Summary
우리는 여기에 우리가 기증자와 수용체 형광 사이트 사이의 단백질 분해 효소 절단 부위를 소개 향상된 발광 공명 에너지 전달 (LRET) 방법을 설명합니다. 이 변형은 우리가 단백질의 정제없이 막 단백질의 연구를 허용 관심 막 단백질에서 발생하는 특정 LRET 신호를 획득 할 수있다.
Abstract
발광 공명 에너지 전달, 또는 LRET는, 10 ~ 100 (A)의 거리 범위 내에서 단백질 두 사이트들 사이의 거리를 측정하는 데 사용하는 강력한 기술이다. 다양한 조건 하에서 결찰 거리를 측정함으로써, 단백질의 구조 변화가 용이하게 평가 될 수있다. LRET, 란탄, 대부분 킬레이트 테르븀과 같은 이상 도너 전용 발광 수명 여러 셉터 형광체를 사용할 수있는 유연성 및 쉬운 방법으로서 민감화 셉터 방출을 검출하는 계기로 이점을 수득, 도너 형광 물질로서 사용 또한 도너 전용 신호를 검출하는 위험없이 에너지 전이를 측정한다. 여기서는 막 단백질 발현 및 본래 포유 동물 세포의 표면 상에 정량 LRET를 사용하는 방법을 설명한다. 우리는 LRET의 형광 쌍 사이에 단백질 분해 효소 절단 부위를 소개합니다. 원래 LRET 신호를 얻는 후, 해당 사이트의 단리는 단백질에서 특정 LRET 신호를 제거우리가 정량적으로 절단 후 남아있는 배경 신호를 뺄 수 있도록 관심. 이 방법은 더 중요한 생리 학적 측정은 단백질의 정제를 필요로하지 않고 제작 될 수 있습니다.
Introduction
발광 공명 에너지 전달 (LRET)는 잘 알려진 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 기술을 하나의 유도체이다. FRET 마찬가지로, 10-100 LRET는 1-3의 범위 내에서 관심있는 단백질의 특정 위치에 부착 된 도너와 억 셉터 형광체 사이의 거리 및 거리의 변화를 측정하는데 사용될 수있다. LRET의 원리는 도너의 형광 방출 스펙트럼은 셉터 형광체의 흡수 스펙트럼과 중첩 될 때 두 기단 사이에서 발생하는 형광도 공명 에너지 전달에 FRET 유사하다. 이 전사의 효율은 다음 식에 의해이 형광체 사이의 거리와 관련된다 :
식. 1
R은 두 형광체 사이의 거리이고, E는 EN의 효율이다후술 ergy 전송, R 0는, 전사 효율의 반 극대되는 거리 즉 형광 쌍에 대한 포스터 반경이다. 이런 식으로, 하나는 그 효율이 역 여섯째 전원 (1)에 발생하는 거리의 크기에 관련되어 볼 수있다. 이 때 FRET 쌍의 R 공 근처에 아주 작은 거리 변화에 정교하게 민감하게 FRET와 LRET 측정을 위해 허용이 역 여섯째 전력 의존성이다. 특히 단백질이나 다른 고분자에 원하는 사이트에 라벨을 할 수있는 능력은 하나의 구조 변화를 모니터링하기 위해이 감도을 활용할 수 있습니다.
종래의 유기 색소 분자를 사용 FRET, 비교하면, LRET 추가적인 이점을 제공한다. LRET에서는 대신 도너 형광 단, 란탄 족 양이온, 일반적으로 결핵 3+ 또는 Eu를 3 이상으로 유기 색소를 사용하는 1,4-6 사용된다. U 가을 형광파인더이 범주는, 예를 들어, 테르븀 킬레이트는 또한 그들이 수용체의 형광의 넓은 범위에서 사용할 수있는 매우 다양한 있습니다. 란탄 족 킬레이트의 방출 스펙트럼은 다수의 날카로운 발광 피크를 포함하기 때문에 유연성 셉터 형광체의 다양한 중 하나와 함께 사용할 수 도너 형광 물질의 하나의 종을 허용 가능하게된다. 따라서, 감응 형 수용체 방출 기증자 방출 5에서 잘린 오염의 두려움없이 검출 할 수있다. 실험자들은이 형광체 (도 1 및 표 1) 사이의 거리에 기초하여 예상되는 특정 수용체를 선택한다. 이러한 킬레이트 화 란탄 형광체에서, 금속 이온이 고분자 하나의 특정 작용기에 이온 밧줄하기 bioreactive 관능기뿐만 아니라의 여기하는 통상 저조한 흡수 란탄을 민감하게 안테나 그룹을 포함하는 분자에 의해 킬레이트 화된다 5,6. ONC흥분 즉, 란탄 족은 밀리 초 범위의 붕괴 속도와 광자의 방출을 통해 바닥 상태로 이완. 붕괴 중항 투 중항 이완이나 삼중 항 - 대 - 일 중항 이완도 있기 때문에, 광자의 방출이 제대로 형광 또는 인광을 호출 할 수는 없지만, 하나 이상의 발광 적절히 불린다. 란탄 족 발광의 긴 감쇠가 크게 수명 측정에 도움이됩니다. 수명 측정은 다음 관계식을 통해 효율을 결정하는데 사용될 수있다 :
식. 이
여기서, E는 전송의 효율이고, τ의 D는 에너지 전달에 참여하지 도너 (킬레이트 화 란탄)의 수명이고, 수용체와의 에너지 전달에 참여하는 경우 τ DA는 도너의 수명이다. LRET으로, 다음 τ의 DA는 알 수테르븀의 수명이 훨씬 더 큰 유기 수용체의 형광보다 때문에 이렇게 감작 된 수용체 방출의 수명으로 측정 될 수있다. 수용체는 선동 여기 (기증자 란탄 족)과 같은 수명을 방출하고, 받아들이 자신의 고유 형광 수명에서 수명에 대한 기여도는 상대적으로 무시할 수있다. 도너 억 셉터에 1 비율 공여자 발광 오히려보다 감응 발광을 측정함으로써, 우리는 또한 정확히 하나에 라벨링을 확보 할 필요성을 제거한다. 단백질 대신 수용체와 기증자 형광 모두를 동시에 표시 할 수 있습니다. 이질 표시 인구가 발생할 수 있지만 두 번 기증자 표지 단백질 수용체의 파장이 발생하지 않 두 번 수용체 표지 단백질이 흥분하지 않습니다. 또한, 형광 물질 사이의 거리에 관계없이 도너로서 등방성 란탄을 이용 특히 주어진 형광 물질이 부착되는 위치의 시스테인, 동일하므로 성은해야d는 기증자 또는 수용체 중 하나가 불필요받을 수있는 특정 사이트를 지정합니다. 강도는 이기종 인구에 영향을 줄 수 있습니다,하지만 여전히 감지하기에 충분한 것보다 더해야합니다.
실험을 계획 할 때, 형광 물질의 선택은 한 쌍의 R 0 값뿐만 아니라, 예상 거리 범위에 의해 결정되어야한다 측정된다. R 0 값은 다음 식으로 정의된다 :
식. 3
여기서, R 0는 옹스트롬 포스터 반경이며,이 κ하면 (보통 2/3 것으로 가정)이 염료의 배향 계수는, φ D가 도너의 양자 수율이며, J는 도너의 사이 적분 스펙트럼 오버랩은 M의 발광 스펙트럼과 수용체의 흡광도 스펙트럼 - 1cm -1 내지 4이고, n 매체 (1)의 굴절율이다.
우리 연구소는 검사 대상인 단백질에 기증자 및 수용체 라벨 사이트 사이에 단백질 분해 효소 인식 부위를 도입하여 기존의 LRET 기술에 대한 수정을 추가했다. 이 수정은 모든 포유 동물 세포 7과 같은 비 정제 시스템의 조사를 할 수 있습니다. 시스테인도 표시되어있다 세포 시스테인 설프 하이 드릴 기, 다른 단백질에 결합하는 말레이 미드 공액 염료 라벨링 과정 이후, 표지 용 사이트로 시스테인을 사용하는 경우이 방법이 특히 유용하다. 그러나, 관심있는 단백질에 단백질 분해 효소 절단 부위를 포함하고 전과 후에 절단 수명을 측정함으로써, 실험자 정량적 원시 신호로부터 프로테아제 절단 후의 배경 신호를 감산 할 수있다. 이러한 감산은 (도 관심의 단백질에서 발생하는 특정 신호를 분리우레 2). 상술 한 변형 예를 사용하여, LRET는 테르븀 킬레이트 공여체 및 단백질에 대한 수용체 프로브 사이의 거리의 변화를 측정하고, 이와 같이 정제에 대한 요구없이 단백질의 근처 생리적 상태의 구조 변화를 모니터링하는데 사용될 수있다.
그림 1. 흡수와 검은 색 킬레이트 테르븀뿐만 아니라 빨간색으로 대표 수용체, 알렉사 488의 발광 스펙트럼. 다수의 발광 피크 테르븀 킬레이트의 각 피크에 대한 날카로운 좁은 배출 범위를 알 수 있습니다. 이 패턴이 테르븀 셉터 형광체의 다양한 사용되도록 허용 테르븀 더 발광을 보여주지 그 범위 내에서 민감화 발광의 측정을 용이하게한다. 와 아주 잘 겹쳐 nm의 486에서 테르븀의 발광 피크 이 사이에 발생하는 형광 공명 에너지 전달을 허용 알렉사 488 bsorption 피크. 515 nm의 파장은 테르븀 방출 피크 사이의 골짜기에서, 그리고 확실히 520 nm 인 알렉사 488의 발광 피크 근처로이 쌍 민감화 방출을 탐지하는 우수한 선택이다. 수용체 피크 근처에있는 바람직하지만, 그렇지 필요-565의 나노 여전히 또한 테르븀 방출을 검출하지 않고 알렉사 488 방출을 감지 할 수 있습니다.
| 채택 형광 | R 0 (A) | 방출 파장 (nm) |
| 아토 465 | 36 | 3px; "> (508)|
| 형광 | 45 | 515 |
| 알렉사 488 | 46 | 515 |
| 알렉사 680 | 52 | 700 |
| 알렉사 594 | 53 | 630 |
| 알렉사 555 | 65 | 565 | 65 | 575 |
표 1 LRET 기증자 11로 테르븀 킬레이트를 사용하는 일반적으로 사용되는 수용체의 형광의 목록입니다. 도너 및 억 셉터는 AMPA 수용체의 수용성 작용제 결합 도메인에 연결되었을 때 R 0의 값을 측정 하였다. 그것은 각각의 새로운 시스템이 연구되고 다시 R 0 값을 측정하기에 적합합니다.
도 2에 제시된 LRET 방법 개요. (A) AMPA 수용체는 리간드 - 결합시에 형태 적 변화를 겪는다 세포막 단백질이다. 대합 조개 껍질 모양의 리간드 - 양방향찾아내는 도메인은 빨간색으로 여기 원으로. (B) 단백질에 결합하지 AMPA의 리간드 결합 도메인은 오픈 형태 (왼쪽)에 존재합니다. 글루타메이트 리간드 바인딩 할 때, 단백질은 리간드 (오른쪽)의 주위에 닫습니다. LBD에 대한 증거가 될 부위에서 형광을 배치하여,이 형태 적 변화의 본성은 형광 수명에 영향을 미칠 것이다 형광 변화 간의 거리로 볼 수있다. (C) 라벨링 전체 세포, 관심의 단백질뿐만 아니라 배경 막 단백질 양의 라벨링 (왼쪽)이 발생할 수있는 경우. 단백질 분해 효소 절단 후, 관심있는 단백질에서 LRET 신호가 배경 신호 그대로 (오른쪽)를 떠나 인해 가용성 단편의 릴리스로 사라집니다. 이러한 배경 신호는 원시 신호로부터 감산 될 수있다.
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Protocol
1.이자의 단백질을 포함하는 구조를 만들기
적합한 벡터에 관심 단백질을 발현하는 유전자를 복제. 같은 pcDNA 벡터 시리즈 또는 pRK5로 사용 벡터 그들은 HEK293 및 CHO 세포와 같은 포유류 시스템의 표현에 적합하다로.
형광 태그와 함께 할 수있는 단백질에 사이트를 선택합니다
- 단백질 내에서 가능한 구조 변화를 반영 할 수있는 라벨 사이트를 선택합니다. 가능하다면, 이러한 결정을 내릴 수 있도록하는 단백질 또는 상동 단백질의 결정 구조를 사용한다. 없는 결정 구조가 가능한 경우, 단백질의 가능한 구조를 예측하고, 따라서 적절한 사이트에 대한 통찰력을 수신 온라인 소프트웨어를 사용한다.
- 단백질을 표시 할 수 있도록 선택된 잔기의 측쇄는 표면 노출되고, 형광체가 액세스되도록 잔기를 선택.
- 잔류를 선택하는 것이리간드 결합에 관여하지 않습니다 예를 들어 사이트에 대한 단백질의 기능에 중요하지 않다.
- 시스테인 돌연변이를 도입에서, 단백질 구조로 최소한의 교란을 야기 세린 예를 들면, 유사하다 사이트에 우선권을 준다.
- 라벨 사이트를 선택한 후, 단백질 만이 의도 한 사이트에서 LRET를 제공하도록 돌연변이를 확인합니다. 멀리 잠재적으로 형광 태그 공역을 말레이 미드 바인딩 할 수있는 비 이황화 결합 시스테인 돌연변이 표준 부위 특이 적 변이 프로토콜을 사용합니다. 그들은 단백질의 접힌 형태로 형광 염료와 반응하지 않아야하기 때문에 거리에 이황화 결합 시스테인 및 매장, 무료 시스테인 돌연변이하지 마십시오.
- 표준 부위 특이 적 변이 프로토콜을 사용하는 점 돌연변이를 제작하여 원하는 사이트에 시스테인 잔기를 도입.
- 특히 단백질의 시스테인 중 하나를 절단 할 수있는 단백질 분해 효소 절단 부위를 포함합니다. 만약그것은, 보수적 (인식 서열이 LVPRGS) 또는 트롬빈을 갖도록 단백질 돌연변이에 의해 사이트를 소개를위한 단백질 서열은 허용 Xa 인자 (인식 서열 IDGR 또는 IEGR) 도입 된 시스테인 가까운 순서 및 분열 프로테아제 액세스; 그렇지 테트라 - 또는 헥사 - 펩타이드 서열은 전체적으로 삽입 될 수있다. 절단시에 도입 된 시스테인 중 하나의 나머지 부분 해리되도록 사이트 선택 단백질 인 특정 경우,이 시스테인 돌연변이를 플 랭킹이 절단 부위를 필요로 할 수있다.
3 시험 단백질의 발현 및 기능
- 돌연변이 단백질의 발현을 확인하기 위해 서양 얼룩을 수행합니다.
- 전혀 기능 장애 단백질의 구조 변화를 연구하지 않도록하는 경우, 돌연변이는 최소한의 단백질 기능을 변경했는지 확인하기 위해 단백질의 기능 분석을 수행합니다.
주 : 모든 단백질이 서로 다른 기능을 가지고 있기 때문에, 단일 F가없는 LRET을 위해 특별히 사용되는 unctional 분석; 그러나, 기능 분석의 몇 가지 예는 이온 채널에 대한 효소의 효소 활성 분석, 수용체 리간드 결합 분석 및 전기 생리학 연구를 포함한다.
(4) 사용되는 형광을 선택
예상 거리 범위에 기초하여 선택 형광체는 범위 0.5-1x 사이 형광 쌍의 R 0이되도록 측정된다.
참고 :이 일반적으로 훨씬 더 긴 수명을 가진 배경은, 쉬운 공제 할 수 있습니다. 이 쌍에 대한 R 0 53 (표 1)이기 때문에, 예를 들면, 예상 거리 범위가 측정되는 경우 약 35, 도너와 억 셉터로서 알렉사 594로서 테르븀 킬레이트 것이 사용하기 적합한 형광 쌍이다.
일시적으로 포유 동물 세포의 필요한 금액를 transfection하여 단백질을 표현하십시오
ntent는 "> 일시적 일반적인 형질 전환 시약의 하나를 사용하여 선택된 포유 동물 세포에 대한 관심의 단백질을 형질 일반적 HEK 및 CHO 세포주 LRET 실험 당 네 개의 10-cm 접시를 사용]. 그러나,이 양 단백질 발현에 따라 달라질 수 , 안정성 등. 세포가 수확 전 36 ~ 48 시간 동안 단백질을 발현하도록 허용합니다.6 단백질 레이블
- 배양 접시에서 세포를 분리합니다. 단순히 접시의 바닥에 대해 버퍼를 피펫 팅하여 HEK 세포를 분리. 세포 외 버퍼와 미디어를 씻어 셀 스크레이퍼로 CHO 세포를 분리합니다.
- 3 분 1,100 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 이후 세척 후뿐만 아니라, 라벨링 한 후 세포를 수집하기 위해 이와 같은 원심 분리기 설정을 사용합니다.
- 다음 100-300 nm의 최종 농도까지 몰량 공여체 및 형광 수용체를 추가 외 완충액 3 ㎖에 세포를 일시. 회 전자의 F에 품어또는 실온에서 1 시간.
- 다음, 언 바운드 형광 물질을 제거 LRET 측정을위한 세포 외 버퍼 (일반적으로 2 ml)에 이러한 세포를 일시 중단 세포 외 버퍼 3-4 배 이러한 표지 세포를 씻으십시오.
- 대조군으로 어떤 수용체의 형광 물질을 첨가하지 않고 단지 기증자 형광 (테르븀 킬레이트)와 세포의 별도의 세트를 레이블을 붙입니다.
참고 : 이러한 기증자 전용 실험 데이터 분석을 완료 할 필요가있다. 이러한 실험은 동일 또는 상이한 날에 수행 될 수있다. - 라벨 과정도 기능은 라벨에 사용되는 위치에 따라 방해 할 수 있습니다로 또 다시, 기능 검증, 라벨 돌연변이 단백질이 시간을 수행합니다.
참고 :이 실험은 동일하거나 다른 일을 수행 할 수 있습니다.
(7)은 LRET 실험을 설정
- 1 ML의 최소 볼륨 석영 큐벳에 재현 탁 세포를 놓습니다.
- 컴퓨터와 악기의 전원을 켜고 DAT의 매개 변수를 조정그에 따라 수집 프로그램.
- (테르븀 킬레이트 잘 작동 나노 330-340) 기증자 형광의 흡광도 범위 여기 파장을 설정합니다.
- 수용체 방출을 사용 수용체에 따라 달라집니다 염두에두고, 적절하게 방출 파장을 설정합니다. 중요한 것은, 단지 수용체 방출을 측정하고 블리드를 통해 기증자의 방출에서 포함되지 않은 검출 파장을 선택합니다. 예를 들어, 수용체의 표 1과 같이 알렉사 555 대 565 nm의 파장을 사용한다. 단백질 만 도너하지만 셉터없이 표지시킨 도너 전용 측정치를 들어, 테르븀 킬레이트의 방출을 측정하기 위해 545 nm의 파장을 사용한다.
- 발광 검출의 길이가 긴 수명 성분이 누락되지 않도록 보장하기 위해 최소 3 배 이상 LRET 예상 수명으로 설정.
- 스캔을 수행합니다. 99 스윕 적어도 세 검사 결과의 일관성을 보장하기 위해 마십시오. 일 저장텍스트 파일 (* .txt)와 같은 전자 결과.
- (이러한 리간드의 첨가와 같은) 다른 조건과 관련하여 단백질의 구조 변화를 측정하기 위해, 이들 조건을 변경하고 다시 새로운 조건 하에서 동일한 샘플에 99 스위프 각의 적어도 셋 검색을 수행. 글루타메이트 수용체의 글루타메이트의 형태에 미치는 영향을 연구하는 경우, 예를 들면 단계 18.6에서 스캔 동일한 샘플에 1 mm의 글루타메이트를 추가 한 다음 다시 스캔.
- 적절한 단백질 분해 효소의 다섯 대까지 추가 분열이 완료되고 더 이상의 변경이 삼 연속 스캔의 수명에서 볼되지 않을 때까지 지속적으로 검사를 취할. 일반적으로, 분열은이 3 시간에 완료됩니다. Xa 인자 절단 부위가 단백질 분해 효소 절단에 사용되는 경우, 예를 들면, 시료에 Xa 인자의 3 μl를 추가하고, 3 시간 동안 30 분마다 스캔.
제 얻어진 데이터 분석
- 데이터 분석 소프트웨어를 엽니 다.
- 형광 수명을로드텍스트 파일을 열 가져 오기 ASCII를 사용하여 데이터를 저장합니다. 하나의 파일로 모든 복제물뿐만 아니라 최종 배경 측정을로드.
- 최종 데이터를 얻기 위해, 각 실험 조건에 대한 모든 검사에서 데이터를 평균. 개별 시험을 포함하는 열을 강조 이렇게하려면 다음 메뉴 바에서 데이터 메뉴 아래에있는 시험의 평균 형광 강도뿐만 아니라 표준 편차와 표준 오차를 표시하는 행에 대한 통계를 클릭합니다.
- 수용체 감응 발광 수명을 나타내는 곡선을 만드는 X 축상의 마이크로 Y 축 및 수명에 대한 형광 강도와 선 그래프로 평균값을 플롯. 데이터의보다 나은 시각화를 허용하도록, 로그 스케일 그래프의 Y-축을 변경.
- 완전한 분열을 나타내는 중첩을 보여 최종 검사를 평균 배경 측정 데이터 단계를 반복 8.3.
- 배경에 평균 데이터를 표시평균화 된 원시 데이터를 포함 동일 플롯. 이렇게하려면, 플롯 메뉴 아래에있는 레이어 제어 대화 상자를 엽니 다. 이어서, 평균 층 콘텐츠 목록으로 배경을 함유 데이터를 전송.
- 평균 원시 데이터에 대한 평균 백그라운드 데이터를 정렬합니다. 이렇게하려면 곱 또는 배경의 꼬리 끝이 원시 데이터의 꼬리 끝과 중첩 될 때까지 필요에 따라 백그라운드 데이터를 분할 수학 메뉴에서 간단한 수학 함수를 사용합니다.
NOTE :이 꼬리 끝에서, 관심있는 단백질의 수명은 이미 완전히 감쇄 거리에 위치한다; 무엇을 정렬하는 것은 이전과 단백질 분해 효소 절단 후 모두 단순히 배경 신호 존재한다. - 또 간단한 수학 함수를 사용하여, 초기 원료 LRET 신호로부터 백그라운드 신호 정렬을 뺀다.
- 지수 붕괴에 데이터를 장착 (하나 또는 여러 개의 지수 함수, 사이트 및 실험 설계에 따라 다름).
- 종료 후 시작 피팅의 시작 경계를 설정레이저 펄스의. 이후의 모든 곡선 피팅이 동일한 시작점을 사용합니다.
- 단일 지수 함수 감쇠에 대해 다음 수학 식에 수명 맞도록 선택 피팅 함수 대화 상자에서, 지수 형 감쇠를 선택
식. 4
, Y는 형광 강도를 나타내고, y를 0 x는 시간이고, t는 형광 수명이며, 하나는 신호 강도를 인해 시스템 노이즈에 배경 강도를 나타내고, X 영 오프셋 시간이다. - , 배 0-0 수정 피팅 기능을 시작하고 데이터를 맞습니다.
NOTE : 실험은 단지 위치의 한 쌍의 신호를 갖도록 설계되는 경우, 결과 데이터를 쉽게 단일 지수 감쇠 8 의하여 적합해야한다. 착용감의 잔류는 적합도를 결정하는 좋은 방법이며 추가 붕괴 수명은의 requir 경우에디션.
- 포스터 방정식 (식 (1)과 상기 (2)의 재 배열)을 사용하여 형광 물질 사이의 거리를 계산하는 데이터로부터 얻어진 수명을 사용
식. 5
참고 : τ DA가 감작 수용체 방출 수명으로 측정 한 가지는 위에서 언급 한 바와 같이 모든 변수입니다. R 0 및 R의 측정에 대한 자세한 내용과 예는 다른 곳에서 7,9,10 찾을 수 있습니다. - 재현성을 확인하기 위해 실험 데이터 분석보기 적어도 세 번 반복한다. 동일한 측정의 개별적인 반복 간의 불일치 문제로 데이터의 유효성을 호출; 추가 제어 실험이나 반복을 사용합니다. 에서 오류 전파 (토마스 후버 박사에 의해 개발) 자유 구스타브 오류 분석 계산기 또는 유사한 시스템을 사용하여 측정 오차를 계산수명의 맞습니다.
식. 4 
식. 5 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
란탄 공여체와 성공적인 LRET 측정은 밀리 초 시간 범위에서만 수명 도너를 가져야한다. 도너 및 억 셉터 모두로 표지 단백질 민감화 LRET 방출 수명. 배경 감산도 3 이후 마이크로 범위의 수명과 함께, 현저하게 짧을 수 (시간이 지남에 안정되어 있어야 수명 증가 벽개 결과 프로테아제 것 즉, 더 이상 프로테아제 절단이 완료도 4임을 보여주는)을 변경하지. LRET 신호 사이트 중 하나의 세트로부터 오는 경우, 배경의 감산 후 얻어진 발광 수명은 단일 지수 수명을 제공한다.
구조 변화를 측정 할 경우, 특정 LRET 신호 측정도 3의 오차 밖에 수명 변화를 표시한다. 측정 에러는 에러의 전파에 의해 계산 될 수있다수명의 착용감과 관련된 s의. 수학 식 4, 수명 τ에 기재된 감쇠 지수 함수의 최소 수에 데이터를 피팅 한 후 결정될 수있다. LRET 쌍 테스트 조건이 형광체 사이의 거리를 계산하기위한 수학 식 5를 사용하여 도너 - 억 셉터와 도너 전용 수명은 R 0 값과 함께 사용될 수있다. 단백질의 전체적인 구조 및 기능에 이러한 조건을 변경으로 인한 거리의 변화를 관련 이제 실험자의 일이다.
산성 감지 이온 채널 1A (ASIC1a)의 그림 3 LRET 측정. 형광 강도 시각적 해석의 용이성을 향상시키기 위해 로그 스케일에 플롯되었다. (a) 도너 전용 샘플은 단일 exponentia 보여pH가 변경되지 않습니다 리터 붕괴. 도너 - 억 셉터 표지 샘플에서 (b), 민감화 발광 수명의 저하 (빨강 검정) 8-6의 pH의 저하에 따라 알 수있다. 이 수명의 감소는 ASIC1a의 손가락과 엄지 손가락 도메인 사이의 거리의 감소를 나타냅니다. 이 수치는 Ramaswamy, 등, 2013 팔에서 수정되었습니다.
그림 4 산성 감지 이온 채널 1A (ASIC1a)에 만든 LRET 측정에 배경 공제의 효과는. 사이트는 특히 단백질 분해 효소 절단 부위가 분리되어 형광 물질로 표시합니다. LRET 측정이 이루어진 후에, 프로테아제가 특정 신호의 손실 단백질 샘플이자 결과 단백질의 절단 이후에 도입된다. 남아있는 모든 LRET다른 막 단백질에 존재하는 다른 시스테인 결합 형광에서 배경 형광이다. 이러한 배경을 빼면 관심 단백질에 대한 진정한 LRET 데이터를 분리. 이 수치는 Ramaswamy, 등, 2013 팔에서 수정되었습니다.
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Discussion
LRET 과학자들이 단일 단백질 내에서뿐만 아니라, 다중 체 단백질의 서브 유닛 사이의 도메인 간 거리를 측정 할 수있는 강력한 기술이다. 이와 같이, LRET는 단백질이나 다른 거대 분자의 구조 변화와 역학 조사에 잘 적합합니다. 위의 프로토콜은 쉽게 자신의 가설을 테스트하기 위해 제대로 갖춘 실험실을 허용한다; 그러나 새로운 조사를 괴롭히는 수있는 오류의 많은 일반적인 소스가 있습니다. 거의 또는 전혀 LRET 신호를 볼 경우, 먼저 사용 파장 설정을 확인합니다. 여진 테르븀 (330-340 nm의)의 흡수 범위 내에 있어야한다. 도너 - 억 셉터 측정을 위해, 발광 파장이 셉터 형광 일치해야하는 동안 샘플 만 도너 형광 단으로하고 셉터 형광 물질없이 표지 된에 도너 단지 측정의 경우, 발광 파장이,도 1에 도시 된 피크 중 하나이어야 표 1을 사용. wavele 경우ngth 설정이 올바른지, 버퍼의 호환성을 확인합니다. 일부 형광 특정 버퍼 또는 특정의 pH 범위에서 호환되지 않을 수 있습니다. 다음, 잔류 물 및 형광체의 선택이 호환되는지 확인합니다. 실험 설계가 완전히 정확하다면, 그때 문제는 아마 또는 형광 단백질 자체와 하나있다. 시간이 지남에 따라 형광 물질의 원액이 저하 될 수 있으며, 불충분 표시 될 수 있습니다. 마지막으로, 단백질의 발현과 기능을 확인하십시오. 많은 시스테인 돌연변이의 도입, 네이티브 시스테인의 제거, 및 적어도 하나의 프로테아제 절단 부위의 도입을 포함한 추가되었다. 따라서, 심지어 정상적인 형질 전환 조건 하에서 도입 된 돌연변이는 본 신호를 저하 과소 발현 관심 단백질의 단백질 및 원인을 불안정하게한다는 것이 가능하다. 표현하면, 돌연변이 또는 라벨링 다르게 배치 될 잔기를 일으키는, 단백질의 변성을 일으킬 수야생형 단백질에서 볼 예상 거리에서. 웨스턴 블롯의 단백질 발현을 확인하기 위해 사용될 수있다. 특히 표면 인신 매매를 보여줄 것입니다 관심의 단백질 서양 얼룩 다음에 표면 막 단백질의 인신 매매, 세포 표면의 바이오 티 닐화 표면에 노출 된 단백질의 풀다운, 대한 질문이 있다면. LRET 단백질 종류의 다양한에서 사용할 수 있기 때문에 기능 테스트를 들어, 구체적 LRET 함께 사용하도록 권장하기 위해 단일 분석이 없다. 다시하지만, 기능 분석이 가능합니다 예는 효소 활동 분석, 리간드 결합 분석 및 전기 생리학 연구를 포함한다. 단백질의 발현이나 기능이 너무 악영향 돌연변이 도입에 의해 영향을받지 않은 경우, 새로운 라벨이 사이트가 선택되어야한다.
LRET 신호를 볼 수있다 그러나 이러한 결과가 예상되는 경우, 단일 지수에 의해 배경을 정확하게 감산되었음을 제 체크 장착 할 수없는 경우. AF, 만약터 뺄셈, 다중 지수 붕괴를 볼 수있다,이 신호는 의도 된 것보다 다른 여러 상호 작용에서 관찰되는 LRET의 표시 될 수 있습니다. 다른 모든 접근 시스테인은 단백질 제거했는지 확인하십시오. 결정 구조를 사용할 수있는 경우, 이들 시스테인 확인하기 위해 매우 유용한 도구가 될 것이다. 다시 말하지만, 이황화가 결합 장사, 액세스 시스테인 멀리 변이 할 필요가 없습니다. 그들을 멀리 돌연변이 단백질 일 비원 시스테인을 도입하고 도너 - 억 셉터 표지 샘플에는 LRET 신호가 없을 것을 보장하지 강력한 이유가있는 경우 이들 시스테인의 어려움을 테스트한다. 모든 접근 시스테인 참으로 멀리 변이 된 경우 단백질이 여러 개의 서브 유닛이 있거나 복잡한의 일부인 경우, 그리고 다음, 그 근처의 단백질이나 서브 유닛에 부착 염색으로 인한 혼란 LRET 신호가있을 수 있습니다. 이러한 문제에 도움이 될 수 있습니다 다른 단백 분해 효소 절단 부위를 선택; 그렇지 않으면, 다른 라벨 사이트의이 선택해야 할 수도 있습니다. 피팅 문제는 단순히 신호 - 대 - 잡음의 문제이면 마지막으로, 가능성 문제점은 낮은 단백질의 발현이다. 발현은 형질 감염 등 다른 조건, 다른 벡터 통해 최적화 될 필요가있을 것이다.
LRET 측정이 변칙 또는 겉으로는 물리적으로 의미없는 결과를 생성하면 쉽게 이해가되지 않을 수도있는 단백질 관련 문제가있을 수 있습니다. 예를 들면, 산 감지 이온 채널, 몇 가지 세포 사멸 단백질 변성을 초래할 수의 pH를 변경하는 경우에도 산으로 조심스럽게 첨가. 따라서, 여러 샘플의 pH는 각각에 대해 하나가 테스트 될 준비 될 필요가있다. 또한, 공명 에너지 전달에 부가하여, 로컬 환경의 변화는 형광 신호에 영향을 미칠 수있다. 이러한 변화는 중요한 경우, 이중 또는 다중 지수 붕괴 등 기증자 전용 측정에 기록 될 것이다. 이 경우, 라벨 위치는 m에 다른 위치로 이동시킬 필요아케 확인 조건의 변화는 형광 물질의 분광 특성을 변경하지 않습니다.
마음에 이러한 문제 소스를 유지하는 동안에도, 실험자가 알고 있어야 어느 LRET의 일부에 대한주의 사항 및 제한 사항이 있습니다. 첫째, 기존의 라벨링 기술은 라벨 시스테인 잔기에 의존합니다. 비 특정 잔기의 라벨링을 줄이기 위해 다른 시스테인은 전형적 아웃 돌연변이; 그러나,이 방법에서는 항상 실용적이지 않다. 단백질은 단백질의 구조 또는 기능에 중요한 구조에 네이티브 많은 비 디설파이드 결합 된 시스테인을 갖는 경우, 예를 들어, 크게 기술의 한계 및 데이터의 해석을 증가 불가능할 것이다 그들을 돌연변이. R 값에 0이 κ 배향 계수의 효과로 인한 절대 거리에 에러가 가능성 로서도, LRET 기법은 오히려 절대 거리보다 거리의 변화를 검출하는 것에 더 적합이러한 오류가 동등하게 모든 조건 하에서 측정에 영향을 미치므로 거리 변화 분석을 줄일 수있는 장점을가집니다. 대체 기술은 이러한 한계 중 일부를 극복하기 위해 수행 될 수있다. 예를 들어, 너무 많은 시스테인을 추가 피하기 위해, 하나는 그의 태그 부착 및 니켈 - NTA에 결합 된 형광으로 라벨을 수 있습니다. 또한, 네이티브 tryptophans 따라서, 도너로서 사용하는 경우,이 tryptophans 테르븀보다 훨씬 작은 수명을 가지고 이해 형광체의 하나로서 사용될 수있다 강도 측정 기반 수명 측정보다 더 적합 할 수있다. 원자 거리를 더 정확한 원자이 요구된다면, 이러한 X-선 결정학, 분자 역학 또는 NMR 같은 기술은 아직도 이러한 절대 거리를 얻기 위해 더 적합한 기술이다.
그 절묘한 감도가 변화하는 거리로 인해, LRET는 용액 상 단백질 옹스트롬 레벨 해상도 거리의 변화를 측정 할 수 있고, 높은 푸리 필요없이 실험 데이터를 제공 할 수있다타이, 동위 원소 라벨 또는 NMR 및 분자 역학을 모두 손상 크기 제한. 기술을 배우고 습득 한 후, 단백질의 구조 변화에 검사를 훨씬 빠르고 이미 기존의 기술보다 더 쉽게 수행 할 수 있습니다. LRET 또한 개별 분자의 구조적 상태보다는 앙상블 평균의 인구 분포를 검사 할 수있다 이러한 단일 분자 FRET (smFRET)로서 더욱 특화된 공명 에너지 전달 기술에 대한 우수한 토대를 제공한다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 건강 부여 GM094246, 미국 심장 협회 (American Heart Association) 그랜트 11GRNT7890004 및 국립 과학 재단의 MCB-1110501의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate | Life Technologies | PV3579 | |
| Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide | Life Technologies | F-150 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide | Life Technologies | A-10254 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20346 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide | Life Technologies | A-10256 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20344 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| QuantaMaster 3-SS | Photon Technology International | Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the millisecond range | |
| FluoreScan 2.0 | Photon Technology International | Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument | |
| Origin 8.6 | OriginLab | Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software | |
| Quartz cuvette | Starna Cells, Inc | 3-Q-10 | |
| Stir bar | Bel-Art Products | F37119-0007 | Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette |
References
- Selvin, P. R. Principles and biophysical applications of lanthanide-based probes. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 275-302 (2002).
- Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 719-726 (1967).
- Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
- Selvin, P. R., Hearst, J. E. Luminescence energy transfer using a terbium chelate: improvements on fluorescence energy transfer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 10024-10028 (1994).
- Chen, J., Selvin, P. R. Thiol-reactive luminescent chelates of terbium and europium. Bioconjugate Chemistry. 10, 311-315 (1999).
- Ge, P., Selvin, P. R. Thiol-reactive luminescent lanthanide chelates: part 2. Bioconjugate Chemistry. 14, 870-876 (2003).
- Gonzalez, J., Rambhadran, A., Du, M., Jayaraman, V. LRET investigations of conformational changes in the ligand binding domain of a functional AMPA receptor. Biochemistry. 47, 10027-10032 (2008).
- Ramaswamy, S. S., Maclean, D. M., Gorfe, A. A., Jayaraman, V. Proton mediated conformational changes in an Acid Sensing Ion Channel. J. Bio. Chem. 288, (2013).
- Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. Conformational changes at the agonist binding domain of the N-methyl-D-aspartic acid receptor. The Journal of Biological Chemistry. 286, 16953-16957 (2011).
- Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. Subunit arrangement in N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. The Journal of Biological Chemistry. 285, 15296-15301 (2010).
- Kokko, T., Kokko, L., Soukka, T. Terbium(III) chelate as an efficient donor for multiple-wavelength fluorescent acceptors. Journal of Fluorescence. 19, 159-164 (2009).
