Luminescence Resonance Energy Transfer til Studer konformasjonsendringer i membran proteiner uttrykt i pattedyrceller

Summary

Vi beskriver her en forbedret Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) metode der vi innføre en protease cleavage tomten mellom donor og akseptor fluoroforpar nettsteder. Denne endringen gir oss muligheten til å innhente spesifikke LRET signaler som kommer fra membran proteiner av interesse, slik at for studiet av membran proteiner uten proteinrensing.

Abstract

Luminescence Resonance Energy Transfer, eller LRET, er en kraftfull teknikk som brukes til å måle avstander mellom to steder i proteiner innenfor rekkevidde på 10-100 Å. Ved å måle avstander under forskjellige avsnørede forhold, kan konformasjonsendringer av proteinet lett bli vurdert. Med LRET, et lantanid, oftest chelatert terbium, blir brukt som donor-fluoroforen, hvilket ga fordeler slik som en lengre donor-bare utslipp levetid, fleksibilitet til å bruke flere akseptor fluoroforer, og muligheten til å detektere lysfølsomt akseptor utslipp som en enkel måte å måle energioverføring uten fare for å også å påvise donor-bare signal. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å bruke LRET på membranproteiner uttrykt og analysert på overflaten av intakte pattedyrceller. Vi introduserer en protease cleavage nettstedet mellom LRET fluoroforen par. Etter å ha fått den opprinnelige LRET signal, spalting ved det området fjerner den spesifikke LRET signalet fra proteinet avinteresse slik at vi kan kvantitativt trekke bakgrunnen signal som gjenstår etter cleavage. Denne metoden gjør det mulig for mer fysiologisk relevante målinger skal gjøres uten behov for rensing av protein.

Introduction

Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) er et derivat av den velkjente Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) teknikk ^en. I likhet med slite, kan LRET brukes til å måle avstander og avstandsendringer mellom donor og akseptor fluoroforene knyttet til bestemte steder på protein av interesse innenfor intervallet 10-100 A ^1-3. Prinsippene for LRET er også lik FRET ved at resonans energioverføring skjer mellom to fluoroforer proksimale når emisjonsspekteret av donor fluoroforen overlapper med absorbsjons-spekteret av akseptor fluoroforen. Effektiviteten av denne overføringen er relatert til avstanden mellom de to fluoroforer etter følgende ligning:

Ekv. 1

hvor R er avstanden mellom de to fluoroforer, E er effektiviteten av noErgy overføring, og R _0, omtalt nedenfor, er Förster radius for fluoroforen par, dvs. avstanden som effektiviteten i overføringen er halv maksimal. Fra denne ligning kan man se at effektiviteten er relatert til størrelsen av avstanden opphøyd i inverse sjette strøm ^1. Disse inverse sjette strømavhengighet som gir mulighet for FRET og LRET målinger for å være utsøkt følsom selv for små avstandsendringer når nær R ₀ av FRET paret. Evnen til å spesifikt merke ønskede steder på proteiner eller andre makromolekyler som tillater en å dra fordel av denne følsomhet til å overvåke konformasjonsendringer.

Sammenlignet med slite, som bruker konvensjonelle organiske fargestoffer, og tilbyr LRET ytterligere fordeler. I LRET, i stedet for ved hjelp av et organisk fargestoff som donor fluorofor, et lantanid-serien kation, typisk Tb ^{3 +} eller ^{3 +} Eu, anvendes ^1,4-6. Fluoroforene som faller under denne kategori, f.eks, terbium chelat, er også meget anvendelig ved at de kan brukes sammen med et bredt spekter av akseptor fluoroforer. Denne fleksibiliteten er gjort mulig fordi emisjonsspektrene av chelaterte lanthanider inneholde flere skarpe utslipps topper, slik at for en enkelt art av donor fluoroforen til å brukes sammen med en av et bredt utvalg av akseptor fluoroforer. Dermed kan sensibilisert akseptor utslipp oppdages uten engstelse for å smitte gjennomslag fra donor utslipp ^fem. Den experimenter velger den spesifikke akseptor basert på den forventede avstanden mellom de to fluoroforer (figur 1 og tabell 1). I disse chelaterte lantanid fluoroforer, blir metallionet chelatert med et molekyl som inneholder en antennegruppe som sensitizes normalt dårlig absorberende lantanid til eksitasjon, så vel som en funksjonell gruppe bioreactive å tjore ion til en bestemt funksjonell gruppe på makromolekylet ^{1, 5,6.} ONCe spent, lanthanider slappe av til grunntilstanden via utgivelsen av fotoner med en dempefaktor i millisekund området. Fordi forfallet er verken en singlet-til-sing avslapping eller en triplett-til-sing avslapning, utslipp av fotoner kan ikke riktig kalles fluorescens eller morilden, men er mer riktig betegnes luminescens ^en. Den lange nedbrytning av lanthanid luminescence bidrar sterkt i levetid målinger. Levetid målinger kan så brukes for å bestemme effektiviteten via følgende relasjon:

Ekv. 2

der, er E effektiviteten i overføringen, er τ _D levetiden til donor (kjelatert lanthanid) når de ikke deltar i energioverføring, og τ _DA er levetiden til donor når du deltar i energioverføring med akseptor. Med LRET, τ _DA kan alså måles som levetiden på lysfølsomt akseptor utslipp fordi terbium levetid er så mye større enn en organisk akseptor fluoroforen. Den akseptor avgir med den samme levetid som dens eggende eksitasjon (donor lantanid), og noe bidrag til levetid fra akseptor egen iboende fluorescens levetid er forholdsvis ubetydelig. Ved å måle den sensibiliserte utslipp fremfor donor utslipp vi også eliminere behovet for å sikre at merkingen på nøyaktig en 1: 1-forhold av donor til akseptor. Protein kan i stedet merkes samtidig med både akseptor og donor fluorophores. Et heterogent merket befolkningen vil føre, men dobbel-donor merkede proteiner vil ikke slippe ut i akseptor bølgelengde og dobbelt akseptor merkede proteiner vil ikke være begeistret. Videre bør avstanden mellom fluoroforer være den samme, uavhengig av hvilken cystein side en gitt fluoroforen er festet til, spesielt ved bruk av den isotrope lanthanider som en donor, så need til å angi et gitt område for å motta enten donor eller akseptor er unødvendig. Intensitet kan påvirkes med en heterogen populasjon, men bør likevel være mer enn tilstrekkelig til å bli detektert.

Ved planlegging av eksperimenter, bør valget av fluoroforer være diktert av _R-0-verdi av paret, så vel som de forventede avstandsområde som skal måles. R _0-verdien er definert ved den følgende ligning:

Ekv. 3

hvor, R ₀ er Förster radius i Ångstrøm, κ ² er orienteringen faktoren mellom de to fargestoffer (vanligvis antas å være 2/3), φ _D er kvanteutbytte av donor, J er den spektrale overlapping integrert mellom donor emisjonsspektrum og akseptor er Absorpsjonsspekteret i M ^{- 1}cm ^-1 nm ^{til 4,} og n er brytningsindeksen for mediet ^1.

Våre laboratorie har lagt en modifikasjon av den konvensjonelle LRET teknikken ved å innføre en protease-gjenkjenningssete mellom donor og akseptor etikett steder på proteinet som blir undersøkt. Denne modifikasjon gjør det mulig for undersøkelse i ikke-renset systemer som hele pattedyrceller ^7. Denne teknikken er spesielt nyttig ved bruk av cysteiner som seter for merking, siden i ferd med merking med maleimide-konjugert fargestoffer som binder seg til cystein-sulfhydrylgrupper, andre proteiner i celler som har cysteiner er også merket. Imidlertid, ved å inkludere proteaseinhibitorer spaltningsseter for proteinet av interesse, og å måle levetider før og etter spalting, experimenter kan kvantitativt subtrahere bakgrunnssignalet etter protease-spalting fra rå signal. Denne subtraksjon isolerer det spesifikke signal som oppstår fra for proteinet av interesse (Figure 2). Ved hjelp av den modifikasjon som er beskrevet ovenfor, kan LRET brukes til å måle avstandsendringen mellom terbium chelat-donor og akseptor sonde på et protein og således overvåke konformasjonsendringer i proteinet, i nærheten av fysiologisk tilstand uten behov for rensing.

Figur 1. Den absorpsjon og emisjon spektra av chelatert terbium i svart, så vel som en representativ akseptor, Alexa 488, i rødt. Legg merke til de flere utslipps topper og den skarpe, smale emisjonsområde for hver topp av terbium chelat. Dette mønster gjør det mulig for terbium til å brukes sammen med en rekke akseptor fluoroforer og letter måling av lysfølsomt emisjon innenfor avstander hvor terbium viser ingen emisjon. Terbium utslipp topp på 486 nm lapper ganske godt med en bsorption toppen av Alexa 488, slik at for resonans energioverføring å oppstå mellom de to fluoroforer. En bølgelengde på 515 nm er et utmerket valg for å oppdage lysfølsomt utslipp for dette paret som det er i dalen mellom Terbium utslipps toppene, og ganske nær Alexa 488 utslipp topp på 520 nm. Legg merke til at det å være nær akseptor topp, selv om ønskelig, ikke er nødvendig-565 nm er fortsatt i stand til å oppdage Alexa 488 utslipp uten også å oppdage terbium utslipp.

3px; "> 508 Cy3

Akseptant fluoroforen	R 0 (Å)	Utslipp bølgelengde (nm)
Atto 465	36
Fluorescein	45	515
Alexa 488	46	515
Alexa 680	52	700
Alexa 594	53	630
Alexa 555	65	565
65	575

Tabell 1. En liste over ofte brukte akseptor fluoroforene for LRET bruker terbium chelatet som donor ^11. De _R-0-verdiene ble målt når donor og akseptor ble festet til den oppløselige agonist bindende domenet av AMPA-reseptorer. Det er ideelt å måle R ₀ verdien på nytt for hver nye systemet som studeres.

Figur 2. En oversikt over LRET metoden presentert. (A) AMPA-reseptoren er et membranprotein som gjennomgår konformasjonsendringer ved ligand-binding. Clamshell-formet ligand-binding domenet er sirklet her i rødt. (B) Den ligand-bindende domene av AMPA når den ikke er bundet til protein eksisterer i en åpen konformasjon (til venstre). Når bundet til ligand glutamat, lukkes protein rundt sin ligand (høyre). Ved å plassere fluoroforene på probative steder på LBD, kan innholdet i denne konformasjonsendringen sees som avstanden mellom fluoroforene endringer, som da vil påvirke fluorescens levetid. (C) Ved merking av hele celler, kan merking av begge for proteinet av interesse, så vel som bakgrunnsmembranproteiner forekommer (til venstre). Etter spalting protease, vil LRET signal fra proteinet av interesse forsvinner på grunn av frigjøring av et oppløselig fragment, slik at bakgrunnssignal intakt (høyre). Denne bakgrunnssignal kan så bli subtrahert fra det rå signal.

Protocol

1. Opprett Construct inneholder protein av interesse

Klone genet som uttrykker proteinet av interesse inn i en egnet vektor. Bruk vektorer som pcDNA serie eller pRK5 som de er godt egnet for ekspresjon i pattedyrsystemer som HEK293 og CHO-celler.

2. Velg nettsteder på protein som skal Merket med fluoroforene

1. Velg merking områder som er i stand til å reflektere mulige konformasjonsendringer i proteinet. Hvis mulig, bruk en krystallstruktur av proteinet eller av en homolog protein for å hjelpe gjøre dette forsøket. Hvis det ikke er noen krystallstruktur tilgjengelig, brukes elektronisk programvare for å forutsi mulige struktur av proteinet, og dermed få innsikt i egnede områder.
2. Velge rester slik at sidekjedene av de utvalgte rester er overflate eksponert og tilgjengelig for de fluoroforer, slik at proteinet kan merkes.
   1. Velg rester somer ikke kritisk for proteinfunksjon, for eksempel områder som ikke er involvert i ligand binding.
   2. I innføre cystein mutasjon, gi preferanse til nettsteder som ligner, for eksempel serin, som ville føre til minimal forstyrrelse til proteinstrukturen.
   3. Etter å ha valgt de merkingssider, må mutasjoner for å sikre at proteinet bare gir LRET fra disse tiltenkte steder. Bruk standard seterettet mutagenese protokoller for å mutere bort ikke-disulfid-limt cysteiner som potensielt kan bindes til maleimide-konjugerte fluorescerende tags. Ikke mutere bort disulfid-bundne cysteiner og begravet, frie cysteiner, siden de ikke bør reagere med fluorescerende fargestoffer i den foldede form av proteinet.
3. Introdusere cysteinrester i de ønskede steder ved å gjøre punktmutasjoner ved hjelp av standard seterettet mutagenese protokoller.
4. Ved en protease spaltningssete som spesifikt spalter ved en av de cysteiner fra proteinet. Dersomproteinsekvensen tillater det, innføre området ved konservativt muterende protein for å ha et trombin (gjenkjenningssekvens LVPRGS) eller faktor Xa (gjenkjennelsessekvens IDGR eller IEGR) sekvens nær innført cystein og tilgjengelig for proteasespaltning spalting; ellers tetra eller hexa-peptid-sekvensen kan innføres som en helhet. Velg området slik at ved spalting av en av de innførte cysteiner dissosierer fra resten av protein-i visse tilfeller kan dette kreve to kutteseter som flankerer et mutert cystein.

3. Test Expression og funksjonalitet av Protein

1. Utfør en western blot å bekrefte uttrykk for det muterte protein.
2. Utfør en funksjonell analyse av proteinet for å sikre at mutasjoner har endret protein funksjon bare minimalt, om i det hele tatt, for å unngå å studere konformasjonsendringer i en dysfunksjonell protein.
   MERK: Siden alle proteiner har ulike funksjoner, det er ingen enkel f unctional assay som brukes spesielt for LRET; Imidlertid, noen eksempler på funksjonelle assayer inkluderer enzymaktivitetsmålinger for enzymer, ligand-bindende analyser for reseptorer, og elektrofysiologiske studier for ionekanaler.

4. Velg fluoroforene som skal brukes

Velg fluoroforer basert på den forventede avstandsområde som skal måles, slik at området er mellom 0.5-1x R ₀ av fluoroforen paret.
MERK: Dette gir en enklere subtraksjon av bakgrunnen, som typisk har mye lengre levetid. Hvis for eksempel den forventede avstandsområde som skal måles er rundt 35 Å, en passende fluoroforen par til bruk ville være terbium chelat som donor og Alexa 594 som akseptor, fordi R ₀ for dette paret er 53 Å (tabell 1).

5. Uttrykk Protein ved forbigående transfeksjon den nødvendige mengden av pattedyrceller

ntent "> forbigående transfektere for proteinet av interesse inn i de utvalgte pattedyrceller ved hjelp av en hvilken som helst av de vanlige reagenser transfeksjon Vanligvis bruker fire 10 cm skåler pr LRET eksperiment for HEK og CHO-cellelinjer,. imidlertid kan denne mengden variere avhengig av proteinekspresjon , stabilitet, etc.. tillate cellene å uttrykke proteinet i 36-48 timer før høsting.

6. Marker Proteiner

1. Ta av celler fra kultur parabolen. Løsne HEK celler ved ganske enkelt å pipettere buffer mot bunnen av fatet. Løsne CHO-celler med en celleskrape, vask av media med ekstracellulære buffer.
2. Samle cellene ved sentrifugering ved 1100 x g i 3 min. Bruk disse samme sentrifuger innstillinger for å samle celler etter merking, så vel som etter de etterfølgende vaskinger.
3. Suspender celler i 3 ml ekstracellulær buffer, og deretter legge donor og akseptor fluoroforer i ekvimolare mengder opp til en sluttkonsentrasjon på 100-300 nM. Inkuber på en rotator feller 1 t ved RT.
4. Vask disse merkede celler 3-4x med ekstracellulære buffer for å fjerne ubundet fluoroforene, da suspendere disse cellene i ekstracellulære buffer (vanligvis 2 ml) for LRET målinger.
5. Som en kontroll, merkes et separat sett av celler med kun giver fluoroforen (terbium chelat), uten tilsetning av noen akseptor fluoroforen.
   MERK: Data fra disse donor-bare eksperimenter er nødvendig for å fullføre analysen. Disse forsøk kan utføres på samme eller forskjellige dager.
6. Igjen utfører funksjonelle validering, denne gang merket med mutant protein, som etiketteringsprosessen kan også forstyrre funksjonen avhengig av området anvendes for merking.
   MERK: Disse eksperimentene kan utføres på samme eller forskjellige dager.

7. Sett opp LRET Experiment

1. Plasser de resuspenderte celler i en kvartskuvette med et minimum volum på 1 ml.
2. Slå på datamaskinen og instrumentet og justere parametere til daten anskaffelsesprogram tilsvarende.
   1. Sett eksitasjonsbølgelengde på absorbansen spekter av donor fluoroforen (330-340 nm fungerer godt for terbium chelat).
   2. Sett utslipp bølgelengde riktig, husk at akseptor utslipp varierer basert på akseptor brukes. Viktigere, velg en detekteringsbølgelengde som måler bare akseptor utslipp og inkluderer ikke eventuelle gjennomslag fra donor utslipp. For eksempel bruke en bølgelengde på 565 nm for Alexa 555 som en akseptor Tabell 1. For donor-bare målinger, der protein ble merket bare med donor, men uten akseptor, bruker en bølgelengde på 545 nm for måling terbium chelatet utslipp.
   3. Angi lengden på deteksjon utslipp å være minst tre ganger den forventede LRET levetiden for å sikre at en lang levetid komponent ikke vil bli savnet.
3. Utføre skanningen. Gjør minst tre skanninger av 99 sweeps å sikre konsistens av resultater. Lagre the resultatene som en tekstfil (* txt).
4. For å måle konformasjonsendringer av et protein med hensyn til ulike tilstander (slik som tilsetning av en ligand), endre disse betingelsene og igjen utføre minst tre skanninger av 99 sveiper hver på den samme prøven i henhold til denne nye tilstand. Ved å studere virkningene av glutamat på konformasjon av glutamatreseptorer, for eksempel legge glutamat til 1 mM til samme prøve skannet i trinn 7.3, og deretter skanne igjen.
5. Legg opptil fem enheter av den aktuelle protease og ta skanninger kontinuerlig til spalting er fullstendig og ingen ytterligere endring er sett i levetiden for tre suksessive skanninger. Vanligvis er cleavage komplett i to til tre timer. Hvis en Faktor Xa-spaltningssete som blir brukt til protease spalting, for eksempel, tilsett 3 mL av faktor Xa i prøven, og skanne hvert 30 min i 3 timer.

8. Analysere data innhentet

1. Åpne data analyse programvare.
2. Laste fluorescens levetiddata ved hjelp av Import ASCII å åpne tekstfiler. Laste alle replika samt de endelige bakgrunnsmålinger, i én fil.
3. Gjennomsnittlig dataene fra alle skanner for hver eksperimentell betingelse for å få de endelige dataene. For å gjøre dette, markere kolonnene som inneholder de enkelte studiene, deretter under Data-menyen i menylinjen, klikk på Statistisk på rader som skal vises gjennomsnittlig fluorescens intensiteter fra forsøkene, samt standardavvik og standardfeil.
4. Plott gjennomsnittsverdiene som en linjegraf med fluorescensintensiteten på Y-aksen og levetiden i mikro på X-aksen for å lage en kurve som representerer det levetiden av sensitivisert utslipp av akseptor. Endre Y-aksen av plottet til en log skala, for å tillate bedre visualisering av dataene.
5. Gjenta trinn 8.3 på bakgrunn måledata, i snitt de siste skanninger som viser overlapp indikerer komplett cleavage.
6. Vise gjennomsnittsbakgrunnsdata påsamme tomten som inneholder i gjennomsnitt rådata. For å gjøre dette, åpne Layer Kontroll dialogboksen funnet under Plot menyen. Deretter overfører data som inneholder bakgrunnen bety inn i listen over Layer Innhold.
7. Juster gjennomsnittsbakgrunnsdata til gjennomsnittet rådata. For å gjøre dette, kan du bruke det matematiske funksjonen under menyen Math å multiplisere eller dividere bakgrunnsdata etter behov til halen slutten av bakgrunnen overlapper med halen slutten av rådata.
   MERK: På dette tampen, levetiden fra protein av interesse skal allerede ha helt morkne bort; det er på linje er bare bakgrunnssignalet tilstede både før og etter å ha protease-spalting.
8. Trekk fra justert bakgrunnssignal fra den første rå LRET signal, igjen ved hjelp av det matematiske funksjonen.
9. Monter data til en eksponentiell (én eller flere eksponenter, avhengig av hvilke områder og eksperimentell design).
   1. Sett start grensen for montering for å begynne etter sluttenav laserpulsen. Bruke samme startpunkt for alle påfølgende kurve beslag.
   2. I Velg Fitting Function dialogboksen velger eksponentiell, slik som å passe levetiden til følgende ligning for en enkelt eksponentiell:
      Ekv. 4
      der, representerer y fluorescensintensiteten, y ₀ representerer bakgrunnsintensitet på grunn av støy fra systemet, A er _en signalintensiteten, t er fluorescens levetid, x er tiden, x og ₀ er den tidsforskyvning.
   3. Fix x _0-0, starte tilpasningsfunksjonen, og passe dataene.
      MERK: Hvis forsøket er utformet for å ha signal bare fra ett par av områder, bør de resulterende data enkelt være i form av en enkelt eksponensiell desintegrasjon ^8. Den gjenværende av passformen er en god metode for å bestemme godhet av passform og hvis ytterligere forfall levetid er required.
10. Bruk levetid oppnådd fra dataene for å beregne avstanden mellom fluoroforer ved hjelp Förster ligning (et rearrangement av Ligninger 1 og 2 ovenfor):
    Ekv. 5
    MERK: Alle variablene er som nevnt ovenfor med τ _DA å ha blitt målt som lysfølsomt akseptor utslipp levetid. Ytterligere detaljer og eksempler på målinger av R ₀ og R kan finnes andre steder ^7,9,10.
11. Gjenta eksperimentet og dataanalyse i minst tre ganger for å sikre reproduserbarhet. Inkonsekvens mellom enkelt repetisjoner av den samme målingen setter spørsmålstegn ved gyldigheten av data; bruke flere kontrollforsøk eller repetisjoner. Beregn feil i målingen ved hjelp av gratis Gustavus Feil analyse kalkulator (utviklet av Dr. Thomas Huber) eller et lignende system som forplanter feilen ipasser av levetiden.

Representative Results

En vellykket LRET måling med en lantanid donor bør ha en donor bare levetid i millisekund tidsområde. Levetiden for lysfølsomt LRET utslippet for proteinet merket med både donor og akseptor vil være særlig kortere, med en levetid i mikrosekundområde etter at bakgrunnen subtraksjon Figur 3. Protease spaltningsprodukter derav resulterer i en økning i levetid som skulle være stabil over tid ( dvs. ikke lenger endrer), som viser at proteasen spalting er fullført Figur 4. Hvis LRET signalet kommer fra bare ett sett med områder, bør den resulterende emisjons levetid etter subtraksjon av bakgrunnen gir en enkelt eksponensiell levetid.

Ved måling konformasjonsendringer, bør det spesifikke LRET signalet viser en endring i levetid utsiden av feilen i målingen Figur 3. Kan Feilen av målingen beregnes ved forplantning av feilens forbundet med tilpasningen av de levetid. Etter montering av data til minimum antall eksponentiell funksjoner som er beskrevet i likning 4, levetid, τ, kan bestemmes. Ved hjelp av ligning 5, kan donor-akseptor og donor-bare levetid brukes sammen med _R-0-verdien for LRET paret for å beregne avstanden mellom de to fluoroforer under de betingelser som ble testet. Om avstanden endringen som følge av skiftende disse forholdene til den overordnede strukturen og funksjonen av proteinet er nå jobben med eksperimentator.

Figur 3. LRET målinger av Acid-Sensing ionekanal 1a (ASIC1a). Fluorescensintensitet er plottet på en logaritmisk skala for å forbedre den enkle visuelle tolkning. (A) Donor-bare prøvene viser en enkelt-exponential forfallet som ikke endres med pH. (B) I donor-akseptor merkede prøver, er en reduksjon i levetiden for lysfølsomt utslipp sees ved en nedgang i pH 8-6 (svart til rød). Denne levetid reduksjon indikerer en reduksjon i avstanden mellom finger og tommel-domener av ASIC1a. Dette tallet har blitt forandret fra Ramaswamy, et al, 2013 ^8.

Figur 4. Effekt av bakgrunns subtraksjon på LRET målinger gjort på Acid Sensing ionekanal 1a (ASIC1a). Områdene å være spesielt merket med fluoroforer er atskilt med et protease spaltningssete. Etter LRET målingene er gjort, er protease introdusert til proteinprøven og påfølgende spalting av proteinet av interesse resulterer i et tap av det spesifikke signalet. Enhver LRET som gjenstårer bakgrunnsfluorescens fra fluoroforer bundet til andre cysteiner som er tilstede på andre membranproteiner. Subtrahere denne bakgrunn isolerer de sanne LRET data for proteinet av interesse. Dette tallet har blitt forandret fra Ramaswamy, et al, 2013 ^8.

Discussion

LRET er en kraftfull teknikk som gjør det mulig for forskere å måle avstander mellom domenene i et enkelt protein, så vel som mellom underenheter i et multimert protein. Som sådan er LRET godt egnet til å undersøke de konformasjonsendringer og dynamikken i proteiner eller andre makromolekyler. Ovennevnte protokoll bør tillate riktig utstyrt lab for enkelt å teste sine hypoteser; Men det er mange vanlige feilkilder som kan plage den nye etterforsker. Hvis liten eller ingen LRET signal er sett, sjekk først bølgelengde innstillingene som brukes. Eksitasjon bør være i absorpsjons-området terbium (330-340 nm). For donor bare målinger, hvori prøven er blitt merket bare med donor fluoroforen og akseptor uten fluoroforen, bør emisjonsbølgelengde være på en av toppene vist i figur 1, mens det for donor-akseptor målinger, bør den emisjonsbølgelengde sams akseptor fluoroforen blir brukt Tabell 1. Dersom wavelength innstillingene er riktige, sjekke kompatibiliteten av buffere. Noen fluoroforer kan ikke være kompatibel med visse buffere eller i visse pH-områder. Neste, sikre at valg av rester og fluorophores er kompatible. Ved den eksperimentelle design er fullstendig korrekt, så problemet sannsynlig ligger enten med fluoroforer eller proteinet selv. Over tid kan stamløsninger av fluoroforer nedbrytes, og kan resultere i utilstrekkelig merking. Til slutt kontrollerer ekspresjon og funksjonaliteten til proteinet. Mange mutasjoner er blitt tilsatt, inkludert innføring av cysteiner, fjerning av innfødte cysteiner, og innføring av minst en protease spaltningssete. Således er det mulig at, selv under normale transfeksjon betingelser, de innførte mutasjoner destabilisere proteinet og forårsake under-ekspresjon av proteinet av interesse, å senke signal sett. Hvis uttrykt, kan mutasjoner eller merking forårsake denaturering av proteinet, forårsaker de rester som skal plasseres på en annenfra forventet avstander sett i vill-type protein. Western blots kan brukes til å kontrollere ekspresjon av proteinet. Hvis det er spørsmål om handel med et overflatemembranprotein, biotinylering av celleoverflaten og trekker ned av overflateeksponerte protein, etterfulgt av en Western blot for proteinet av interesse, vil spesifikt påvise flaten handel. For funksjonstester, er det ingen enkel analyse for å anbefale for bruk spesielt med LRET, siden LRET kan brukes på en rekke forskjellige proteintyper. Igjen skjønt, mulige eksempler på funksjonelle assayer inkluderer enzymaktivitetsmålinger, ligand-bindingsundersøkelser, og elektrofysiologiske studier. Hvis protein uttrykk eller funksjon har vært altfor negativt påvirket av de innførte mutasjoner, deretter nye merkesider må velges.

Hvis en LRET signal er sett, men kan ikke monteres av en enkelt eksponentiell når et slikt resultat er forventet, sjekk først at bakgrunnen var riktig trekkes fra. Hvis after subtraksjon, en multi-eksponentiell er sett, kan dette signalet være en indikasjon på LRET å bli observert av andre enn det som var ment flere interaksjoner. Kontroller at alle andre tilgjengelige cysteiner har blitt fjernet fra protein. Hvis en krystallstruktur er tilgjengelig, vil det være et svært nyttig verktøy for å se etter disse cysteiner. Igjen, disulfid-limt og begravet, trenger utilgjengelige cysteiner ikke trenger å bli mutert unna. For å teste forhindringer av disse cysteiner hvis det er en tvingende grunn til ikke å mutere dem bort, innføre en ikke-innfødt cystein i proteinet og forsikre at det ikke er LRET signal i et donor-akseptor-merket prøve. Hvis alle tilgjengelige cysteiner har faktisk blitt mutert bort, og hvis proteinet har flere underenheter, eller er en del av et kompleks, så det kan være forvirrende LRET signal på grunn av fargestoff feste til de nærliggende proteiner eller subenheter. Å velge en annen protease cleavage nettstedet kan hjelpe med disse problemene; ellers annen merking nettstedets kan trenge å bli valgt. Til slutt, hvis problemet med tilpasning er ganske enkelt et spørsmål om signal-til-støy, er det sannsynlig at problemet på grunn av lav ekspresjon av proteinet. Expression må da være optimalisert gjennom ulike transfeksjonsteknologier forhold, en annen vektor, etc.

Hvis LRET målinger produsere en isolert eller tilsynelatende fysisk meningsløst resultat, kan det være protein-spesifikke problemer som kanskje ikke er lett opplagt. For eksempel, med syre-avføling ionekanaler, selv forsiktig tilsetning av en syre for å endre pH-verdien kan resultere i noen celledød og proteindenaturering. Således flere prøver må være forberedt på, en for hver pH-verdi som skal testes. Også, i tillegg til resonans energioverføring, kan lokale miljøendringer påvirker et fluorescens-signal. En slik endring, dersom dette er vesentlig, ville bli lagt merke til i donor-bare måling som en dobbel eller fler eksponensiell desintegrasjon. I disse tilfellene merke nettsteder må flyttes til ulike stillinger til make at endringer i forholdene endrer ikke de spektrale egenskapene til de fluoroforer.

Selv mens du holder disse kildene til problemene i tankene, er det noen ting til og begrensninger av LRET hvorav en eksperimentator må være klar. Først konvensjonell merking teknikken er avhengig av merking cysteinrester. For å redusere merking av uspesifikke rester, er andre cysteiner typisk mutert ut; Imidlertid er denne metoden ikke alltid praktisk. For eksempel, hvis et protein har mange ikke-disulfid-bundet cysteiner som hører hjemme i sin struktur som er kritisk for proteinets struktur eller funksjon, og deretter mutere dem vil være umulig, i stor grad øke begrensning av teknikken og tolkningen av dataene. Dessuten er teknikken LRET mer egnet til å detektere endringer i avstand, i stedet for absolutte avstander, da eventuelle feil på absolutte avstand på grunn av virkningen av orienteringen faktor κ ² i R _0-verdien sannsynligvisfor å bli redusert i avstand endring analyse fordi disse feilene påvirke målingene under alle betingelser like. Alternative teknikker kan bli gjort for å overvinne noen av disse begrensningene. For eksempel, for å unngå å legge for mange cysteiner, kunne man påføre en His-tag og merk den med en fluoroforen bundet til nikkel-NTA. Dessuten kan innfødte tryptophans brukes som en av fluoroforer med den forutsetning at dersom det brukes som en donor, tryptophans har en mye mindre levetid enn terbium, således intensitetsbaserte målinger kan være mer passende enn levetid målinger. Hvis mer nøyaktig atom til atom avstander er nødvendig, teknikker som røntgen-krystallografi, molekyldynamikk, eller NMR fremdeles er mer hensiktsmessige teknikker for å få disse absolutte avstander.

På grunn av sin utsøkte følsomhet å distansere endringer, kan LRET måle avstand endringer med Angstrom-nivå oppløsning for løsning-fase proteiner og kan gi eksperimentelle data uten behov for høy-Purity, isotopmarkører eller størrelsen begrensning som svekker både NMR og molekyldynamikk. Etter å ha lært og mestre teknikken, kan undersøkelser i konformasjonsendringer av proteiner gjøres mye raskere og med mer letthet enn allerede tilgjengelige konvensjonelle teknikker. LRET gir også et godt grunnlag for videre spesialiserte resonans energi overføring teknikker som enkelt molekyl FRET (smFRET), som kan undersøke befolkningen distribusjon av conformational tilstander av individuelle molekyler, snarere enn ensemble gjennomsnittet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate	Life Technologies	PV3579
Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide	Life Technologies	F-150	Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide	Life Technologies	A-10254	Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide	Life Technologies	A-20346	Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide	Life Technologies	A-10256	Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide	Life Technologies	A-20344	Choice of acceptor depends on the specific experiment
QuantaMaster 3-SS	Photon Technology International		Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the millisecond range
FluoreScan 2.0	Photon Technology International		Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument
Origin 8.6	OriginLab		Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software
Quartz cuvette	Starna Cells, Inc	3-Q-10
Stir bar	Bel-Art Products	F37119-0007	Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette