Summary
Nous décrivons ici une méthode améliorée Transfert Luminescence Resonance Energy (LRET) où nous introduisons un site de clivage de protéase entre les sites de fluorophores donneur et accepteur. Cette modification permet d'obtenir des signaux de LRET spécifiques découlant de protéines membranaires d'intérêt, ce qui permet l'étude de protéines de la membrane sans la purification des protéines.
Abstract
Transfert Luminescence Resonance Energy, ou LRET, est une technique puissante utilisée pour mesurer les distances entre deux sites dans les protéines dans la plage de distance de 10-100 Å. En mesurant les distances dans diverses conditions ligaturées, des changements conformationnels de la protéine peuvent être facilement évalués. Avec LRET, un lanthanide, le terbium plus souvent chélaté, est utilisé comme fluorophore donneur, offrant des avantages comme une durée de vie prolongée des donateurs seule émission, la possibilité d'utiliser plusieurs fluorophores accepteurs, et la possibilité de détecter sensibilisés émission accepteur comme un moyen facile pour mesurer le transfert d'énergie sans risque de détecter également le signal de donateurs seulement. Ici, nous décrivons une méthode pour utiliser LRET de protéines membranaires exprimés et testés sur la surface de cellules de mammifères intacts. Nous introduisons un site de clivage de protéase entre la paire de fluorophore LRET. Après l'obtention du signal d'origine LRET, le clivage en ce site élimine le signal de LRET spécifique de la protéine deintérêt qui nous permet de soustraire quantitativement le signal de fond qui reste après clivage. Cette méthode permet de plus physiologiquement mesures appropriées pour y être apportées sans la nécessité de purification de protéine.
Introduction
Transfert Luminescence Resonance Energy (LRET) est un dérivé de la technique 1 bien connu Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Similaires à FRET, LRET peut être utilisé pour mesurer les distances et les changements de distance entre les fluorophores donneur et accepteur attachés à des sites spécifiques sur la protéine d'intérêt dans la plage de 10 à 100 Å 3.1. Les principes de la LRET sont également similaires à FRET en ce que le transfert d'énergie de résonance se produit entre les deux fluorophores proximales quand le spectre d'émission du fluorophore donneur chevauche le spectre du fluorophore accepteur d'absorption. L'efficacité de ce transfert est liée à la distance entre les deux fluorophores par l'équation suivante:
Eq. 1
où R est la distance entre les deux fluorophores, E est l'efficacité de salleéner- transfert, et R 0, discuté ci-dessous, est le rayon de Förster pour la paire de fluorophore, c'est à dire la distance à laquelle l'efficacité de transfert est semi-maximale. A partir de cette équation, on peut voir que l'efficacité est liée à la grandeur de la distance élevée à la puissance six inverse 1. C'est cette sixième dépendance de la puissance inverse qui permet de FRET et les mesures de lRet être extrêmement sensible, même à de faibles variations de distance quand près de la R 0 de la paire FRET. La capacité d'étiqueter les sites désirés sur des protéines ou d'autres macromolécules permet de prendre avantage de cette sensibilité pour surveiller les changements de conformation.
Par rapport à FRET, qui utilise des molécules classiques de colorants organiques, LRET offre des avantages supplémentaires. Dans LRET, au lieu d'utiliser un colorant organique comme le fluorophore donneur, un cation de la série des lanthanides, typiquement Tb 3 + ou Eu 3 +, on utilise 1,4-6. Fluorophores u tombentelon cette catégorie, par exemple, un chelate de terbium, sont également très polyvalent en ce qu 'ils peuvent être utilisés avec une large gamme de fluorophores accepteurs. Cette flexibilité est rendue possible parce que les spectres d'émission des lanthanides chélatés contient de multiples pics d'émission tranchants, ce qui permet une seule espèce de fluorophore donneur pour être utilisé avec une grande variété de fluorophores accepteurs. Ainsi, l'émission de l'accepteur sensibilisés peut être détectée sans aucune crainte de contamination purge par du donneur émission 5. L'expérimentateur choisit l'accepteur spécifique sur la base de la distance attendue entre les deux fluorophores (Figure 1 et Tableau 1). Dans ces fluorophores lanthanides chélatés, l'ion métallique est chélaté par une molécule qui contient un groupe d'antennes qui sensibilise le lanthanide normalement peu absorbant à l'excitation ainsi qu'un groupe fonctionnel bioréactif pour attacher l'ion à un groupe fonctionnel spécifique de la macromolécule 1, 5,6. Once excité, lanthanides se détendre à l'état du sol par la libération de photons avec un taux de décroissance de l'ordre de la milliseconde. Parce que la décroissance n'est ni une relaxation singulet à singlet ni un triplet de détente à singulet, l'émission de photons peut pas correctement être appelé fluorescence ou phosphorescence, mais il est plus correct appelé luminescence 1. La longue décadence de lanthanides luminescence contribue grandement à des mesures de durée de vie. Les mesures de durée de vie peuvent ensuite être utilisées pour déterminer l'efficacité par la relation suivante:
Eq. 2
où E est l'efficacité du transfert, τ D est la durée de vie du donneur (lanthanide chélaté) lorsque ne participant pas au transfert d'énergie, et τ DA est la durée de vie du donneur en participant à un transfert d'énergie de l'accepteur. Avec LRET, τ DA peut aldonc être mesurée par la durée de vie de l'émission de l'accepteur sensibilisés parce que la durée de vie de terbium est d'autant plus grande qu'un fluorophore accepteur organique. L'accepteur émet avec la même durée de vie que son incitation excitation (donneur lanthanides), et une contribution à la vie de la propre vie de fluorescence intrinsèque de l'accepteur est relativement négligeable. En mesurant l'émission sensibilisés plutôt que l'émission des bailleurs de fonds, nous éliminons également la nécessité de garantir un étiquetage exactement un ratio de 1: 1 de donneur à accepteur. Les protéines peuvent être étiquetés au lieu simultanément avec les deux accepteur et fluorophores donneurs. Une population hétérogène marqué va entraîner, mais protéines marquées double donateurs n'émettra pas dans la longueur d'onde de l'accepteur et protéines marquées double-accepteur ne sera pas excité. En outre, la distance entre fluorophores devrait être la même, quelle que soit la cystéine place un fluorophore donné attache à, en particulier lors de l'utilisation des lanthanides isotropes comme un donneur, de sorte que le need pour spécifier un site donné pour recevoir soit le donneur ou accepteur est inutile. Intensité peut être affectée avec une population hétérogène, mais doit encore être plus que suffisant pour être détecté.
Lors de la planification d'expériences, le choix des fluorophores doit être dicté par la valeur de R 0 de la paire ainsi que la plage de distance étant mesurée attendue. La valeur de R 0 est défini par l'équation suivante:
Eq. 3
où, R 0 est le rayon de Förster en angströms, κ 2 est le facteur d'orientation entre les deux colorants (généralement supposés être 2/3), φ D est le rendement quantique du donneur, J est le chevauchement spectral intégrale entre le donateur spectre d'émission et le spectre d'absorption de l'accepteur à M - 1cm -1 nm 4, et n est l'indice de réfraction du milieu 1.
Notre laboratoire a ajouté une modification de la technique de la LRET classique par introduction d'un site de reconnaissance de protéase entre les sites donneurs et accepteurs d'étiquettes sur la protéine est sondé. Cette modification permet d'investigation dans les systèmes non purifiés tels que les cellules de mammifères entiers 7. Cette technique est particulièrement utile lors de l'utilisation en tant que sites cystéines pour l'étiquetage, étant donné que dans le procédé de marquage avec des colorants de maléimide conjugués qui se lient à des groupes sulfhydryle de cystéine, d'autres protéines sur les cellules qui possèdent des résidus cysteine sont aussi marquées. Toutefois, en incluant des sites de clivage de la protéase de la protéine d'intérêt et la mesure des durées de vie avant et après clivage, l'expérimentateur peut quantitativement soustraire le signal d'arrière-plan après le clivage de la protéase à partir du signal brut. Cette soustraction isole le signal spécifique découlant de la protéine d'intérêt (figureure 2). Utilisation de la modification décrite ci-dessus, LRET peut être utilisé pour mesurer les changements de distance entre le donneur de chélate de terbium, et la sonde à un accepteur de la protéine, et ainsi de surveiller les changements de conformation de l'état physiologique à proximité de la protéine sans la nécessité d'une purification.
Figure 1.Le spectres d'absorption et d'émission de terbium chélaté en noir, ainsi que d'un accepteur représentant, Alexa 488, en rouge. Notez les multiples pics d'émission et la forte, la gamme d'émission étroit pour chaque pic de terbium chélate. Ce schéma permet de terbium à être utilisé avec une variété de fluorophores accepteurs et facilite la mesure de l'émission sensibilisée à l'intérieur de ces gammes, où le terbium montre pas d'émission. Le pic d'émission de terbium à 486 nm recouvre assez bien avec l'un bsorption pic de l'Alexa 488, ce qui permet un transfert d'énergie de résonance de se produire entre les deux fluorophores. Une longueur d'onde de 515 nm est un excellent choix pour détecter l'émission sensibilisée pour cette paire comme il est dans la vallée entre les pics d'émission de terbium, et tout près de Alexa 488 émissions pic de 520 nm. Notez que pour près de la pointe de l'accepteur, bien que souhaitable, n'est pas nécessaire-565 nm est encore capable de détecter Alexa 488 émissions sans détecter aussi terbium émission.
| Fluorophore accepteur | R 0 (Å) | longueur d'onde d'émission (nm) |
| Atto 465 | 36 | 3px; "> 508|
| Fluorescéine | 45 | 515 |
| Alexa 488 | 46 | 515 |
| Alexa 680 | 52 | 700 |
| Alexa 594 | 53 | 630 |
| Alexa 555 | 65 | 565 | 65 | 575 |
Tableau 1 La liste des fluorophores accepteurs couramment utilisés pour LRET utilisant terbium chélate comme donneur 11. Les valeurs de R 0 sont mesurées lorsque le donneur et accepteur sont liés au domaine de liaison de l'agoniste des récepteurs AMPA soluble. Il est idéal pour mesurer la valeur R 0 nouveau pour chaque nouveau système étudié.
Figure 2: Une vue d'ensemble de la méthode de propagation à longue distance présenté. (A) Le récepteur AMPA est une protéine de membrane qui subit des changements conformationnels sur liaison de ligand. Le ligand bi-coque en forme dedomaine nding est entouré ici en rouge. (B) Le domaine de liaison au ligand de l'AMPA lorsqu'il n'est pas lié à la protéine existe dans une conformation ouverte (à gauche). Lorsqu'il est lié à un ligand glutamate, la protéine se ferme autour de son ligand (à droite). En plaçant des fluorophores dans les sites probants sur le LBD, la nature de ce changement de conformation peut être considérée comme la distance entre les fluorophores modifications, qui seront ensuite affecter la durée de vie de fluorescence. (C) Lorsque des cellules entières d'étiquetage, de marquage à la fois la protéine d'intérêt ainsi que les protéines de la membrane de fond peut se produire (à gauche). Après clivage de la protéase, le signal LRET de la protéine d'intérêt va disparaître en raison de la libération d'un fragment soluble, laissant intact le signal de fond (à droite). Ce signal d'arrière-plan peut alors être soustraite du signal brut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Créer la construction contenant la protéine d'intérêt
Cloner le gène exprimant la protéine d'intérêt dans un vecteur approprié. Utilisation des vecteurs tels que la série ou pcDNA pRK5 comme ils sont bien adaptés pour l'expression dans des systèmes de mammifères, comme les cellules HEK293 et CHO.
2 Sélectionnez les sites sur la protéine à être associés avec les fluorophores
- Choisir des sites d'étiquetage qui sont capables de réfléchir possibles changements conformationnels dans la protéine. Si possible, utiliser une structure cristalline de la protéine ou d'une protéine homologue pour aider à faire cette détermination. S'il n'y a pas de structure de cristal disponible, utiliser un logiciel en ligne pour prédire la structure possible de la protéine et donc de recevoir un aperçu des sites appropriés.
- Choisir les résidus tels que les chaînes latérales des résidus sont choisis surface exposée et accessible pour les fluorophores de sorte que la protéine peut être marquée.
- Choisir résidusne sont pas critiques pour la fonction des protéines, par exemple des sites qui ne sont pas impliquées dans la liaison du ligand.
- Dans l'introduction de la mutation de cysteine, donner la préférence à des sites qui sont similaires, par exemple la serine, qui pourraient causer une perturbation minimale de la structure de la protéine.
- Après avoir choisi les sites de marquage, faire des mutations de sorte que la protéine ne donne LRET destinés à partir de ces sites. Utiliser des protocoles de mutagenèse dirigée standard pour muter loin cystéines non-liaison disulfure qui pourraient se lier à maléimide conjugués des marqueurs fluorescents. Ne pas muter loin cystéines liaison disulfure et enterrés, cystéines libres, car ils ne doivent pas réagir avec des colorants fluorescents dans la forme repliée de la protéine.
- Introduire les résidus de cysteine dans les sites souhaités en faisant des mutations ponctuelles à l'aide de protocoles de mutagenèse dirigée standard.
- Inclure un site de clivage de la protéase qui peut cliver spécifiquement une des cystéines de la protéine. Si l'séquence protéique permet, d'introduire le site de la mutation conservative de la protéine à une thrombine (séquence de reconnaissance LVPRGS) ou le facteur Xa (IDGR de séquence de reconnaissance ou IEGR) à proximité de la séquence de cysteine introduit et accessible au clivage de la protéase; autrement la séquence tétra-ou hexa-peptide peut être introduit dans son ensemble. Choisir le site de telle sorte que lors du clivage de l'un des résidus cysteine introduits dissocie du reste de la protéine dans certains cas, cela peut nécessiter deux sites de clivage flanquant une cystéine mutée.
3 Testez l'expression et la fonctionnalité de la protéine
- Effectuer un transfert de Western pour confirmer l'expression de la protéine mutée.
- Effectuer un essai fonctionnel de la protéine de sorte que les mutations ont modifié la fonction de la protéine que très peu, voire pas du tout, d'éviter l'étude des changements conformationnels de la protéine dysfonctionnelle.
NOTE: Depuis toutes les protéines ont des fonctions différentes, il n'y a pas simple f test unctional qui est utilisé spécifiquement pour LRET; cependant, quelques exemples de dosages comprennent les dosages enzymatiques fonctionnelles d'activité pour des enzymes, des dosages de liaison de ligand pour des récepteurs, et des études électrophysiologiques de canaux ioniques.
4 Sélectionnez les fluorophores à être utilisé
Sélectionnez fluorophores sur la base de la plage de distance devrait être mesurés tels que la gamme se situe entre 0.5-1x la R 0 de la paire de fluorophore.
NOTE: Cela permet une soustraction plus facile de l'arrière-plan, ce qui a généralement beaucoup plus longues durées de vie. Par exemple, si la plage de distance attendue mesurée est d'environ 35 Å, une paire de fluorophore approprié d'utiliser serait chélate de terbium comme donneur et Alexa 594 comme accepteur, parce que le R 0 pour cette paire est de 53 Å (tableau 1).
5. exprimer la protéine par transitoirement transfection de la quantité requise de cellules de mammifères
ntent "> transfecter transitoirement la protéine d'intérêt dans les cellules de mammifères choisis à l'aide de l'un des réactifs de transfection communes Typiquement, utilisez quatre plats de 10 cm par expérience de propagation à longue distance pour les lignées cellulaires HEK et CHO;. Toutefois, ce montant peut varier en fonction de l'expression des protéines , la stabilité, etc. permettre aux cellules d'exprimer la protéine de 36 à 48 heures avant la récolte.6. Etiqueter les protéines
- Détacher les cellules de la boîte de culture. Détacher les cellules HEK par pipetage simplement tampon contre le fond de la boîte. Détacher les cellules CHO avec un racleur de cellules, de rincer les médias avec un tampon extracellulaire.
- Recueillir les cellules par centrifugation à 1 100 g pendant 3 min. Utilisez les mêmes paramètres de centrifugeuses pour la collecte de cellules après l'étiquetage, ainsi que, après les lavages suivants.
- Suspendre les cellules dans 3 ml de tampon extracellulaire, puis ajouter les fluorophores donneur et accepteur dans des quantités équimolaires jusqu'à une concentration finale de 100 à 300 nM. Incuber sur un agitateur fou 1 heure à température ambiante.
- Laver ces cellules marquées 3-4x avec un tampon extracellulaire de supprimer fluorophores non liés, puis suspendre ces cellules dans un tampon extracellulaire (généralement 2 ml) pour les mesures de lRet.
- Comme contrôle, identifier un ensemble séparé de cellules avec seulement fluorophore donneur (chélate de terbium) sans addition d'un quelconque fluorophore accepteur.
REMARQUE: Les données de ces expériences donateurs seule est nécessaire de compléter l'analyse. Ces expériences peuvent être réalisées sur les mêmes ou différents jours. - Encore une fois, procéder à la validation fonctionnelle, cette fois avec la protéine mutante marqué, comme le processus d'étiquetage peut également interférer avec la fonction selon le site utilisé pour le marquage.
NOTE: Ces expériences peuvent être réalisées sur les mêmes ou différents jours.
7 Mettre en place l'expérience de propagation à longue distance
- Placer les cellules remises en suspension dans une cuve en quartz avec un volume minimum de 1 ml.
- Allumez l'ordinateur et l'instrument et régler les paramètres de la datun programme d'acquisition en conséquence.
- Régler la longueur d'onde d'excitation de la gamme d'absorption du fluorophore donneur (330-340 nm fonctionne bien pour chélate de terbium).
- Réglez la longueur d'onde d'émission de façon appropriée, en gardant à l'esprit que l'émission de l'accepteur varie en fonction de l'accepteur utilisé. Surtout, sélectionnez une longueur d'onde de détection qui ne mesure que l'émission de l'accepteur et n'inclut aucune purge travers de l'émission du donneur. Par exemple, utiliser une longueur d'onde de 565 nm pour Alexa 555 comme accepteur Tableau 1. Pour les mesures de donateurs seule, dans laquelle la protéine a été marquée uniquement par le donneur, mais sans accepteur, utiliser une longueur d'onde de 545 nm pour la mesure de terbium chélate émission.
- Réglez la longueur de la détection d'émission soit au moins trois fois la durée de vie de LRET attendu à ce que des mesures à long durée de vie ne sera pas manquée.
- Effectuer l'analyse. Ne au moins trois scans de 99 balayages pour assurer la cohérence des résultats. Enregistrer eRésultats de la e sous forme de fichier texte (* txt).
- Pour mesurer les changements de conformation d'une protéine à l'égard de différentes conditions (comme l'ajout d'un ligand), modifier ces conditions et effectuer à nouveau au moins trois scans de 99 balayages chacun sur le même échantillon dans cette nouvelle condition. Si l'étude des effets du glutamate sur la conformation des récepteurs du glutamate, par exemple, ajouter glutamate à 1 mM dans le même échantillon numérisé à l'étape 7.3, puis relancez la numérisation.
- Ajouter jusqu'à cinq unités de la protéase appropriée et prendre analyses continuellement jusqu'à ce que le clivage est terminée et aucun autre changement est vu dans la vie de trois balayages successifs. Habituellement, le clivage est complet en deux à trois heures. Si un Xa site de clivage du facteur est utilisé pour clivage de la protéase, par exemple, ajouter 3 pi de facteur Xa à l'échantillon, et de numériser toutes les 30 minutes pendant 3 heures.
8 Analyser les données obtenues
- Ouvrir le logiciel d'analyse de données.
- Chargez la durée de vie de fluorescencedonnées à l'aide d'importation ASCII pour ouvrir les fichiers texte. Charger toutes les répétitions ainsi que les dernières mesures de fond, en un seul fichier.
- La moyenne des données de toutes les analyses pour chaque condition expérimentale pour obtenir les données finales. Pour ce faire, sélectionnez les colonnes qui contiennent les essais individuels, puis sous le menu Données dans la barre de menu, cliquez sur Statistiques sur les lignes pour afficher les intensités moyennes de fluorescence des essais, ainsi que l'écart type et l'erreur-type.
- Tracer les valeurs moyennes en tant que graphique linéaire avec l'intensité de fluorescence sur l'axe des ordonnées et la durée de vie en microsecondes sur l'axe des X pour créer une courbe qui représente la durée de vie de l'émission sensibilisée de l'accepteur. Changer l'axe Y de la parcelle à une échelle logarithmique, pour permettre une meilleure visualisation des données.
- Répétez l'étape 8.3 sur les données de mesure de référence, la moyenne des balayages finaux qui montrent un chevauchement indiquant le clivage complet.
- Afficher les données de base sur la moyennemême parcelle qui contient les données brutes en moyenne. Pour ce faire, ouvrez la boîte de dialogue Contrôle des couches se trouve sous le menu Plot. Ensuite, transférez les données contenant le fond signifie dans la liste des matières de la couche.
- Alignez les données de base moyenne des données brutes moyennes. Pour ce faire, utilisez la fonction mathématique simple dans le menu Math pour multiplier ou diviser les données de base selon les besoins jusqu'à la fin de la queue de l'arrière-plan se superpose à la fin de la queue des données brutes.
NOTE: En cette fin de queue, la durée de vie de la protéine d'intérêt aurait déjà complètement décru à; ce qui est alignée sur le fond est simplement le signal présent à la fois avant et après clivage par la protéase. - Soustraire le signal de fond aligné à partir du signal initial de LRET brut, de nouveau en utilisant la fonction mathématique simple.
- Monter les données à une décroissance exponentielle (exponentielles simples ou multiples, selon les sites et la conception expérimentale).
- Réglez la limite de début de mise en place pour commencer après la finde l'impulsion laser. Utilisez cette même startpoint pour tous les accessoires de la courbe ultérieures.
- Dans la boîte de dialogue de fonction d'ajustement Choisir, sélectionnez décroissance exponentielle de manière à s'adapter à la vie à l'équation suivante pour une seule décroissance exponentielle:
Eq. 4
où y représente l'intensité de fluorescence, y 0 représente l'intensité d'arrière-plan en raison du bruit du système, A 1 est l'intensité du signal, t est la durée de vie de fluorescence, x est le temps, et x 0 est le décalage de temps. - Fixer X 0 à 0, commencer la fonction d'ajustement, et ajuster les données.
REMARQUE: Si l'expérience est conçue pour avoir uniquement des signaux provenant d'une paire de sites, les données obtenues devraient facilement être adapté par une seule décroissance exponentielle 8. Le résidu de l'ajustement est une bonne méthode pour déterminer la qualité de l'ajustement et si la durée de vie de décroissance supplémentaires sont requiréd.
- Utiliser les durées de vie obtenues à partir des données pour calculer la distance entre les fluorophores à l'aide de l'équation de Förster (un réarrangement des équations 1 et 2 ci-dessus):
Eq. 5
NOTE: Toutes les variables sont comme mentionné ci-dessus avec τ DA ayant été mesurée comme la durée de vie accepteur d'émission sensibilisée. De plus amples détails et des exemples sur les mesures de R 0 et R peuvent être trouvés ailleurs 7,9,10. - Recommencer l'expérience et l'analyse de données d'au moins trois fois pour assurer la reproductibilité. Incohérence entre les répétitions individuelles de la même mesure remet en question la validité des données; utiliser des expériences de contrôle supplémentaires ou des répétitions. Calculer les erreurs de mesure grâce à la connexion Gustave analyse d'erreur calculatrice (mis au point par le Dr Thomas Huber) ou un système similaire qui se propage l'erreur dans lecrises de la vie.
Eq. 4 
Eq. 5 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Une mesure de la LRET succès avec un donneur de lanthanide doit avoir une durée de vie que donneur dans la plage de temps en millisecondes. La durée de vie d'émission de LRET sensibilisée pour la protéine marqué avec le donneur et l'accepteur seront notablement plus courte, avec une durée de vie de l'ordre de la microseconde après soustraction de fond Figure 3. Protéase résultats de clivage par une augmentation de la durée de vie qui doit devenir stable dans le temps ( c'est à dire plus le changement), ce qui montre que le clivage de la protéase est terminée Figure 4. Si le signal de LRET provient d'un seul ensemble de sites, la durée de vie d'émission résultant après soustraction de l'arrière-plan doit donner une durée de vie exponentielle unique.
Lors de la mesure des changements de conformation, le signal de LRET spécifique devrait montrer une variation de la durée de vie à l'extérieur de l'erreur de la mesure de la figure 3. L'erreur de mesure peut être calculée par la propagation de l'erreurs associée à l'ajustement de la durée de vie. Après avoir ajusté les données sur le nombre minimum de fonctions de décroissance exponentielles décrites dans l'équation 4, la durée de vie, τ, peut être déterminée. En utilisant l'équation 5, le donneur-accepteur et la durée de vie des bailleurs de fonds ne peuvent être utilisés avec la valeur R 0 pour la paire de propagation à longue distance pour calculer la distance entre les deux fluorophores dans les conditions testées. Liées au changement de la distance résultant de la modification de ces conditions à la structure générale et la fonction de la protéine est la tâche de l'expérimentateur.
Figure 3 mesures de lRet du Canal ionique 1a Acid-Sensing (ASIC1a). L'intensité de fluorescence a été tracée sur une échelle logarithmique pour améliorer la facilité d'interprétation visuelle. (A) des échantillons par les donateurs ne représentent qu'un seul Exponential décroissance qui ne change pas avec le pH. (B) Dans les échantillons marqués donneur-accepteur, une diminution de la durée de vie d'émission est considérée sensibilisée à une diminution du pH de 8 à 6 (noir au rouge). Cette diminution de la durée de vie indique une diminution de la distance entre les doigts et le pouce de domaines ASIC1a. Ce chiffre a été modifié depuis Ramaswamy, et al, 2013 8.
Figure 4 L'effet de la soustraction de fond sur des mesures effectuées sur des LRET le Canal ionique 1a Acid Sensing (ASIC1a). Les sites pour être spécifiquement marqué par des fluorophores sont séparés par un site de clivage de protéase. Après les mesures de LRET sont faits, la protease est introduit dans l'échantillon de protéine et le clivage ultérieur de la protéine de résultats d'intérêt dans une perte du signal spécifique. Toute LRET qui resteest la fluorescence de fond de fluorophores liés à d'autres cystéines présentes sur d'autres protéines membranaires. En soustrayant ce contexte isole les données de lRet vrai pour la protéine d'intérêt. Ce chiffre a été modifié depuis Ramaswamy, et al, 2013 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LRET est une technique puissante qui permet aux scientifiques de mesurer des distances entre des domaines au sein d'une seule protéine, ainsi qu'entre les sous-unités d'une protéine multimérique. En tant que tel, LRET est bien adapté à l'examen des changements de conformation et la dynamique des protéines ou d'autres macromolécules. Le protocole ci-dessus devrait permettre au laboratoire bien équipé pour tester facilement leurs hypothèses; Cependant, il existe de nombreuses sources d'erreurs qui peuvent harceler le nouvel enquêteur. Si peu ou pas de signal de propagation à longue distance est considérée, vérifiez d'abord les paramètres de longueur d'onde utilisée. L'excitation doit être comprise dans l'intervalle d'absorbance de terbium (330-340 nm). Pour donneurs seules les mesures, dans lequel l'échantillon a été marquée uniquement par le fluorophore donneur et sans fluorophore accepteur, la longueur d'onde d'émission doit être à l'un des sommets de la figure 1, tandis que pour les mesures donneur-accepteur, la longueur d'onde d'émission doit correspondre au fluorophore accepteur Le tableau 1 est utilisé. wavele Si l'paramètres ngth sont corrects, vérifier la compatibilité de tampons. Certains fluorophores peuvent ne pas être compatibles avec certains tampons ou dans certaines gammes de pH. Ensuite, assurez-vous que le choix des résidus et des fluorophores sont compatibles. Si la conception expérimentale est tout à fait correcte, alors le problème est probablement soit avec les fluorophores ou la protéine elle-même. Au fil du temps, des solutions mères de fluorophores peuvent se dégrader et peuvent entraîner étiquetage insuffisant. Enfin, vérifiez expression et la fonctionnalité de la protéine. Plusieurs mutations ont été ajoutés, y compris l'introduction de cysteines, la suppression des cystéines natives, et l'introduction d'au moins un site de clivage de protéase. Ainsi, il est possible que, même dans des conditions normales de transfection, les mutations introduites déstabiliser la protéine et de la cause sous-expression de la protéine d'intérêt, ce qui réduit le signal vu. Si exprimé, les mutations ou l'étiquetage peuvent provoquer la dénaturation de la protéine, ce qui provoque les résidus à être placé différemmentà partir des distances attendues observés dans la protéine de type sauvage. Western blots peuvent être utilisés pour vérifier l'expression de la protéine. Si vous avez des questions au sujet de la traite d'une protéine de membrane de surface, biotinylation de la surface de la cellule et déroulant des protéines exposées à la surface, suivi d'un Western blot pour la protéine d'intérêt, sera spécifiquement démontrer le trafic de surface. Pour les tests fonctionnels, il n'y a pas de test simple à recommander pour une utilisation spécifique avec LRET, depuis LRET peut être utilisé sur une grande variété de types de protéines. Encore une fois cependant, des exemples possibles de tests fonctionnels comprennent les dosages enzymatiques de l'activité, les dosages de liaison de ligand, et des études d'électrophysiologie. Si l'expression ou la fonction des protéines a été trop affectée par les mutations introduites, puis de nouveaux sites d'étiquetage doivent être choisis.
Si un signal de propagation à longue distance est considérée, mais ne peut pas être installé par une seule exponentielle quand un tel résultat est attendu, vérifiez d'abord que le fond a été soustrait correctement. Si, after la soustraction, une décroissance multi-exponentielle est vu, ce signal pourrait être une indication de propagation à longue distance étant observé de multiples interactions autres que ce qui était prévu. Assurez-vous que tous les autres cystéines accessibles ont été enlevés de la protéine. Si une structure cristalline est disponible, il sera un outil très utile pour vérifier ces cystéines. Encore une fois, le disulfure-collé et enterré, cystéines inaccessibles n'ont pas besoin d'être muté loin. Pour tester l'inaccessibilité de ces cystéines s'il ya une raison impérieuse de ne pas les muter loin, introduire une cystéine non-natif dans la protéine et s'assurer qu'il n'y a pas de signal de propagation à longue distance dans un échantillon étiqueté donneur-accepteur. Si tous les cystéines accessibles ont en effet été muté loin, et si la protéine a plusieurs sous-unités ou fait partie d'un complexe, il peut y avoir signal de propagation à longue distance de confusion en raison de teindre la fixation de ces protéines ou sous-unités voisines. Le choix d'un autre site de clivage de protéase peuvent aider à ces problèmes; sinon, autre site de l'étiquetages peuvent avoir besoin d'être choisi. Enfin, si la question de montage est tout simplement une question de rapport signal-bruit, le problème est probablement dû à une faible expression de la protéine. Expression devra ensuite être optimisé grâce à différentes conditions de transfection, un vecteur différent, etc.
Si les mesures de lRet produisent un résultat anormal ou apparemment physiquement sens, il peut y avoir des questions spécifiques de la protéine qui peut ne pas être évidente de prime abord. Par exemple, avec des canaux d'ions acides de détection, même l'addition avec précaution d'un acide pour modifier le pH pourrait conduire à une certaine mort cellulaire et la dénaturation des protéines. Ainsi, de multiples échantillons doivent être préparés, une pour chaque pH à tester. En outre, en plus du transfert d'énergie par résonance, les variations locales d'environnement peuvent affecter un signal de fluorescence. Un tel changement, s'il est important, ne serait être indiquée dans la mesure des donateurs uniquement comme un double désintégration ou multi-exponentielle. Dans ces cas, les sites d'étiquetage doivent être déplacés vers des positions différentes à make que le changement de conditions ne modifie pas les propriétés spectrales des fluorophores.
Même si le maintien de ces sources de problèmes à l'esprit, il ya quelques mises en garde et limitations de propagation à longue distance dont l'expérimentateur doit être au courant. Première technique de marquage, classique repose sur l'étiquetage des résidus cystéine. Pour réduire l'étiquetage des résidus non-spécifiques, d'autres cysteines sont habituellement mutés sur; Cependant, cette méthode n'est pas toujours pratique. Par exemple, si une protéine a de nombreuses cystéines non-liaison disulfure natifs de sa structure qui sont essentiels à la structure ou la fonction de la protéine, puis les muter en sera impossible, augmentant considérablement la limitation de la technique et l'interprétation des données. En outre, la technique de la LRET est plus adapté à la détection de variations de distance, plutôt que des distances absolues, car une erreur sur la distance absolue en raison de l'effet du facteur d'orientation κ 2 sur la valeur de R 0 sont susceptiblesêtre réduite à l'analyse du changement de la distance parce que ces erreurs affectent les mesures dans toutes les conditions tout aussi. D'autres techniques peuvent être faites pour surmonter certaines de ces limitations. Par exemple, pour éviter d'ajouter trop de résidus cystéine, on pourrait apposer une étiquette His et l'étiqueter avec un fluorophore lié au nickel-NTA. Aussi, tryptophanes indigènes peuvent être utilisés comme un l'un des fluorophores, étant entendu que si elle est utilisée en tant que donateur, tryptophanes ont une durée de vie beaucoup plus petit que le terbium, donc des mesures d'intensité en fonction peuvent être plus appropriées que des mesures de durée de vie. Si plus exact atome de distances atomiques sont nécessaires, des techniques telles que la cristallographie aux rayons X, la dynamique moléculaire, ou encore des techniques de RMN sont plus appropriés pour obtenir les distances absolues.
En raison de sa sensibilité exquise à distance change, LRET peut mesurer la distance varie avec la résolution Angstrom niveau de protéines en phase soluble et peut fournir des données expérimentales, sans la nécessité d'une haute purité, marqueurs isotopiques ou la restriction de taille qui affecte à la fois la RMN et la dynamique moléculaire. Après l'apprentissage et la maîtrise de la technique, les examens dans les changements de conformation de protéines peuvent être réalisées beaucoup plus rapidement et avec plus de facilité que les techniques conventionnelles déjà disponibles. LRET fournit également une excellente base pour les techniques de transfert d'énergie par résonance plus spécialisés comme seule molécule FRET (smFRET), qui peut examiner la répartition de la population des états conformationnels de molécules individuelles, plutôt que la moyenne d'ensemble.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par les Instituts nationaux de la santé Grant GM094246, l'American Heart Association Grant 11GRNT7890004, et la National Science Foundation Grant MCB-1110501.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate | Life Technologies | PV3579 | |
| Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide | Life Technologies | F-150 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide | Life Technologies | A-10254 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20346 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide | Life Technologies | A-10256 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20344 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| QuantaMaster 3-SS | Photon Technology International | Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the millisecond range | |
| FluoreScan 2.0 | Photon Technology International | Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument | |
| Origin 8.6 | OriginLab | Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software | |
| Quartz cuvette | Starna Cells, Inc | 3-Q-10 | |
| Stir bar | Bel-Art Products | F37119-0007 | Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette |
References
- Selvin, P. R. Principles and biophysical applications of lanthanide-based probes. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 275-302 (2002).
- Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 719-726 (1967).
- Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
- Selvin, P. R., Hearst, J. E. Luminescence energy transfer using a terbium chelate: improvements on fluorescence energy transfer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 10024-10028 (1994).
- Chen, J., Selvin, P. R. Thiol-reactive luminescent chelates of terbium and europium. Bioconjugate Chemistry. 10, 311-315 (1999).
- Ge, P., Selvin, P. R. Thiol-reactive luminescent lanthanide chelates: part 2. Bioconjugate Chemistry. 14, 870-876 (2003).
- Gonzalez, J., Rambhadran, A., Du, M., Jayaraman, V. LRET investigations of conformational changes in the ligand binding domain of a functional AMPA receptor. Biochemistry. 47, 10027-10032 (2008).
- Ramaswamy, S. S., Maclean, D. M., Gorfe, A. A., Jayaraman, V. Proton mediated conformational changes in an Acid Sensing Ion Channel. J. Bio. Chem. 288, (2013).
- Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. Conformational changes at the agonist binding domain of the N-methyl-D-aspartic acid receptor. The Journal of Biological Chemistry. 286, 16953-16957 (2011).
- Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. Subunit arrangement in N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. The Journal of Biological Chemistry. 285, 15296-15301 (2010).
- Kokko, T., Kokko, L., Soukka, T. Terbium(III) chelate as an efficient donor for multiple-wavelength fluorescent acceptors. Journal of Fluorescence. 19, 159-164 (2009).
