment en gegevensanalyse minstens drie keer om reproduceerbaarheid te waarborgen. Inconsistentie tussen individuele herhalingen van dezelfde meting vraagtekens bij de validiteit van de gegevens; Gebruik extra controle-experimenten of herhalingen. Bereken fouten in de meting met behulp van de gratis Gustaaf Foutenanalyse rekenmachine (ontwikkeld door Dr Thomas Huber) of een soortgelijk systeem dat de fout zich voortplant in depast van de levensduur.
Eq. 4 
Eq. 5 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een succesvolle LRET meting met een lanthanide donor moet een donor hebben slechts leven in de milliseconde tijd bereik. De levensduur van de gesensibiliseerde emissie LRET voor het eiwit gemerkt met zowel de donor en de acceptor is bijzonder korter, met een levensduur in het bereik microseconde na achtergrond aftrek Figuur 3. Protease splitsing resulteert in een toename van de levensduur die stabiel moeten worden in de tijd ( dat wil zeggen niet meer veranderen), waaruit blijkt dat de protease-splitsing is voltooid Figuur 4. Indien de LRET signaal komt van slechts een set van de sites, moet de resulterende emissie leven na aftrek van de achtergrond een enkele exponentiële levensduur te geven.
Bij het meten van conformatieveranderingen dient de specifieke LRET signaal een verandering in leven buiten de fout van de meting Figuur 3 tonen. De fout van de meting kan worden berekend door de voortplanting van de fouts in verband met de pasvorm van de levens. Na montage van de gegevens aan het minimum aantal exponentieel verval functies in vergelijking 4, de levensduur τ beschreven, worden bepaald. Met vergelijking 5, kan de donor-acceptor en donor levensduren alleen worden gebruikt samen met de R 0 waarde voor de LRET pair de afstand tussen de twee fluoroforen berekend onder de geteste omstandigheden. Betreffende de verandering afstanden als gevolg van het veranderen van deze voorwaarden de algemene structuur en functie van het eiwit is nu de taak van de experimentator.
Figuur 3 LRET metingen van de Acid-Sensing Ion Channel 1a (ASIC1a). De fluorescentie-intensiteit werd uitgezet op een logaritmische schaal het gemak visuele interpretatie te verbeteren. (A) alleen-Donor monsters een single-eXponential verval dat niet verandert met de pH. (B) In donor-acceptor gelabelde monsters, wordt een vermindering van de levensduur van de gesensibiliseerde emissie zien tot een verlaging van pH 8-6 (zwart of rood). Deze levensduur daling wijst op een afname in de afstand tussen de vinger en duim-domeinen van ASIC1a. Dit cijfer is gewijzigd van Ramaswamy, et al, 2013 8.
Figuur 4 Het effect van achtergrond aftrek op LRET meting aan de Acid Sensing Ion Channel 1a (ASIC1a). De plaatsen worden gemerkt door specifieke fluoroforen gescheiden worden door een protease splitsingsplaats. Na LRET metingen worden verricht, wordt de protease geïntroduceerd in de eiwitmonster en daaropvolgende splitsing van het eiwit van belang resulteert in een verlies van het signaal. Elke LRET die overblijftis achtergrondfluorescentie van fluoroforen zijn gebonden aan andere cysteïnen aanwezig op andere membraaneiwitten. Het aftrekken van deze achtergrond isoleert de ware LRET gegevens voor het eiwit van belang. Dit cijfer is gewijzigd van Ramaswamy, et al, 2013 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LRET is een techniek waarmee wetenschappers om afstanden te meten tussen domeinen in een enkel eiwit en tussen subeenheden in een multimeer eiwit. Als zodanig is LRET goed geschikt voor onderzoek van de conformationele veranderingen en dynamiek van eiwitten of andere macromoleculen. Het bovenstaande protocol moet het goed uitgerust lab veranderd kunnen testen hun hypotheses; Er zijn echter veel voorkomende foutenbronnen dat de nieuwe onderzoeker kan teisteren. Indien weinig of geen LRET signaal wordt gezien, controleer dan eerst de golflengte gebruikte instellingen. Excitatie moet in het bereik absorptie van terbium (330-340 nm). Voor donor alleen metingen, waarbij monster is aangemerkt met alleen donor fluorofoor en zonder acceptor fluorofoor, moet de emissie golflengte bij een van de in figuur 1 pieken, terwijl voor donor-acceptor metingen moet de emissiegolflengte de acceptor fluorofoor overeenkomen gebruikt Tabel 1. Indien de wavelength instellingen juist zijn, controleer de compatibiliteit van de buffers. Sommige fluoroforen mogelijk niet compatibel met bepaalde buffers of in bepaalde pH-reeksen zijn. Vervolgens zorgen dat de keuze van residuen en fluoroforen zijn compatibel. Als proefopzet volledig correct, dan is het probleem waarschijnlijk ligt hetzij de fluoroforen of het eiwit zelf. Na verloop van tijd kan voorraadoplossingen van fluoroforen afgebroken en kan leiden tot onvoldoende labeling. Tenslotte controleer expressie en functionaliteit van het eiwit. Veel mutaties zijn toegevoegd, zoals de invoering van cysteïnen, de verwijdering van natieve cysteïnes en de introductie van ten minste een protease-splitsingsplaats. Aldus is het mogelijk dat, zelfs onder normale omstandigheden transfectie, de geïntroduceerde mutaties destabiliseren het eiwit en veroorzaken onder-expressie van het eiwit van belang, het verlagen van het signaal waargenomen. Uitgedrukt kunnen de mutaties of etiket denaturatie van het eiwit veroorzaken, waardoor de resten anders worden geplaatstvan de verwachte afstand gezien in wildtype eiwit. Western blots kunnen worden gebruikt om expressie van het eiwit te verifiëren. Als er een vraag over de handel in een oppervlak membraaneiwit, biotinylatie van het celoppervlak en pull-down van het oppervlak blootgestelde eiwitten, gevolgd door een western blot voor het eiwit van belang, zal specifiek demonstreren oppervlak mensenhandel. Voor functionele tests, is er geen enkele assay om aan voor gebruik met LRET, aangezien LRET worden gebruikt op een grote verscheidenheid van eiwitten. Opnieuw echter, mogelijke voorbeelden van functionele testen omvatten enzymactiviteit assays, ligand-bindingstesten, en elektrofysiologische studies. Als eiwit expressie of functie is ook negatief beïnvloed door de geïntroduceerde mutaties, dan is de nieuwe etikettering locaties moeten worden gekozen.
Als een LRET signaal wordt gezien, maar kan niet worden gemonteerd door een enkele exponentiële wanneer een dergelijk resultaat wordt verwacht, controleer dan eerst of de achtergrond correct werd afgetrokken. Indien, after aftrekken, een multi-exponentiële afname gezien kan dit signaal een indicatie van LRET worden waargenomen uit andere dan bedoeld was meerdere interacties. Controleer of alle andere toegankelijke cysteinen zijn verwijderd uit het eiwit. Als een kristalstructuur beschikbaar is, zal het een zeer nuttig instrument om te controleren of deze cysteïnes zijn. Nogmaals, disulfide-gebonden en begraven, hoeft niet toegankelijk cysteïnen niet te worden gemuteerd weg. De ontoegankelijkheid van deze cysteinen testen of er een dwingende reden om niet te muteren ze weg, de invoering van een niet-inheemse cysteïne in het eiwit en het ervoor zorgen dat er geen LRET signaal in een donor-acceptor gelabelde monster. Als alle toegankelijke cysteïnen inderdaad zijn gemuteerd, en indien het proteïne meerdere subeenheden of deel uitmaakt van een complex, dan kan er storende LRET signaal door verven die bij deze nabijgelegen eiwitten of subeenheden zijn. Het kiezen van een andere proteasesplitsingsplaats kunnen helpen met deze problemen; anders, andere etikettering websites moet mogelijk worden gekozen. Tenslotte, als het probleem met fitting is een kwestie van signaal-ruis, het waarschijnlijke probleem is vanwege de lage expressie van het eiwit. Uitdrukking zal dan moeten worden geoptimaliseerd door middel van verschillende transfectie omstandigheden, een andere vector, etc.
Als de LRET metingen produceren een abnormaal of schijnbaar fysiek betekenisloos resultaat, kan er eiwit-specifieke zaken die niet direct voor de hand kan zijn. Bijvoorbeeld, met zuur-sensing ionkanalen, zelfs voorzichtige toevoeging van een zuur om de pH tot gevolg zou kunnen celdood en eiwitdenaturatie. Derhalve moeten meerdere monsters worden bereid, een voor elke pH te testen. Ook naast resonantie energieoverbrenging, lokale omgeving verandert een fluorescentiesignaal beïnvloeden. Een dergelijke wijziging, indien significant, zou worden opgemerkt in de enige donor meting als een dubbele of meervoudige exponentieel verval. In deze gevallen moeten de etikettering sites verschillende posities m te verplaatsenake dat de wijziging in de ofwel de spectrale eigenschappen van de fluoroforen niet veranderen.
Zelfs terwijl deze bronnen problemen in gedachten, zijn er enkele voorwaarden voor en beperkingen van LRET waarvan een experimentator moeten weten. Eerst conventionele labeling techniek voert etikettering cysteïneresten. Het benoemen van niet-specifieke residuen verminderen, zijn andere cysteïnen gewoonlijk gemuteerde uit; Deze werkwijze is niet altijd praktisch. Als bijvoorbeeld een eiwit vele niet-disulfide-gebonden cysteïnen natieve de structuur die essentieel structuur of functie van het eiwit Dan muteren ze onmogelijk zijn, aanzienlijke verhoging van de beperking van de techniek en de interpretatie van gegevens. Ook de LRET techniek is geschikt voor het detecteren van veranderingen in afstand, in plaats van absolute afstanden, zoals fouten op absolute afstand onder invloed van de oriëntatie factor κ 2 op de R 0 waarde waarschijnlijkin verandering afstand analyse te worden verlaagd omdat deze fouten invloed op de metingen onder alle omstandigheden gelijk. Alternatieve technieken kunnen worden gedaan om sommige van deze beperkingen te overwinnen. Bijvoorbeeld, niet te verhogen teveel cysteines kan men een His-tag aan en labelen met een fluorofoor gebonden aan nikkel-NTA. Ook kan natief tryptofaan worden gebruikt als een van de fluoroforen met dien verstande dat indien deze als donor, tryptofaan hebben een veel kleinere levensduur dan terbium, waardoor intensiteit gebaseerde metingen passender dan levensduur metingen. Indien nauwkeuriger atoom atoom afstanden vereist technieken zoals X-ray kristallografie, moleculaire dynamica, of NMR nog geschikter technieken om deze absolute afstanden krijgen.
Door zijn uitstekende gevoeligheid voor afstand, kan LRET veranderingen afstanden Angstrom niveau resolutie voor oplossing-fase-eiwitten te meten en kan experimentele gegevens zonder de noodzaak voor high-purity, isotopische etiketten of de grootte beperking dat zowel de NMR en moleculaire dynamica schaadt. Na het leren en beheersen van de techniek, kan onderzoeken in conformationele veranderingen van eiwitten veel sneller en met meer gemak dan reeds beschikbare conventionele technieken worden gedaan. LRET biedt ook een uitstekende basis voor verdere gespecialiseerde resonantie energieoverdracht technieken als single molecule FRET (smFRET), waarin de verdeling van de bevolking van de conformationele toestanden van individuele moleculen, in plaats van het ensemble gemiddelde kan onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grant GM094246, de American Heart Association Grant 11GRNT7890004, en de National Science Foundation Grant MCB-1110501.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate | Life Technologies | PV3579 | |
| Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide | Life Technologies | F-150 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide | Life Technologies | A-10254 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20346 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide | Life Technologies | A-10256 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20344 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| QuantaMaster 3-SS | Photon Technology International | Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the millisecond range | |
| FluoreScan 2.0 | Photon Technology International | Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument | |
| Origin 8.6 | OriginLab | Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software | |
| Quartz cuvette | Starna Cells, Inc | 3-Q-10 | |
| Stir bar | Bel-Art Products | F37119-0007 | Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette |
References
- Selvin, P. R. Principles and biophysical applications of lanthanide-based probes. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 275-302 (2002).
- Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 719-726 (1967).
- Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
- Selvin, P. R., Hearst, J. E. Luminescence energy transfer using a terbium chelate: improvements on fluorescence energy transfer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 10024-10028 (1994).
- Chen, J., Selvin, P. R. Thiol-reactive luminescent chelates of terbium and europium. Bioconjugate Chemistry. 10, 311-315 (1999).
- Ge, P., Selvin, P. R. Thiol-reactive luminescent lanthanide chelates: part 2. Bioconjugate Chemistry. 14, 870-876 (2003).
- Gonzalez, J., Rambhadran, A., Du, M., Jayaraman, V. LRET investigations of conformational changes in the ligand binding domain of a functional AMPA receptor. Biochemistry. 47, 10027-10032 (2008).
- Ramaswamy, S. S., Maclean, D. M., Gorfe, A. A., Jayaraman, V. Proton mediated conformational changes in an Acid Sensing Ion Channel. J. Bio. Chem. 288, (2013).
- Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. Conformational changes at the agonist binding domain of the N-methyl-D-aspartic acid receptor. The Journal of Biological Chemistry. 286, 16953-16957 (2011).
- Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. Subunit arrangement in N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. The Journal of Biological Chemistry. 285, 15296-15301 (2010).
- Kokko, T., Kokko, L., Soukka, T. Terbium(III) chelate as an efficient donor for multiple-wavelength fluorescent acceptors. Journal of Fluorescence. 19, 159-164 (2009).
