Summary
Vi beskriver her en forbedret Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) metode, hvor vi indfører en proteasespaltningssted mellem donor og acceptorfluoroforen websteder. Denne ændring giver os mulighed for at opnå konkrete LRET signaler, der stammer fra membranproteiner af interesse, der giver mulighed for studiet af membranproteiner uden proteinoprensning.
Abstract
Luminescence resonansenergioverførsel eller LRET, er en kraftfuld teknik, der anvendes til at måle afstande mellem to steder i proteiner inden for afstande fra 10-100 Å. Ved at måle afstandene under forskellige ligerede betingelser kan konformationelle ændringer i proteinet let vurderes. Med LRET, et lanthanid, oftest chelateret terbium, anvendes som donorfluoroforen, der giver fordele, såsom en længere donor kun emission levetid, fleksibilitet til at bruge flere acceptor fluoroforer, og mulighed for at opdage sensibiliseret acceptor emission som en nem måde at måle energioverførsel uden risiko for også at detektere donor kun signal. Her beskriver vi en metode til at bruge LRET om membranproteiner, der er udtrykt og analyseret på overfladen af intakte mammale celler. Vi introducerer en proteasespaltningssted mellem LRET fluoroforen par. Efter opnåelse af den oprindelige LRET signal spaltning på dette sted fjerner specifik LRET signal fra proteinet afinteresse tillader os at kvantitativt trække baggrunden signal, der er tilbage efter spaltning. Denne fremgangsmåde giver mulighed for mere fysiologisk relevante målinger skal foretages uden behov for oprensning af protein.
Introduction
Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) er et derivat af det velkendte fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) teknik 1. Svarende til FRET kan LRET anvendes til at måle afstande og ændringer afstand mellem donor og acceptor fluoroforer bundet til specifikke steder på proteinet af interesse inden for området 10-100 Å 1-3. Principperne for LRET ligner også FRET i at resonansenergioverførsel forekommer mellem to proksimale fluorophorer når emissionsspektret for donorfluoroforen overlapper med absorptionsspektret af acceptor-fluorofor. Effektiviteten af denne overførsel er relateret til afstanden mellem de to fluoroforer ved følgende ligning:
Lign. 1
hvor R er afstanden mellem de to fluoroforer, E er effektiviteten af enEnergiministeriet overførsel, og R 0, diskuteres nedenfor, er Forster radius fluoroforen par, dvs den afstand, hvor effektiviteten af overførslen er halvmaksimal. Fra denne ligning kan man se, at effektiviteten er relateret til størrelsen af afstanden hævet til den inverse sjette strøm 1. Det er denne inverse sjette magt afhængighed, der giver mulighed for FRET og LRET målinger for at være udsøgt følsom for selv små ændringer i afstand, når nær R 0 i FRET-par. Evnen til specifikt mærke ønskede steder på proteiner eller andre makromolekyler gør det muligt at drage fordel af denne følsomhed til at overvåge konformationelle ændringer.
Sammenlignet at ærgre sig, som anvender konventionelle organiske farvestof molekyler, LRET byder på flere fordele. I LRET, i stedet for anvendelse af et organisk farvestof, som donorfluoroforen en lanthanidrækken kation, typisk Tb 3+ eller Eu3 +, anvendes 1,4-6. Fluoroforer, der falder under denne kategori, f.eks terbium-chelat, er også meget alsidige, idet de kan anvendes sammen med en lang række acceptor-fluoroforer. Denne fleksibilitet er muligt fordi emissionsspektret chelaterede lanthanider indeholde flere skarpe emissionstoppe, giver mulighed for en enkelt art af donorfluoroforen, der skal anvendes med en af en lang række acceptor-fluoroforer. Således kan lysfølsomme acceptor emission detekteres uden frygt for kontaminerende gennemblødning fra donor emission 5. Forsøgslederen vælger specifikke acceptor baseret på den forventede afstand mellem de to fluorophorer (Figur 1 og tabel 1). I disse chelaterede lanthanid fluoroforer er metalion chelateret med et molekyle, som indeholder en antenne gruppe, sensitizes normalt dårligt absorberende lanthanid til excitation samt en bioreaktive funktionel gruppe at binde ionen til en specifik funktionel gruppe på makromolekylet 1, 5,6. ONCe ophidset, lanthanider slappe af til grundtilstanden via frigivelse af fotoner med en henfaldshastighed i millisekunder. Fordi henfaldet er hverken et singlet-til-singlet afslapning eller en triplet-til-singlet afslapning, emission af fotoner kan ikke med rette kaldes fluorescens eller morild, men er mere korrekt betegnes luminescens 1. Den lange henfald af lanthanid luminescens høj grad hjælper i levetid målinger. Lifetime målinger kan derefter anvendes til at bestemme effektiviteten via følgende forhold:
Lign. 2
hvor E er effektiviteten af overførsel, τ D er levetiden af donor (chelateret lanthanide), når der ikke deltager i energioverførsel, og τ DA er levetiden af donoren, når de deltager i energioverførsel med acceptoren. Med LRET, τ OB kan alså måles som levetid sensibiliserede acceptor emissionen fordi terbium levetid er så meget større end en organisk acceptorfluoroforen. Acceptoren udsender med samme levetid som sin opfordring excitation (donor lanthanid), og ethvert bidrag til levetid fra acceptoren egen iboende fluorescens levetid er forholdsvis ubetydelig. Ved at måle den lysfølsomme emissionen end donor emission vi også eliminere behovet for at sikre mærkning på nøjagtigt en 1: 1-forhold mellem donor-acceptor. Protein kan i stedet mærkes samtidig med både acceptor og donor fluoroforer. Et heterogent mærket befolkning vil medføre, men dobbelt-donor-mærkede proteiner vil ikke udsende i acceptor bølgelængde og dobbelt-acceptor mærkede proteiner vil ikke være begejstret. Endvidere bør afstanden mellem fluoroforer være den samme, uanset hvilket cystein stedet en given fluorofor tillægger, især ved anvendelse af de isotrope lanthanider som en donor, så need for at angive et givet sted at modtage enten donoren eller acceptoren er unødvendig. Intensitet kan blive påvirket med en heterogen population, men bør stadig være mere end nok til at blive opdaget.
Når du planlægger eksperimenter, bør valget af fluoroforer være dikteret af R 0 værdien af parret såvel som den forventede afstand interval der måles. R 0-værdien er defineret ved følgende ligning:
Lign. 3
hvor R 0 er Förster radius i Ångstrøm, κ 2 er den orientering faktor mellem de to farvestoffer (normalt antages at være 2/3), φ D er kvantumsudbyttet donorens, J er den spektrale overlapning integreret mellem donorens emissionsspektrum og acceptorens absorbansspektrum i M - 1cm -1 nm 4, og n er brydningsindekset for mediet 1.
Vores laboratorium har tilføjet en modifikation til den konventionelle LRET teknik ved at indføre et proteasegenkendelsessted mellem donor og acceptor label sites på proteinet, som testes. Denne modifikation giver mulighed for undersøgelse i ikke-oprenset systemer såsom hele pattedyrceller 7. Denne teknik er især nyttig, når cysteiner som lokaliteter til mærkning, idet processen mærkning med maleimid-konjugeret farvestoffer, som binder til cystein sulfhydrylgrupper, andre proteiner på de celler, der har cysteiner er også mærket. Men ved herunder protease-spaltningssteder på proteinet af interesse og måling levetider før og efter spaltning forsøgslederen kan kvantitativt subtrahere baggrunden signal efter proteasespaltning fra råsignalet. Denne subtraktion isolerer specifikt signal hidrørende fra proteinet af interesse (figure 2). Brug modifikation beskrevet ovenfor kan LRET anvendes til at måle ændringer i afstanden mellem terbium-chelat donoren og acceptor-proben på et protein, og således overvåge konformationelle ændringer i proteinet nær fysiologiske tilstand uden kravet om oprensning.
Figur 1.Den absorption og emission spektre af chelateret terbium i sort, samt en repræsentant acceptor, Alexa 488, i rødt. Bemærk de mange emissioner toppe og den skarpe, smalle emission interval for hver top af terbium chelat. Dette mønster tillader terbium, der skal anvendes med en række acceptor fluoroforer og letter målingen af sensibiliserede emission inden for disse intervaller, hvor terbium viser ingen emission. Terbium udledning top ved 486 nm overlapper ganske godt med en bsorption højdepunkt for Alexa 488, giver mulighed for resonansenergioverførsel forekommer mellem de to fluorophorer. En bølgelængde på 515 nm er et glimrende valg til at opdage sensibiliseret emissionen for dette par, da det er i dalen mellem emissionstoppe terbium, og ganske nær Alexa 488 emission højdepunkt på 520 nm. Bemærk, at det at være i nærheden af acceptor højdepunkt, selvom ønskelig, ikke er nødvendig-565 nm er stadig i stand til at detektere Alexa 488 emission, uden også at afsløre terbium emission.
| Acceptorfluoroforen | R 0 (a) | Emission bølgelængde (nm) |
| Atto 465 | 36 | 3px; "> 508|
| Fluorescein | 45 | 515 |
| Alexa 488 | 46 | 515 |
| Alexa 680 | 52 | 700 |
| Alexa 594 | 53 | 630 |
| Alexa 555 | 65 | 565 | 65 | 575 |
Tabel 1. En liste over almindeligt anvendte acceptor fluoroforer for LRET hjælp terbium chelat som donoren 11. R-0-værdier blev målt, når donoren og acceptoren var knyttet til den opløselige agonist bindingsdomæne af AMPA-receptorer. Det er ideelt at måle R 0 værdien igen for hvert nyt system, der undersøges.
Figur 2. En oversigt over LRET metode præsenteres. (A) AMPA-receptoren er et membranprotein, som undergår konformationelle ændringer efter ligandbindende. Den clamshell-formede ligand-binde domæne er omgivet her i rødt. (B) Det ligandbindende domæne af AMPA, når den ikke er bundet til protein eksisterer i en åben konformation (venstre). Når de er bundet til ligand glutamat proteinet lukker omkring dets ligand (til højre). Ved at placere fluoroforer på overbevisende sites på LBD, kan arten af denne konformationsændring ses som afstanden mellem fluoroforer ændringer, som derefter vil påvirke fluorescenslevetid. (C) Ved mærkning af hele celler, kan forekomme mærkning af både proteinet af interesse samt membranproteiner baggrund (venstre). Efter proteasespaltning vil LRET signal fra proteinet af interesse forsvinde på grund af frigivelsen af et opløseligt fragment forlader baggrundssignal intakt (højre). Denne baggrund signal kan så trækkes fra det rå signal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Opret konstruktion indeholdende proteinet af interesse
Klone genet, der udtrykker proteinet af interesse i en egnet vektor. Brug vektorer, såsom pcDNA serie eller pRK5 som de er velegnet til ekspression i mammale systemer som HEK293 og CHO-celler.
2. Vælg de steder på proteinet, der skal mærkes med Fluoroforer
- Vælg mærkningsordninger websteder, der er i stand til at afspejle eventuelle konformationsændringer inden proteinet. Hvis det er muligt, skal du bruge en krystal struktur af proteiner eller et homologt protein for at hjælpe med at gøre denne bestemmelse. Hvis der ikke er nogen krystalstruktur til rådighed, anvendes online software til at forudsige mulig struktur af proteinet og dermed modtage indsigt i passende steder.
- Vælg rester, at kæderne af udvalgte rester side er overfladeeksponeret og tilgængelige for fluoroforer, således at proteinet kan mærkes.
- Vælg rester,er ikke kritisk til protein-funktion, for eksempel websteder, der ikke er involveret i ligandbinding.
- I sin introduktion cystein mutation, give fortrinsret til websteder, der ligner, for eksempel serin, der ville forårsage minimal forstyrrelse af protein struktur.
- Når du har valgt de mærkningsordninger websteder, foretage de mutationer for at sikre, at proteinet kun giver LRET fra disse beregnet websteder. Brug standard steddirigeret mutagenese protokoller til at mutere væk ikke disulfidbundne cysteiner, der potentielt binder til maleimid-konjugerede fluorescerende mærker. Ikke mutere væk disulfidbundne cysteiner og begravet, frie cysteiner, da de ikke reagerer med fluorescerende farvestoffer i den foldede form af proteinet.
- Indførelse cysteinrester i de ønskede steder ved at punktmutationer ved anvendelse af standard mutagenese protokoller.
- Omfatter en protease-spaltningssted, som specifikt kan fraspalte en af de cysteiner fra proteinet. Hvisprotein-sekvens giver mulighed for det, indføre webstedet ved konservativt mutere proteinet at have en thrombin (genkendelsessekvens LVPRGS) eller faktor Xa (anerkendelse sekvens IDGR eller IEGR) sekvens nær den indførte cystein og tilgængelige for proteasespaltning; ellers tetra- eller hexa-peptid-sekvens kan indsættes som en helhed. Vælg det site, således at ved spaltning af en af de indførte cysteiner dissocierer fra resten af proteinet, i visse tilfælde, kan dette kræve to spaltningssteder, som flankerer et muteret cystein.
3. Test Expression og proteinets funktionalitet
- Udfør en Western blot for at bekræfte ekspression af det muterede protein.
- Udfør en funktionel analyse af proteinet til at sikre, at mutationer har ændret proteinfunktion kun minimalt, hvis overhovedet, for at undgå at studere konformationelle ændringer af dysfunktionel protein.
BEMÆRK: Da alle proteiner har forskellige funktioner, er der ingen enkelt f unctional analyse, der bruges specifikt til LRET; imidlertid nogle eksempler på funktionelle assays indbefatter enzymaktivitetassays for enzymer, ligandbindende assays for receptorer og elektrofysiologiske studier til ionkanaler.
4. Vælg de Fluoroforer der skal bruges
Vælg fluoroforer baseret på det forventede distance interval, der måles, således at området er mellem 0.5-1x R 0 af fluoroforen par.
BEMÆRK: Dette giver mulighed for en lettere subtraktion af baggrunden, som typisk har meget længere levetid. For eksempel hvis den forventede afstandsområde måles er omkring 35 Å, en passende fluorophor par at bruge ville være terbium-chelat som donor og Alexa 594 acceptoren, fordi F 0 for dette par er 53 Å (tabel 1).
5. udtrykke proteinet ved Transient transfektion den nødvendige mængde pattedvrceller
ntent "> Transient transfektion proteinet af interesse i de valgte pattedyrceller ved hjælp af enhver af de fælles transfektionsreagenser typisk bruge fire 10-cm retter pr LRET eksperiment for HEK og CHO cellelinier,. dog kan dette beløb afhænger af protein-ekspression , stabilitet, etc.. Lad cellerne at udtrykke det protein, for 36-48 timer før høst.6. Mærk Proteiner
- Frigør celler fra dyrkningsskålen. Frigør HEK-celler ved at pipettere buffer mod bunden af skålen. Frigør CHO-celler med en celle skraber, afvaskning medierne med ekstracellulær buffer.
- Saml cellerne ved centrifugering ved 1.100 xg i 3 min. Brug disse samme centrifuge indstillinger til indsamling celler efter mærkning, samt efter de efterfølgende vaske.
- Suspender celler i 3 ml ekstracellulær puffer, derefter tilføje donor og acceptor fluoroforer i ækvimolære mængder på op til en endelig koncentration på 100-300 nM. Inkuberes på en rotator feller 1 time ved stuetemperatur.
- Vask disse mærkede celler 3-4x med ekstracellulær buffer for at fjerne ubundne fluoroforer, så suspendere disse celler i ekstracellulære buffer (normalt 2 ml) til LRET målinger.
- Som en kontrol, mærke et separat sæt af celler med kun donorfluoroforen (terbium chelat) uden tilsætning af nogen acceptorfluoroforen.
BEMÆRK: Data fra disse donorer kun eksperimenter er nødvendig for at gennemføre analysen. Disse eksperimenter kan udføres på samme eller forskellige dage. - Igen, udføre funktionel validering, denne gang med mærket mutantprotein, som mærkningen proces også kan forstyrre funktionen afhængig webstedet anvendes til mærkning.
BEMÆRK: Disse eksperimenter kan udføres på samme eller forskellige dage.
7. Opsætning af LRET Eksperiment
- Placer resuspenderede celler i en kvartskuvette med et minimum volumen på 1 ml.
- Tænd computeren og instrumentet og justere parametrene for daten erhvervelse program i overensstemmelse hermed.
- Indstil excitationsbølgelængde til absorbansen række donorfluoroforen (330-340 nm fungerer godt for terbium-chelat).
- Indstil emissionsbølgelængden hensigtsmæssigt, at holde for øje, at acceptor emissionen varierer baseret på acceptor anvendes. Vigtigere er det, skal du vælge en detektionsbølgelængde der måler kun acceptor emission og omfatter ikke nogen gennemblødning fra donoren emission. For eksempel bruger en bølgelængde på 565 nm for Alexa 555 som en acceptor tabel 1. Til donor-kun målinger, hvor protein blev mærket kun med donor, men uden acceptor, skal du bruge en bølgelængde på 545 nm til måling terbium chelat-emission.
- Indstil længden afsløring emissionen at være mindst tre gange den forventede LRET levetid for at sikre en lang levetid komponent ikke vil blive savnet.
- Udføre scanningen. Må mindst tre scanninger af 99 fejer for at sikre ensartede resultater. Gem the resultater som en tekstfil (* txt).
- For at måle konformationsændringer af et protein med hensyn til forskellige betingelser (såsom tilføjelse af en ligand), ændre disse betingelser, og igen at udføre mindst tre scanninger af 99 fejer hver på samme prøve under denne nye betingelse. Hvis undersøgelse af virkningerne af glutamat på konformationen af glutamatreceptorer, for eksempel tilføje glutamat til 1 mM til den samme prøve scannes i trin 7.3, og derefter scanne igen.
- Tilføj op til fem enheder af passende protease og tage scanninger løbende indtil spaltning er komplet og ses ingen yderligere ændring i levetid for tre på hinanden følgende scanninger. Normalt spaltning er komplet i to til tre timer. Hvis et faktor Xa-spaltningssted bliver brugt til proteasespaltning for eksempel tilsættes 3 ul faktor Xa til prøven, og scanne hver 30 min til 3 timer.
8. Analyser de indsamlede data
- Åbn dataanalyse software.
- Indlæs fluorescenslevetiddata ved hjælp af Importer ASCII at åbne tekstfiler. Indlæs alle replikater samt de endelige baggrund målinger i én fil.
- Gennemsnittet af data fra alle de scanninger for hver eksperimentel betingelse for at få de endelige data. For at gøre dette, skal du markere de kolonner, der indeholder de individuelle forsøg, derefter under menuen Data i menulinjen, skal du klikke på Statistik på rækker til at vise de gennemsnitlige fluorescensintensiteterne fra forsøgene, samt standardafvigelsen og standard fejl.
- Plot middelværdierne som en linje graf med fluorescensintensitet på Y-aksen og levetid i mikrosekunder på X-aksen for at skabe en kurve, der repræsenterer levetid lysfølsomme emission af acceptoren. Skift Y-aksen af plottet til en logaritmisk skala, for at muliggøre en bedre visualisering af dataene.
- Gentag trin 8.3 på data måling baggrund gennemsnit de endelige scanninger, der viser overlapning indikerer fuldstændig spaltning.
- Vis de gennemsnitlige baggrundsdata omsamme plot, der indeholder de i gennemsnit rå data. For at gøre dette, skal du åbne lag dialogboksen findes under Plot-menuen. Derefter overføre data indeholder baggrunden betyder til listen over Layer Indhold.
- Juster de gennemsnitlige baggrundsdata til middelværdien rådata. For at gøre dette, skal du bruge simple matematik funktionen under menuen Math at multiplicere eller dividere de baggrundsdata efter behov, indtil enden af baggrunden overlapper enden af de rå data.
BEMÆRK: På dette hale ende, levetid fra proteinet af interesse burde allerede helt henfaldet; hvad der er på linie er simpelthen baggrundssignalet stede både før og efter proteasespaltning. - Fratræk den tilpassede baggrund signalet fra den oprindelige rå LRET signal, igen ved hjælp af simple matematik funktion.
- Monter data til en eksponentiel henfald (enkelt eller flere exponentials, afhængigt af hvilke sider og den eksperimentelle design).
- Indstil start grænse til montering at begynde efter afslutningenaf laserimpulsen. Brug denne samme startpoint for alle efterfølgende kurve fittings.
- I Vælg Fitting Funktion dialogboks vælger eksponentielle henfald, så de passer levetid følgende ligning for et enkelt eksponentiel henfald:
Lign. 4
hvor y repræsenterer fluorescensintensitet, y 0 repræsenterer baggrunden intensitet på grund af støj fra systemet, A1 er signalintensiteten, t er fluorescenslevetid, x er tiden, og x 0 er tidsforskydning. - Fix x 0-0, starte Fitting Function, og passer til dataene.
BEMÆRK: Hvis eksperimentet er designet til at have signaler fra et par af websteder, bør de resulterende data nemt være egnet ved en enkelt eksponentiel henfald 8. Det resterende af pasformen er en god metode til at bestemme godhed pasform og hvis yderligere henfald levetider er requirred.
- Brug levetider opnået fra de data, til at beregne afstanden mellem fluoroforer hjælp af Förster ligning (en omlægning af ligningerne 1 og 2 ovenfor):
Lign. 5
BEMÆRK: Alle variablerne er som nævnt ovenfor med τ OB er blevet målt som den sensibiliserede acceptor emission levetid. Yderligere detaljer og eksempler på, målinger af R 0 og R kan findes andetsteds 7,9,10. - Gentag forsøget og dataanalyse mindst tre gange for at sikre reproducerbarhed. Uoverensstemmelse mellem de enkelte gentagelser af samme måling sætter spørgsmålstegn ved gyldigheden af oplysningerne; bruge ekstra kontrol eksperimenter eller gentagelser. Beregn fejl i målingen ved hjælp af den gratis Gustavus Fejl analyse regnemaskine (udviklet af Dr. Thomas Huber), eller et tilsvarende system, der udbreder fejlen ianfald af levetiden.
Lign. 4 
Lign. 5 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En succesfuld LRET måling med et lanthanid donor bør have en donor kun levetid i millisekunder tidsinterval. Levetiden for sensibiliserede LRET emission for proteinet mærket med både donor og acceptor bliver især kortere, med en levetid i mikrosekund området efter baggrundssubtraktion Figur 3. Proteasespaltningssteder resulterer i en stigning i levetiden, der skulle blive stabil over tid ( dvs ikke længere skiftende), viser, at proteasespaltningsstedet er komplet figur 4. Hvis LRET signalet kommer fra kun ét sæt af websteder, bør den resulterende emission livstid efter subtraktion af baggrunden giver et enkelt eksponentiel levetid.
Ved måling konformationsændringer bør den specifikke LRET signal viser en ændring i levetid uden for fejl af målingen Figur 3. Kan Fejlen af målingen beregnes ved udbredelsen af fejlens forbundet med pasningen af levetider. Efter montering af data til det minimale antal eksponentielt henfald beskrevne funktioner i ligning 4, levetid, τ, kan bestemmes. Ved hjælp af ligning 5, kan donor-acceptor og donor kun levetider bruges sammen med R 0 værdi for LRET par til at beregne afstanden mellem de to fluoroforer under de testede betingelser. Vedrørende afstanden ændring som følge af ændring af disse forhold til den overordnede struktur og funktion af proteinet er nu en opgave for forsøgslederen.
Figur 3. LRET målinger af syre-Sensing Ion Channel 1a (ASIC1a). Fluorescensintensitet er plottet på en logaritmisk skala for at forbedre den lethed af visuel fortolkning. (A) Donor-kun prøver viser et enkelt exponential forfald, der ikke ændrer sig med pH-værdi. (B) Ved donor-acceptor mærkede prøver, er et fald i levetiden for sensibiliserede emission set på et fald i pH-værdi 8-6 (sort til rød). Denne levetid fald indikerer et fald i afstanden mellem tommel-og pegefinger domæner ASIC1a. Dette tal er blevet ændret fra Ramaswamy et al 2013 8.
Figur 4. Effekten af baggrundssubtraktion på LRET målinger foretaget på Acid Sensing Ion Channel 1a (ASIC1a). De steder, der specifikt mærket med fluoroforer er adskilt af en proteasespaltningssted. Efter LRET målinger foretages proteasen introduceret til proteinet prøven og efterfølgende spaltning af proteinet af interesse resulterer i et tab af specifikt signal. Alle LRET der forbliverer baggrundsfluorescens fra fluorophorer bundet til andre cysteiner er til stede på andre membranproteiner. Subtraktion denne baggrund isolerer sande LRET data for proteinet af interesse. Dette tal er blevet ændret fra Ramaswamy et al 2013 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LRET er en kraftfuld teknik, der gør det muligt for forskere at måle afstande mellem domæner i et enkelt protein samt mellem underenheder i et multimert protein. Som sådan er LRET velegnet til at undersøge de konformationelle ændringer og dynamikken i proteiner eller andre makromolekyler. Ovennævnte protokol bør tillade ordentligt udstyret laboratorium til nemt at afprøve deres hypoteser; Men der er mange fælles fejlkilder, der kan plage den nye investigator. Hvis der kun lidt eller ingen LRET signal ses først kontrollere bølgelængde indstillinger, der bruges. Excitation bør være i absorbans række terbium (330-340 nm). For donor kun målinger, hvor prøven er mærket kun donorfluorophor og uden acceptorfluoroforen bør emissionsbølgelængden være en af toppene vist i figur 1, mens donor-acceptor-målinger bør emissionsbølgelængden matche acceptorfluoroforen anvendes tabel 1. Hvis wavelength indstillinger er korrekte, skal du kontrollere foreneligheden af buffere. Nogle fluorophorer er muligvis ikke kompatible med visse buffere eller i visse pH-områder. Dernæst sikre, at valget af restprodukter og fluoroforer er kompatible. Hvis det eksperimentelle design er helt korrekt, så problemet sandsynligvis ligger enten med fluoroforerne eller selve proteinet. Over tid kan stamopløsninger af fluoroforer nedbrydes og kan resultere i utilstrækkelig mærkning. Endelig kontrollere ekspression og funktion af proteinet. Mange mutationer er blevet tilføjet, herunder indførelsen af cysteiner, fjernelse af native cysteiner og indførelse af mindst en protease-spaltningssted. Således er det muligt, selv under normale transfektion betingelser, de indførte mutationer destabilisere proteinet og årsag under-ekspression af proteinet af interesse, sænke signal set. Hvis udtrykt, kan mutationer eller mærkning forårsage denaturering af proteinet, der forårsager de rester, der skal placeres anderledesfra de forventede afstande ses i vildtypeprotein. Western blots kan anvendes til at kontrollere ekspression af proteinet. Hvis der er nogen spørgsmål om handel med en overflade membranprotein, biotinylering af celleoverfladen og pull-down af overfladeeksponerede proteiner, efterfulgt af en western blot for proteinet af interesse, specifikt vil demonstrere overflade menneskehandel. Til funktionelle tests, der ikke er en enkelt analyse til at anbefale til brug specifikt LRET, da LRET kan anvendes på en lang række forskellige protein-typer. Igen, selvom mulige eksempler på funktionelle assays indbefatter enzymaktivitetassays, ligandbindingsassays og elektrofysiologiske studier. Hvis protein ekspression eller funktion har været for negativt påvirket af de indførte mutationer, skal derefter vælges nye mærkningskrav sites.
Hvis et LRET signal ses, men kan ikke monteres af en enkelt eksponentiel når der forventes et sådant resultat, først kontrollere, at baggrunden var korrekt fratrukket. Hvis ofter subtraktion, en multi-eksponentiel henfald ses, kan dette signal være en indikation af LRET bliver observeret fra andre end hvad der var hensigten flere interaktioner. Kontroller, at alle andre tilgængelige cysteiner er blevet fjernet fra proteinet. Hvis en krystalstruktur er tilgængelig, vil det være et meget nyttigt værktøj til at kontrollere for disse cysteiner. Igen disulfidbundet og begravet, behøver utilgængelige cysteiner ikke behøver at være muteret væk. For at teste den manglende adgang til disse cysteiner, hvis der er en tvingende grund til ikke at mutere dem væk, indføre en ikke-native cystein i proteinet og sikre, at der ikke er noget LRET signal i en donor-acceptor mærkede prøve. Hvis alle tilgængelige cysteiner faktisk er blevet muteret væk, og hvis proteinet har flere underenheder eller er del af et kompleks, kan der være confounding LRET signal på grund af farve er knyttet til de nærliggende proteiner eller underenheder. Valg af en anden protease spaltningssite kan hjælpe med disse problemer; ellers andet mærkning websteds kan være nødvendigt at blive valgt. Endelig, hvis problemet med montering er simpelthen et spørgsmål om signal-støj, sandsynligvis problemet skyldes lav ekspression af proteinet. Ekspression vil derefter skal optimeres gennem forskellige transfektions- betingelser, en anden vektor etc.
Hvis LRET målingerne producere en unormal eller tilsyneladende fysisk meningsløs resultat, kan der være protein-specifikke spørgsmål, som måske ikke er umiddelbart indlysende. For eksempel med syre-sensing ionkanaler, selv forsigtig tilsætning af en syre for at ændre pH-værdien kan resultere i nogle celledød og proteindenaturering. Således skal være forberedt, en for hver pH-værdi, der skal testes flere prøver. Også, i tillæg til resonansenergioverførsel kan lokale miljø ændringer påvirker en fluorescenssignal. En sådan ændring, hvis væsentligt, vil blive noteret i donor-kun måling som en dobbelt eller multi-eksponentiel henfald. I disse tilfælde, skal flyttes til forskellige positioner til m mærkningsaktiviteterne sitesAKE sikker ændringen i forhold ikke ændrer de spektrale egenskaber af fluoroforer.
Selv mens holde disse kilder til problemer i tankerne, er der nogle advarsler til og begrænsninger for LRET hvoraf en forsøgslederen skal være opmærksom. Først konventionel mærkning teknik bygger på mærkning cysteinrester. For at reducere mærkning af ikke-specifikke rester er andre cysteiner typisk muteret ud; men denne metode er ikke altid praktisk. For eksempel, hvis et protein har mange ikke-disulfidbundne cysteiner native for dens struktur, som er afgørende for proteinets struktur eller funktion, så mutere dem vil være umuligt, hvilket øger begrænsning af teknik og fortolkning af data. Også LRET teknik er mere velegnet til at påvise ændringer i afstand, snarere end absolutte afstande, da eventuelle fejl på absolutte afstand på grund af virkningerne af orienteringen faktor κ 2 på R 0 værdi sandsynligvisskal reduceres i afstand ændre analysen, da disse fejl påvirker målinger under alle forhold lige. Alternative teknikker kan gøres for at overvinde nogle af disse begrænsninger. For eksempel for at undgå at tilføje for mange cysteiner, kunne man anbringe et His-mærke og mærke den med en fluorofor bundet til nikkel-NTA. Desuden kan indfødte tryptophaner bruges som en af de fluoroforer med den forståelse, at hvis den bruges som donor, tryptophaner har en meget mindre levetid end terbium, således intensitet målinger kan være mere passende end levetid målinger. Hvis der er mere præcise atom til atom afstande er påkrævet, teknikker såsom røntgenkrystallografi, molekylær dynamik, eller NMR er endnu mere egnede teknikker til at få disse absolutte afstande.
På grund af sin udsøgte følsomhed at distancere ændringer, kan LRET måle ændringer afstand med Ångstrøm niveau opløsning til opløsning-fase-proteiner og kan give eksperimentelle data uden behov for høj-purity, isotopiske mærker eller størrelse begrænsning, som forringer både NMR og molekylær dynamik. Efter læring og mastering teknik kan eksaminer i konformationsændringer proteiner gøres meget hurtigere og med større lethed end allerede tilgængelige konventionelle teknikker. LRET giver også et glimrende grundlag for yderligere specialiserede resonansenergioverførsel teknikker såsom enkelt molekyle bånd (smFRET), som kan undersøge befolkningens fordeling af konformationelle tilstande af individuelle molekyler, snarere end ensemblet gennemsnit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Grant GM094246, American Heart Association Grant 11GRNT7890004, og National Science Foundation Grant MCB-1110501.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate | Life Technologies | PV3579 | |
| Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide | Life Technologies | F-150 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide | Life Technologies | A-10254 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20346 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide | Life Technologies | A-10256 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20344 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| QuantaMaster 3-SS | Photon Technology International | Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the millisecond range | |
| FluoreScan 2.0 | Photon Technology International | Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument | |
| Origin 8.6 | OriginLab | Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software | |
| Quartz cuvette | Starna Cells, Inc | 3-Q-10 | |
| Stir bar | Bel-Art Products | F37119-0007 | Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette |
References
- Selvin, P. R. Principles and biophysical applications of lanthanide-based probes. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 275-302 (2002).
- Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 719-726 (1967).
- Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
- Selvin, P. R., Hearst, J. E. Luminescence energy transfer using a terbium chelate: improvements on fluorescence energy transfer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 10024-10028 (1994).
- Chen, J., Selvin, P. R. Thiol-reactive luminescent chelates of terbium and europium. Bioconjugate Chemistry. 10, 311-315 (1999).
- Ge, P., Selvin, P. R. Thiol-reactive luminescent lanthanide chelates: part 2. Bioconjugate Chemistry. 14, 870-876 (2003).
- Gonzalez, J., Rambhadran, A., Du, M., Jayaraman, V. LRET investigations of conformational changes in the ligand binding domain of a functional AMPA receptor. Biochemistry. 47, 10027-10032 (2008).
- Ramaswamy, S. S., Maclean, D. M., Gorfe, A. A., Jayaraman, V. Proton mediated conformational changes in an Acid Sensing Ion Channel. J. Bio. Chem. 288, (2013).
- Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. Conformational changes at the agonist binding domain of the N-methyl-D-aspartic acid receptor. The Journal of Biological Chemistry. 286, 16953-16957 (2011).
- Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. Subunit arrangement in N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. The Journal of Biological Chemistry. 285, 15296-15301 (2010).
- Kokko, T., Kokko, L., Soukka, T. Terbium(III) chelate as an efficient donor for multiple-wavelength fluorescent acceptors. Journal of Fluorescence. 19, 159-164 (2009).
