Summary
Se describe aquí un método mejorado de transferencia de energía de resonancia de luminiscencia (LRET) donde se introduce un sitio de escisión de la proteasa entre los sitios de fluoróforo donante y receptor. Esta modificación nos permite obtener señales LRET específicas derivadas de proteínas de la membrana de interés, lo que permite el estudio de las proteínas de membrana sin la purificación de proteínas.
Abstract
Transferencia de Energía de Resonancia de luminiscencia, o LRET, es una técnica poderosa utilizada para medir distancias entre dos sitios en las proteínas dentro de la gama de distancias de 10-100 Å. Mediante la medición de las distancias en diversas condiciones ligadas, los cambios conformacionales de la proteína se pueden evaluar fácilmente. Con LRET, un lantánido, terbio más a menudo quelado, se utiliza como el fluoróforo donante, proporcionando ventajas tales como una mayor vida útil de donantes única emisión, la flexibilidad de utilizar múltiples fluoróforos aceptores, y la oportunidad de detectar emisión del aceptor sensibilizado como una manera fácil para medir la transferencia de energía sin el riesgo de también la detección de la señal de donantes solamente. Aquí se describe un método para utilizar LRET en proteínas de membrana expresadas y ensayados en la superficie de las células de mamífero intactas. Se introduce un sitio de escisión de la proteasa entre el par fluoróforo LRET. Después de obtener la señal LRET original, la escisión en ese sitio elimina la señal LRET específica de la proteína deinterés que nos permite restar cuantitativamente la señal de fondo que queda después de la escisión. Este método permite más fisiológicamente relevantes para mediciones pueden realizar sin la necesidad de purificación de proteína.
Introduction
Transferencia de Energía de Resonancia de luminiscencia (LRET) es un derivado de la técnica bien conocida de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) 1. Similar a la FRET, LRET se puede utilizar para medir distancias y los cambios de distancia entre donante y aceptor fluoróforos unidos a sitios específicos en la proteína de interés dentro de la gama de 10-100 Å 1-3. Los principios de LRET son también similares a FRET en que la transferencia de energía de resonancia se produce entre dos fluoróforos proximales cuando el espectro de emisión del fluoróforo donante se solapa con el espectro de absorción del fluoróforo aceptor. La eficiencia de esta transferencia está relacionada con la distancia entre los dos fluoróforos por la siguiente ecuación:
Eq. 1
donde R es la distancia entre los dos fluoróforos, E es la eficiencia de la norma ENtransferencia ener-, y R 0, se discute a continuación, es el radio de Förster para el par fluoróforo, es decir, la distancia a la que la eficiencia de la transferencia es la mitad de la máxima. A partir de esta ecuación, se puede ver que la eficiencia está relacionada con la magnitud de la distancia elevado a la sexta potencia inversa 1. Es esta dependencia sexta potencia inversa que permite la FRET y las mediciones lRet ser exquisitamente sensible, incluso a pequeños cambios de distancia cuando está cerca del 0 R del par de FRET. La capacidad para etiquetar específicamente sitios deseados en proteínas u otras macromoléculas permite a uno tomar ventaja de esta sensibilidad para monitorizar los cambios conformacionales.
Cuando se compara con FRET, que utiliza moléculas de colorantes orgánicos convencionales, LRET ofrece ventajas adicionales. En LRET, en lugar de utilizar un colorante orgánico como el fluoróforo donante, un catión serie de los lantánidos, normalmente Tb 3 + o Eu 3 +, se utiliza 1,4-6. Los fluoróforos que u caennder esta categoría, por ejemplo, quelato de terbio, son también muy versátil en que se pueden utilizar con una amplia gama de fluoróforos aceptores. Esta flexibilidad es posible porque los espectros de emisión de los lantánidos quelados contienen múltiples picos de emisión agudos, lo que permite una única especie de fluoróforo donante para ser utilizado con una de una amplia variedad de fluoróforos aceptores. Por lo tanto, la emisión aceptor sensibilizado puede ser detectado sin ningún temor a la contaminación de sangrado a través de la emisión de los donantes 5. El experimentador selecciona el aceptor específico basado en la distancia esperada entre los dos fluoróforos (Figura 1 y Tabla 1). En estos fluoróforos lantánidos quelados, el ión metálico es quelado por una molécula que contiene un grupo de antenas que sensibiliza al lantánido normalmente mal de absorción a la excitación, así como un grupo funcional biorreactivo para atar el ion a un grupo funcional específico de la macromolécula 1, 5,6. Once excitado, lantánidos relajarse al estado fundamental a través de la liberación de fotones con una tasa de atenuación en el rango de milisegundos. Debido a que la descomposición es ni una relajación-singlete-singlete ni a una relajación triplete a singlete, la emisión de fotones no puede adecuadamente ser llamado fluorescencia o fosforescencia, pero se denomina más correctamente la luminiscencia 1. La larga decadencia de la luminiscencia de los lantánidos ayuda mucho en las mediciones de toda la vida. Mediciones de por vida se pueden utilizar para determinar la eficacia a través de la siguiente relación:
Eq. 2
donde, E es la eficiencia de la transferencia, τ D es el tiempo de vida del donante (lantánido quelado) cuando no participan en la transferencia de energía, y τ DA es el tiempo de vida del donante cuando se participa en la transferencia de energía con el aceptor. Con LRET, DA τ puede colasí ser medido como el tiempo de vida de la emisión sensibilizada del aceptor debido a la vida de terbio es mucho más grande que un fluoróforo aceptor orgánico. El aceptor emite con la misma vida útil como su excitación incitar (lantánido donante), y cualquier contribución a la vida útil de la propia vida de la fluorescencia intrínseca del aceptor es relativamente insignificante. Mediante la medición de la emisión sensibilizada lugar de emisión del donante, también eliminamos la necesidad de garantizar el etiquetado exactamente en una proporción 1: 1 de los donantes al aceptor. La proteína puede marcarse en lugar simultáneamente con ambos fluoróforos donantes y aceptor. Dará como resultado una población heterogénea marcada, pero las proteínas marcadas con doble donantes no emitirá en la longitud de onda y aceptor proteínas marcadas doble aceptor no le hará ilusión. Por otra parte, la distancia entre fluoróforos debe ser la misma, independientemente de qué sitio cisteína un fluoróforo dado se une a, especialmente cuando se utilizan los lantánidos isotrópicas como un donante, por lo que el need para especificar un sitio determinado para recibir ya sea el donante o aceptor es innecesaria. La intensidad puede ser afectada con una población heterogénea, pero aún debe ser más que suficiente para ser detectado.
Cuando la planificación de los experimentos, la elección de fluoróforos debe ser dictado por el valor de R 0 de la pareja, así como el rango de distancia esperada que está siendo medido. El valor de R 0 se define por la siguiente ecuación:
Eq. 3
donde, R 0 es el radio de Förster en Angstroms, κ 2 es el factor de orientación entre los dos colorantes (se asume que son 2/3), φ D es el rendimiento cuántico del donante, J es el solapamiento espectral integral entre el donante de espectro de emisión y el espectro de absorbancia del aceptor en M - 1cm -1 nm 4, y n es el índice de refracción del medio 1.
Nuestro laboratorio ha añadido una modificación a la técnica convencional LRET mediante la introducción de un sitio de reconocimiento de proteasa entre los sitios donador y aceptor de etiquetas en la proteína que se probaron. Esta modificación permite la investigación en sistemas no-purificada tales como células de mamífero enteros 7. Esta técnica es particularmente útil cuando se utiliza cisteínas como sitios para el etiquetado, ya que en el proceso de etiquetado con tintes-maleimida conjugado que se unen a los grupos sulfhidrilo de cisteína, otras proteínas en las células que tienen cisteínas también se marcan. Sin embargo, mediante la inclusión de sitios de escisión de la proteasa de la proteína de interés y la medición de tiempos de vida antes y después de la escisión, el experimentador puede restar cuantitativamente la señal de fondo después de la escisión de la proteasa a partir de la señal sin procesar. Esta resta aísla la señal específica derivada de la proteína de interés (FigUre 2). Uso de la modificación descrita anteriormente, LRET se puede utilizar para medir los cambios de distancia entre el donante de quelato de terbio y la sonda aceptora en una proteína, y así vigilar los cambios conformacionales en estado fisiológico cerca de la proteína sin el requisito para la purificación.
Figura 1.El absorción y espectros de emisión de terbio quelado en negro, así como un aceptor de representante, Alexa 488, en rojo. Observe los múltiples picos de emisión y el, estrecho rango de emisión para cada pico agudo de quelato de terbio. Este patrón permite terbio para ser utilizado con una variedad de fluoróforos aceptores y facilita la medición de la emisión sensibilizada dentro de esos rangos, donde terbio muestra ninguna emisión. Pico de emisión del terbio a 486 nm se superpone bastante bien con el de un pico bsorption de Alexa 488, lo que permite la transferencia de energía de resonancia que se produzca entre los dos fluoróforos. Una longitud de onda de 515 nm es una excelente elección para detectar la emisión sensibilizada para este par, ya que es en el valle entre los picos de emisión terbio, y bastante cerca de pico de emisión de Alexa 488 de 520 nm. Tenga en cuenta que estar cerca del pico de aceptor, aunque deseable, no se requiere-565 nm es todavía capaz de detectar emisión de Alexa 488 sin también detectando la emisión de terbio.
| Fluoróforo aceptor | R 0 (Å) | Longitud de onda de emisión (nm) |
| Atto 465 | 36 | 3px; "> 508|
| Fluoresceína | 45 | 515 |
| Alexa 488 | 46 | 515 |
| Alexa 680 | 52 | 700 |
| Alexa 594 | 53 | 630 |
| Alexa 555 | 65 | 565 | 65 | 575 |
Tabla 1. Una lista de fluoróforos aceptores usados comúnmente para LRET usando quelato de terbio como donante 11. Se midieron los valores de R 0 cuando el donante y el aceptor se unen al dominio de unión del agonista soluble de los receptores AMPA. Es ideal para medir el valor de R 0 de nuevo para que se estudió cada nuevo sistema.
Figura 2 Una visión general del método LRET presentado. (A) El receptor AMPA es una proteína de membrana que sufre cambios conformacionales a ligando vinculante. El ligando bi-en forma de concha de almeja-dominio hallazgo es un círculo aquí en rojo. (B) Existe el dominio de unión al ligando del AMPA cuando no se une a las proteínas en una conformación abierta (izquierda). Cuando se une a ligando de glutamato, la proteína se cierra alrededor de su ligando (derecha). Mediante la colocación de los fluoróforos en los sitios probatorios en el LBD, la naturaleza de este cambio conformacional puede ser visto como la distancia entre los fluoróforos cambios, que luego afectar de vida de fluorescencia. (C) Cuando, pueden ocurrir etiquetado tanto de la proteína de interés, así como proteínas de membrana fondo etiquetado células enteras (izquierda). Después de la escisión de la proteasa, la señal de LRET de la proteína de interés desaparecerá debido a la liberación de un fragmento soluble, dejando intacta la señal de fondo (derecha). Esta señal de fondo puede entonces ser sustraída de la señal sin procesar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cree la construcción que contiene la proteína de interés
Clonar el gen que expresa la proteína de interés en un vector adecuado. Use vectores tales como la serie pcDNA o pRK5 ya que son muy adecuados para la expresión en sistemas de mamíferos como células HEK293 y CHO.
2. Seleccione los sitios en la proteína que se han etiquetado con la Fluoróforos
- Elija los sitios de etiquetado que son capaces de reflejar posibles cambios conformacionales en la proteína. Si es posible, utilice una estructura cristalina de la proteína o de una proteína homóloga a ayudar a hacer esta determinación. Si no hay ninguna estructura cristalina disponible, utilizar software en línea para predecir la posible estructura de la proteína y por lo tanto recibir penetración en los sitios apropiados.
- Elija residuos tales que las cadenas laterales de los residuos seleccionados son de superficie expuesta y accesible para los fluoróforos de modo que la proteína puede ser etiquetado.
- Elija residuos queno son críticos para la función de proteínas, por ejemplo, los sitios que no están involucrados en la unión del ligando.
- En la introducción de la mutación cisteína, dar preferencia a los sitios que son similares, por ejemplo, serina, que podrían causar perturbación mínima a la estructura de la proteína.
- Después de la elección de los sitios de etiquetado, que las mutaciones para asegurar que la proteína sólo da LRET de estos sitios previstos. Utilice protocolos estándar de mutagénesis dirigida al sitio para mutar de distancia cisteínas no unidas por disulfuro que podrían unirse a maleimida conjugados etiquetas fluorescentes. No mutar distancia cisteínas unidas por disulfuro y enterrados, cisteínas libres ya que no deben reaccionar con tintes fluorescentes en forma plegada de la proteína.
- Introducir residuos de cisteína en los sitios deseados por hacer mutaciones puntuales utilizando protocolos estándar de mutagénesis dirigida al sitio.
- Incluir un sitio de escisión de la proteasa que puede escindir específicamente de una de las cisteínas de la proteína. Si elsecuencia proteica permite, introducir el sitio por conservadoramente mutando la proteína para tener una trombina (secuencia de reconocimiento LVPRGS) o Factor Xa (secuencia de reconocimiento IDGR o IEGR) secuencia cerca de la cisteína introducida y accesible a la proteasa de escisión; de otro modo la secuencia de tetra o hexa-péptido puede ser insertado como un todo. Elige el sitio de tal manera que tras la escisión una de las cisteínas introducidas se disocia del resto de la proteína-en ciertos casos, esto puede requerir dos sitios de escisión que flanquean una cisteína mutado.
3. Pruebe la Expresión y la funcionalidad de la proteína
- Realizar una transferencia de Western para confirmar la expresión de la proteína mutada.
- Realizar un ensayo funcional de la proteína para asegurar que las mutaciones han alterado la función de la proteína sólo mínimamente, en todo caso, para evitar estudiar los cambios conformacionales de una proteína disfuncional.
NOTA: Dado que todas las proteínas tienen diferentes funciones, no existe una única f ensayo unctional que se utiliza específicamente para LRET; sin embargo, algunos ejemplos de ensayos funcionales incluyen ensayos enzimáticos de actividad de enzimas, ensayos de unión a ligandos para los receptores, y los estudios de electrofisiología para canales iónicos.
4. Seleccione los fluoróforos para ser usados
Seleccionar fluoróforos basados en el rango de distancia de esperar que se mide de tal manera que el rango es entre 0 0.5-1x la R del par fluoróforo.
NOTA: Esto permite una más fácil sustracción del fondo, que tiene típicamente tiempos de vida más largos. Por ejemplo, si se mide el rango de distancia esperada es de alrededor de 35 Å, un par fluoróforo apropiado utilizar sería quelato de terbio como donante y Alexa 594 como receptor, ya que el R 0 para este par es de 53 Å (Tabla 1).
5. expresar la proteína mediante transfección transitoria de la cantidad necesaria de células de mamíferos
ntent "> transitoriamente transfectar la proteína de interés en las células de mamíferos escogidos utilizando cualquiera de los reactivos de transfección comunes Normalmente, utilice cuatro placas de 10 cm por experimento LRET para líneas de células HEK y CHO;. Sin embargo, esta cantidad puede variar en función de la expresión de proteínas , estabilidad, etc. permitir que las células expresan la proteína de 36-48 h antes de la cosecha.6. Rotula las Proteínas
- Separar las células de la placa de cultivo. Separar las células HEK simplemente pipeteando amortiguador contra la parte inferior del plato. Separe las células CHO con un raspador de células, lavarse de los medios de comunicación con tampón extracelular.
- Recoger las células por centrifugación a 1100 xg durante 3 min. Utilice estos mismos ajustes de centrífuga para recoger células después de etiquetado, así como después de los lavados posteriores.
- Suspender las células en 3 ml de tampón extracelular, a continuación, añadir los fluoróforos donador y aceptor en cantidades equimolares hasta una concentración final de 100-300 nM. Incubar en un rotador fo 1 hora a TA.
- Lavar estas células marcadas 3-4 veces con tampón extracelular para eliminar fluoróforos no unidos, a continuación, suspender estas células en tampón extracelular (por lo general 2 ml) para las mediciones de LRET.
- Como control, etiquetar un conjunto separado de las células con sólo fluoróforo donante (quelato de terbio) sin la adición de cualquier fluoróforo aceptor.
NOTA: Los datos de estos experimentos de donante sólo es necesario para completar el análisis. Estos experimentos se pueden realizar en el mismo o diferentes días. - Una vez más, realizar la validación funcional, esta vez con la proteína mutante marcado, como el proceso de etiquetado también puede interferir con la función dependiendo del sitio utilizado para el etiquetado.
NOTA: Estos experimentos se pueden realizar en el mismo o diferentes días.
7. preparar el experimento LRET
- Colocar las células resuspendidas en una cubeta de cuarzo con un volumen mínimo de 1 ml.
- Encienda el ordenador y el instrumento y ajustar los parámetros de la datun programa de adquisición en consecuencia.
- Establecer la longitud de onda de excitación a la gama de absorbancia del fluoróforo donante (330-340 nm funciona bien para quelato de terbio).
- Ajuste la longitud de onda de emisión de forma adecuada, teniendo en cuenta que la emisión del aceptor varía en función del aceptor utilizado. Es importante destacar que seleccionar una longitud de onda de detección que mide sólo la emisión del aceptor y no incluye cualquier sangrado a través de la emisión del donante. Por ejemplo, utilizar una longitud de onda de 565 nm para Alexa 555 como un aceptor Tabla 1. Para las mediciones de donante único, en el que la proteína se marcó sólo con donantes pero sin aceptador, utiliza una longitud de onda de 545 nm para la medición de emisiones de quelato de terbio.
- Establezca el tiempo de detección de emisiones sea al menos tres veces el tiempo de vida esperado LRET para asegurar que un componente de largo curso de la vida no se puede perder.
- Lleve a cabo la exploración. Hacer por lo menos tres exploraciones de 99 barridos para asegurar la consistencia de los resultados. Ahorra ªe los resultados como un archivo de texto (* txt).
- Para medir los cambios conformacionales de una proteína con respecto a las diferentes condiciones (tales como la adición de un ligando), alterar esas condiciones y de nuevo realizar al menos tres exploraciones de 99 barridos cada uno en la misma muestra en esta nueva condición. Si el estudio de los efectos del glutamato sobre la conformación de receptores de glutamato, por ejemplo, añadir glutamato a 1 mM a la misma muestra de escaneado en el paso 7.3, y luego escanear de nuevo.
- Agregue hasta cinco unidades de la proteasa adecuada y tomar las exploraciones continuamente hasta que la escisión es completa y no profundizar el cambio es visto en el curso de la vida de tres exploraciones sucesivas. Por lo general, la escisión se completa en dos a 3 hr. Si un sitio de escisión de Factor Xa se usa para la escisión de la proteasa, por ejemplo, añadir 3 l de Factor Xa a la muestra, y escanear cada 30 min durante 3 horas.
8. Analizar los datos obtenidos
- Abra el software de análisis de datos.
- Cargue el tiempo de vida de fluorescenciadatos mediante la importación ASCII para abrir los archivos de texto. Cargar todas las réplicas, así como las mediciones de fondo final, en un solo archivo.
- La media de los datos de todas las exploraciones para cada condición experimental para obtener los datos finales. Para ello, seleccione las columnas que contienen los ensayos individuales, a continuación, en el menú Datos en la barra de menú, haga clic en Estadísticas en filas para mostrar las intensidades medias de fluorescencia de los ensayos, así como la desviación estándar y error estándar.
- Representar gráficamente los valores medios como un gráfico de líneas con la intensidad de fluorescencia en el eje Y y la vida útil en microsegundos en el eje X para crear una curva que representa el tiempo de vida de la emisión sensibilizada del aceptor. Cambiar el eje Y de la parcela a una escala logarítmica, para permitir una mejor visualización de los datos.
- Repita el paso 8.3 en los datos de medición de fondo, con un promedio de las exploraciones finales que muestran la superposición indica la escisión completa.
- Visualizar los datos de la media de antecedentes sobre lamisma trama que contiene los datos en bruto en promedio. Para ello, abra el cuadro de diálogo Control de capas se encuentra bajo el menú Plot. Luego, transferir los datos que contienen el fondo significa en la lista de contenidos de capa.
- Alinear los datos de la media de fondo a los datos brutos medios. Para ello, utilice la función matemática simple en el menú Math para multiplicar o dividir los datos de fondo como sea necesario hasta que el extremo de la cola del fondo coincide con el final de los datos en bruto.
NOTA: En este extremo de la cola, el tiempo de vida de la proteína de interés debería tener ya completamente decaído; lo que está alineado es simplemente la señal de fondo presente antes y después de la escisión de la proteasa. - Reste la señal de fondo alineado de la señal inicial LRET prima, siempre con la función matemática simple.
- Ajustar los datos a un decaimiento exponencial (exponenciales únicos o múltiples, dependiendo de los sitios y el diseño experimental).
- Establecer el límite de inicio para el montaje para comenzar después del finaldel pulso de láser. Utilice este mismo punto de inicio para todos los accesorios de curvas posteriores.
- En el cuadro de diálogo Función de montaje Select, seleccione decaimiento exponencial con el fin de adaptarse a la vida con la siguiente ecuación para una sola caída exponencial:
Eq. 4
donde, Y representa la intensidad de fluorescencia, y 0 representa la intensidad de fondo debido al ruido del sistema, A 1 es la intensidad de la señal, t es el tiempo de vida de fluorescencia, x es el tiempo, y x 0 es el desfase de tiempo. - Fijar x 0 hasta 0, comenzar la función de ajuste, y ajustar los datos.
NOTA: Si el experimento está diseñado para tener la señal sólo de un par de sitios, los datos resultantes deben ser de fácil ajuste por un único decaimiento exponencial 8. El residual del ajuste es un buen método para determinar la bondad del ajuste y si vidas decaimiento adicionales son required.
- Usa los tiempos de vida obtenidos a partir de los datos para calcular la distancia entre los fluoróforos usando la ecuación de Förster (un reordenamiento de las ecuaciones 1 y 2 anteriores):
Eq. 5
NOTA: Todas las variables son como se ha mencionado anteriormente, con τ DA haber sido medido como el tiempo de vida de emisión sensibilizada del aceptor. Más detalles y ejemplos sobre las mediciones de R 0 y R se pueden encontrar en otro lugar 7,9,10. - Repetir el análisis experimento y los datos de al menos tres veces para asegurar la reproducibilidad. La inconsistencia entre las repeticiones individuales de la misma medida pone en duda la validez de los datos; utilizar experimentos o repeticiones de control adicionales. Calcular errores en la medición utilizando el Gustavus calculadora libre Análisis de errores (desarrollado por el Dr. Thomas Huber) o un sistema similar que se propaga el error en elarrebatos de la vida.
Eq. 4 
Eq. 5 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Una medición de LRET éxito con un donante lantánido debe tener un donante sólo toda la vida en el rango de tiempo de milisegundos. El tiempo de vida de la emisión sensibilizada LRET para la proteína marcada tanto con el donante y el aceptor será notablemente más corto, con un tiempo de vida en el rango de microsegundos después de sustracción de fondo Figura 3. Proteasa resultados de escisión en un aumento de la vida útil que debe ser estable en el tiempo ( es decir, ya no cambia), demostrando que la escisión de la proteasa se ha completado la Figura 4. Si la señal LRET sólo procede de un conjunto de sitios, la vida de emisión resultante después de restar el fondo debe dar una sola vida exponencial.
Cuando la medición de cambios conformacionales, la señal de LRET específico debe mostrar un cambio en la vida fuera del error de la medición de la Figura 3. El error de la medición se puede calcular por la propagación del errors asociado con el ajuste de los tiempos de vida. Después de ajustar los datos al número mínimo de funciones de decaimiento exponencial que se describen en la ecuación 4, el tiempo de vida, τ, se puede determinar. Usando la ecuación 5, el donante-aceptor-donante y tiempos de vida sólo se pueden utilizar junto con el valor R 0 para el par LRET para calcular la distancia entre los dos fluoróforos en las condiciones ensayadas. Relacionar el cambio de distancia que resulta de cambiar estas condiciones a la estructura general y la función de la proteína es ahora el trabajo del experimentador.
Figura 3. mediciones LRET del Acid-Sensing Ion Channel 1 bis (ASIC1a). La intensidad de fluorescencia se ha trazado en una escala logarítmica para mejorar la facilidad de interpretación visual. (A) muestras de donantes sólo muestran una sola-eXponential decadencia que no cambia con el pH. (B) En donante-aceptor de muestras marcadas, una disminución en el tiempo de vida de emisión sensibilizada se ve en una disminución en el pH de 8 a 6 (negro a rojo). Esta disminución de por vida indica una disminución de la distancia entre los dominios de dedo y el pulgar de ASIC1a. Esta cifra ha sido modificado desde Ramaswamy, et al, 2013 8.
Figura 4. El efecto de sustracción de fondo en las mediciones realizadas en el lRet Sensing Ion Channel 1a Ácido (ASIC1a). Los sitios para ser etiquetados específicamente por fluoróforos están separados por un sitio de escisión de la proteasa. Después de que se realicen mediciones lRet, la proteasa se introduce en la muestra de proteína y la posterior escisión de la proteína de los resultados de interés en una pérdida de la señal específica. Cualquier LRET que permanecees la fluorescencia de fondo de los fluoróforos unidos a otras cisteínas presentes en otras proteínas de membrana. Restando este fondo aísla los datos LRET verdaderos para la proteína de interés. Esta cifra ha sido modificado desde Ramaswamy, et al, 2013 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LRET es una técnica poderosa que permite a los científicos para medir distancias entre dominios dentro de una única proteína, así como entre las subunidades en una proteína multimérica. Como tal, LRET está bien adaptado para el examen de los cambios conformacionales y dinámica de las proteínas u otras macromoléculas. El protocolo anterior debe permitir el laboratorio debidamente equipado para probar fácilmente sus hipótesis; Sin embargo, hay muchas fuentes comunes de error que pueden plagar el nuevo investigador. Si se observa poca o ninguna señal LRET, primero compruebe los ajustes de longitud de onda utilizada. La excitación debe estar en el rango de absorbancia de terbio (330-340 nm). Para donantes sólo mediciones, en el que la muestra ha sido etiquetados únicamente con fluoróforo donante y sin fluoróforo aceptor, la longitud de onda de emisión debe ser en uno de los picos mostrados en la Figura 1, mientras que para las mediciones de donante-aceptor, la longitud de onda de emisión debe coincidir con el fluoróforo aceptor se utiliza la Tabla 1. Si el waveleajustes ngth son correctos, compruebe la compatibilidad de buffers. Algunos fluoróforos pueden no ser compatibles con ciertos tampones o en ciertos intervalos de pH. A continuación, asegúrese de que la elección de los residuos y fluoróforos son compatibles. Si el diseño experimental es completamente correcto, entonces el problema probablemente se encuentra ya sea con los fluoróforos o la propia proteína. Con el tiempo, las soluciones madre de fluoróforos pueden degradar y pueden resultar en etiquetado inadecuado. Por último, compruebe la expresión y la funcionalidad de la proteína. Muchas mutaciones se han añadido, incluyendo la introducción de cisteínas, la eliminación de las cisteínas nativas, y la introducción de al menos un sitio de escisión de proteasa. Por lo tanto, es posible que, incluso en condiciones normales de transfección, las mutaciones introducidas desestabilizan la proteína y causa menores de expresión de la proteína de interés, la reducción de la señal de visto. Si expresado, las mutaciones o etiquetado pueden causar la desnaturalización de la proteína, haciendo que los residuos para ser colocado de manera diferentea partir de las distancias esperadas visto en proteína de tipo salvaje. Western blots se pueden utilizar para verificar la expresión de la proteína. Si hay alguna duda sobre el tráfico de una proteína de membrana de la superficie, biotinilación de la superficie celular y tire hacia abajo de la superficie expuesta proteínas, seguido de un western blot para la proteína de interés, demostrará específicamente el tráfico de superficie. Para las pruebas funcionales, no existe un único ensayo para recomendar específicamente para su uso con LRET, ya LRET se puede utilizar en una amplia variedad de tipos de proteínas. Otra vez sin embargo, posibles ejemplos de ensayos funcionales incluyen ensayos enzimáticos, ensayos de actividad de unión al ligando, y los estudios de electrofisiología. Si la expresión o función de la proteína se ha visto afectado también negativamente por las mutaciones introducidas, a continuación, los nuevos sitios de etiquetado deben ser elegidos.
Si una señal LRET se ve pero no puede ser instalado por una sola exponencial cuando se espera que tal resultado, compruebe primero que el fondo se restará correctamente. Si, afresta ter, un decaimiento exponencial multi-se ve, esta señal podría ser una indicación de LRET ser observado a partir de múltiples interacciones distintas de lo que se pretendía. Asegúrese de que todas las otras cisteínas accesibles han sido eliminados de la proteína. Si una estructura de cristal está disponible, será una herramienta muy útil para comprobar si estas cisteínas. Una vez más, unido por puentes disulfuro y enterrado, cisteínas inaccesibles no necesitan ser mutado de distancia. Para probar la inaccesibilidad de estas cisteínas si hay una razón de peso para no mutar a la basura, introducir una cisteína no nativo en la proteína y asegúrese de que no hay señal LRET en una muestra marcada donante-aceptor. Si todas las cisteínas accesibles de hecho se han mutado de distancia, y si la proteína tiene múltiples subunidades o es parte de un complejo, entonces puede haber factores de confusión debido señal de LRET para teñir unir a las proteínas o subunidades cercanas. La elección de un sitio de escisión de la proteasa diferente puede ayudar con estos problemas; de lo contrario, otro sitio etiquetados posible que tenga que ser elegido. Por último, si el problema con la guarnición es simplemente una cuestión de relación señal-ruido, el problema probablemente se debe a una baja expresión de la proteína. A continuación, tendrá que ser optimizado a través de diferentes condiciones de transfección, un vector diferente, etc Expresión.
Si las mediciones LRET producen un resultado anómalo o aparentemente sentido físico, puede haber problemas específicos de proteínas que pueden no ser fácilmente evidente. Por ejemplo, con los canales iónicos sensibles al ácido, incluso la adición cuidadosa de un ácido para cambiar el pH puede resultar en algunos la muerte celular y la desnaturalización de las proteínas. Por lo tanto, múltiples muestras deben estar preparados, uno para cada pH a ensayar. También, además de la transferencia de energía de resonancia, cambia el entorno local puede afectar a una señal de fluorescencia. Tal cambio, si es significativo, se observó en la medición de donantes sólo como un decaimiento doble o multi-exponencial. En estos casos, los sitios de etiquetado tienen que ser trasladados a diferentes posiciones a mAseguro que el cambio en las condiciones no cambia las propiedades espectrales de los fluoróforos.
Incluso manteniendo estas fuentes de problemas en mente, hay algunas advertencias y limitaciones de LRET de que un experimentador debe tener en cuenta. Técnica Primero, convencional etiquetado se basa en los residuos de cisteína etiquetado. Para reducir el etiquetado de los residuos no específicos, otras cisteínas suelen mutar a cabo; Sin embargo, este método no siempre es práctico. Por ejemplo, si una proteína tiene muchas cisteínas no unidas por disulfuro nativos a su estructura que son críticos para la estructura o función de la proteína, entonces la mutación a cabo será imposible, lo que aumenta en gran medida la limitación de la técnica y la interpretación de datos. Además, la técnica de LRET es más adecuado para la detección de cambios en la distancia, en lugar de distancias absolutas, ya que cualquier error en distancia absoluta debido al efecto del factor de orientación κ 2 en el valor de R 0 es probablea reducirse en el análisis del cambio de distancia debido a que estos errores afectan a las mediciones en todas las condiciones por igual. Las técnicas alternativas se puede hacer para superar algunas de estas limitaciones. Por ejemplo, para evitar la adición de demasiados cisteínas, se podría colocar una etiqueta de His y la etiqueta con un fluoróforo unido al níquel-NTA. También, triptófanos nativas se pueden utilizar como un uno de los fluoróforos con el entendimiento de que si se utiliza como un donante, triptófanos tienen una vida útil mucho más pequeño que el terbio, por tanto, medidas de intensidad basado pueden ser más apropiadas que las mediciones de toda la vida. Si se requieren más exacta átomo a distancias atómicas, técnicas tales como la cristalografía de rayos X, dinámica molecular, o RMN son todavía técnicas más adecuadas para conseguir estas distancias absolutas.
Debido a su exquisita sensibilidad a la distancia cambia, LRET puede medir cambios de distancia con una resolución a nivel de Angstrom para las proteínas de fase en solución y puede proporcionar datos experimentales sin necesidad de alta purity, marcadores isotópicos o la restricción de tamaño que afecta tanto RMN y la dinámica molecular. Después de aprender y dominar la técnica, los exámenes en los cambios conformacionales de proteínas se puede hacer mucho más rápido y con más facilidad que las técnicas convencionales ya disponibles. LRET también proporciona una excelente base para las técnicas de transferencia de energía de resonancia más especializados, como única molécula de FRET (smFRET), que pueden examinar la distribución de la población de los estados conformacionales de moléculas individuales, en lugar de la media de conjunto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta labor fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud de subvención GM094246, la American Heart Association Beca 11GRNT7890004, y la Fundación Nacional de Ciencia de subvención MCB-1110501.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate | Life Technologies | PV3579 | |
| Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide | Life Technologies | F-150 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide | Life Technologies | A-10254 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20346 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide | Life Technologies | A-10256 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20344 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| QuantaMaster 3-SS | Photon Technology International | Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the millisecond range | |
| FluoreScan 2.0 | Photon Technology International | Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument | |
| Origin 8.6 | OriginLab | Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software | |
| Quartz cuvette | Starna Cells, Inc | 3-Q-10 | |
| Stir bar | Bel-Art Products | F37119-0007 | Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette |
References
- Selvin, P. R. Principles and biophysical applications of lanthanide-based probes. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 275-302 (2002).
- Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 719-726 (1967).
- Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
- Selvin, P. R., Hearst, J. E. Luminescence energy transfer using a terbium chelate: improvements on fluorescence energy transfer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 10024-10028 (1994).
- Chen, J., Selvin, P. R. Thiol-reactive luminescent chelates of terbium and europium. Bioconjugate Chemistry. 10, 311-315 (1999).
- Ge, P., Selvin, P. R. Thiol-reactive luminescent lanthanide chelates: part 2. Bioconjugate Chemistry. 14, 870-876 (2003).
- Gonzalez, J., Rambhadran, A., Du, M., Jayaraman, V. LRET investigations of conformational changes in the ligand binding domain of a functional AMPA receptor. Biochemistry. 47, 10027-10032 (2008).
- Ramaswamy, S. S., Maclean, D. M., Gorfe, A. A., Jayaraman, V. Proton mediated conformational changes in an Acid Sensing Ion Channel. J. Bio. Chem. 288, (2013).
- Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. Conformational changes at the agonist binding domain of the N-methyl-D-aspartic acid receptor. The Journal of Biological Chemistry. 286, 16953-16957 (2011).
- Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. Subunit arrangement in N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. The Journal of Biological Chemistry. 285, 15296-15301 (2010).
- Kokko, T., Kokko, L., Soukka, T. Terbium(III) chelate as an efficient donor for multiple-wavelength fluorescent acceptors. Journal of Fluorescence. 19, 159-164 (2009).
