Luminiscens Resonance Energy Transfer att studera strukturförändringar i membranproteiner i däggdjursceller

Summary

Vi beskriver här en förbättrad Luminescence resonansenergiöverföring (LRET) metod där vi introducerar ett proteasklyvningsställe mellan donator och acceptorfluorofor sajter. Denna ändring gör det möjligt för oss att skaffa särskilda LRET signaler som härrör från membranproteiner av intresse, vilket möjliggör studier av membranproteiner utan proteinrening.

Abstract

Luminiscens Resonance Energy Transfer, eller LRET, är en kraftfull teknik som används för att mäta avstånd mellan två platser i proteiner inom distans intervallet 10-100 Å. Genom att mäta avstånden under olika ligerade förhållanden kan konformationsförändringar av proteinet lätt bedömas. Med LRET, en lantanid, oftast kelaterad terbium, används som donatorfluoroforen, ger fördelar såsom längre givar enda utsläpp livslängd, flexibilitet att använda flera acceptor fluoroforer, och möjligheten att upptäcka sensibiliserade acceptor utsläpp som ett enkelt sätt för att mäta energiöverföring utan risk för även upptäcka givare endast signal. Här beskriver vi en metod att använda LRET på membranproteiner som uttrycks och analyseras på ytan av intakta däggdjursceller. Vi introducerar en proteasklyvningsställe mellan LRET fluoroforen paret. Efter erhållande av den ursprungliga LRET signalen, klyvning vid detta ställe avlägsnar specifik LRET signalen från proteinet avintresse gör det möjligt att kvantitativt subtrahera bakgrundssignalen som återstår efter klyvning. Denna metod gör det möjligt för flera fysiologiskt relevanta mätningar som skall göras utan behov av rening av protein.

Introduction

Luminiscens Resonance Energy Transfer (LRET) är ett derivat av den välkända Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) teknik ^1. Liknar FRET kan LRET användas för att mäta avstånd och förändringar avstånd mellan donator och acceptor fluoroforer knutna till specifika platser på proteinet av intresse i området 10-100 Å ^1-3. Principerna för LRET är också liknande FRET i den resonansenergiöverföring sker mellan två proximala fluoroforema när emissionsspektrum donatorfluoroforen lappar med absorptionsspektrum acceptorfluoroforen. Effektiviteten för denna överföring är relaterad till avståndet mellan de två fluoroforerna genom följande ekvation:

Ekv. 1

där R är avståndet mellan de två fluoroforerna, E är effektiviteten i svergi överföring, och R _0, diskuteras nedan, är Förster radien för fluoroforen paret, det vill säga på vilket avstånd effektivisera överföringen är halva maximala. Från denna ekvation kan man se att effektiviteten är relaterad till storleken på avståndet upphöjt till den inversa sjätte strömmen ^1. Det är denna omvända sjätte strömberoende som möjliggör FRET och LRET mätningar för att vara utsökt känsliga även för små avstånd ändras när nära R ₀ i FRET paret. Förmågan att specifikt märka önskade platser på proteiner eller andra makromolekyler tillåter en att dra fördel av denna känslighet för att övervaka konformationsförändringar.

Vid jämförelse med FRET, som använder konventionella organiska färgämnesmolekyler, LRET erbjuder ytterligare fördelar. I LRET, istället för att använda ett organiskt färgämne som donator fluorofor, en lantanidserien katjon, typiskt Tb3 ⁺ eller Eu ^{3 +,} användes ^1,4-6. Fluoroforer som faller under denna kategori, t.ex., terbium kelat, är också mycket mångsidig i det att de kan användas med ett brett sortiment av acceptor-fluoroforer. Denna flexibilitet är möjligt eftersom emissionsspektra för kelaterade lantanider innehåller flera skarpa utsläppstoppar, vilket möjliggör en enda art av donatorfluorofor för att användas med en av en mängd olika acceptor fluoroforer. Således kan upptäckas sensibiliserade utsläpp mottagare utan rädsla för kontaminerande genomblödning från givare utsläpp ^5. Försöksledaren väljer den specifika acceptor utifrån den förväntade avståndet mellan de två fluoroforema (figur 1 och tabell 1). I dessa kelaterade lantanider fluoroforer är metalljonen kelaterad med en molekyl som innehåller en antenngrupp som sensibiliserar det normalt dåligt absorberande lantanid till exciterings samt ett bioreaktivt funktionell grupp att tjudra jonen till en specifik funktionell grupp på den makromolekyl ^{1, 5,6.} Once upphetsad, lantanider koppla till grundtillståndet genom lanseringen av fotoner med en dämpfaktor i millisekund intervall. Eftersom sönderfallet är varken en sing till sing avslappning eller en triplett-till-sing avslappning, utsläpp av fotoner kan inte riktigt kallas fluorescens eller fosforescens, men är mer korrekt kallas luminiscens ^1. Den långa sönderfallet av lantanider luminiscens hjälper mycket i livstidsmätningar. Medellivslängd mätningar kan sedan användas för att bestämma effektivitet med följande förhållande:

Ekv. 2

där är E effektiviteten i överföringen, är τ _D livstid donator (kelaterad lantanider) när de inte deltar i energiöverföring, och τ _DA är livslängden för givaren när de deltar i energiöverföring med acceptom. Med LRET, τ _DA kan alså mätas som livslängd sensibiliserade acceptor utsläpp eftersom terbium livstid är så mycket större än en organisk acceptorfluorofor. Acceptorn avger med samma livslängd som dess anstiftan excitation (donator lantanider), och eventuella bidrag till livstid från acceptorn egen inneboende fluorescens livstid är relativt försumbar. Genom att mäta sensibiliserade utsläpp snarare än utsläpps donator, vi eliminerar också behovet av att säkerställa märkning på exakt en 1: 1 mellan donator till acceptor. Protein kan istället märkas samtidigt med både acceptor och givar fluoroforer. Ett heterogent märkt befolkningen kommer att leda, men dubbelgivar märkta proteiner kommer inte ut i accept våglängd och dubbel acceptor märkta proteiner kommer inte att vara glada. Dessutom bör avståndet mellan fluoroforer vara samma, oavsett vilken cystein webbplats en given fluorofor fäster, speciellt vid användning av isotropa lantaniderna som en donator, så need för att ange en viss plats för att få antingen givaren eller mottagaren är onödigt. Intensitet kan påverkas med en heterogen befolkning, men bör ändå vara mer än tillräckligt för att detekteras.

Vid planering experiment, bör valet av fluoroforer att bestämmas av R ₀ värdet i paret och den förväntade avståndet intervall som mäts. R _0-värdet definieras genom följande ekvation:

Ekv. 3

där är R ₀ Förster radie i Ångström, κ ² är orienteringen faktorn mellan de två färgämnena (vanligen antas vara 2/3), φ _D är kvantutbytet av givaren, är J den spektral överlappning gral mellan givarens emissionsspektrum och acceptorn s absorbansspektrum i M ^{- 1}cm ^-1 nm ^4, och n är brytningsindex för mediet ^1.

Vårt laboratorium har lagt till en modifikation av den konventionella LRET teknik genom att införa ett proteasigenkänningsställe mellan donator och acceptor label ställen på proteinet som sonderas. Denna modifikation möjliggör undersökning i icke-renade system såsom hela däggdjursceller ^7. Denna teknik är särskilt användbar vid användning av cysteiner som ställen för märkning, eftersom i processen för märkning med maleimid-konjugerade färgämnen som binder till cystein sulfhydrylgrupper, andra proteiner på de celler som har cysteinerna är också märkta. Men genom att ta med proteas-klyvningsställen på proteinet av intresse och mätning av livstider före och efter klyvning, försöksledaren kan kvantitativt subtrahera bakgrundssignalen efter proteasklyvning från råsignalen. Denna subtraktion isolerar specifika signaler som ges via proteinet av intresse (Figure 2). Använda modifieringen som beskrivs ovan, kan LRET användas för att mäta avstånd förändringar mellan terbium kelat donator och acceptor sonden på ett protein, och på så sätt följa konformationsförändringar i proteinets nära fysiologiska tillstånd utan krav på rening.

Figur 1.Det absorption och emissionsspektra av kelaterad terbium i svart, samt en representant acceptor, Alexa 488, i rött. Lägg märke till de olika utsläppstoppar och den skarpa, smala utsläppsintervall för varje topp av terbium kelat. Detta mönster medger terbium att användas med en rad olika acceptor fluoroforer och underlättar mätning av sensibiliserade utsläpp inom dessa intervall där terbium visar inget utsläpp. Terbium s emissionstopp vid 486 nm lappar ganska bra med en bsorption topp Alexa 488, vilket möjliggör resonansenergiöverföring ske mellan de två fluoroforerna. En våglängd på 515 nm är ett utmärkt val för att upptäcka sensibiliserade utsläpp för detta par som det är i dalen mellan terbium utsläppstoppar, och ganska nära Alexa 488 utsläpps topp på 520 nm. Notera att vara nära accepttoppen, men önskvärt, inte krävs-565 nm fortfarande kunna upptäcka Alexa 488 utsläpp utan också upptäcka terbium utsläpp.

3px; "> 508 Cy3

Acceptorfluorofor	R 0 (A)	Emission våglängd (nm)
Atto 465	36
Fluorescein	45	515
Alexa 488	46	515
Alexa 680	52	700
Alexa 594	53	630
Alexa 555	65	565
65	575

Tabell 1 En lista över vanliga acceptor fluoroforer för LRET använder terbium kelat som donator ^11. _R-0 värdena mättes när donatorn och acceptorn var fästa till den lösliga agonisten bindningsdomän av AMPA-receptorer. Den är idealisk för att mäta R ₀ värdet igen för varje nytt system som studeras.

Figur 2 En översikt av LRET metod presenteras. (A) Den AMPA-receptom är ett membranprotein som undergår konformationsförändringar vid ligandbindning. Gripskopan formade ligand-bindning domänen är inringad här i rött. (B) Den ligandbindande domänen av AMPA när den inte är bunden till proteinet existerar i en öppen konformation (vänster). När bunden till ligand glutamat, stänger proteinet runt dess ligand (höger). Genom att placera fluoroforer på bevisvärde platser på LBD, kan denna typ av conformationaländring ses som avståndet mellan fluoroforer förändringar, som sedan kommer att påverka fluorescens livstid. (C) Vid märkning hela celler, märkning av både proteinet av intresse samt bakgrundsmembranproteiner kan förekomma (till vänster). Efter proteasklyvning kommer LRET signal från proteinet av intresse försvinner på grund av utsläpp av ett lösligt fragment, lämnar bakgrundssignalen intakt (höger). Denna bakgrundssignal kan sedan subtraheras från råsignalen.

Protocol

1. Skapa konstruktion innehållande proteinet av intresse

Klona genen som uttrycker proteinet av intresse in i en lämplig vektor. Använd vektorer såsom pcDNA serie eller pRK5 som de är väl lämpade för expression i däggdjurssystem såsom HEK293 och CHO-celler.

2 Välj de webbplatser på protein som ska Märkta med Fluoroforer

1. Välj märkning webbplatser som har möjlighet att ge uttryck för möjligheten konformationsförändringar i proteinet. Om möjligt, använd en kristallstruktur av proteinet eller en homolog protein för att göra denna bestämning. Om ingen kristallstruktur som finns, använda online-programvara för att förutsäga möjliga strukturen av proteinet och därmed få insikt i lämpliga platser.
2. Välj rester så att sidokedjorna i de valda resterna är ytexponerade och tillgängliga för fluoroforerna så att proteinet kan märkas.
   1. Välj rester somär inte kritiska för proteinfunktion, t ex webbplatser som inte är involverade i ligandbindning.
   2. Vid införande av cystein mutation, ge företräde till webbplatser som liknar till exempel serin, som skulle orsaka minsta möjliga störning i proteinstrukturen.
   3. Efter att ha valt de märkningsställen, göra mutationerna för att säkerställa att proteinet ger endast LRET från dessa avsedda platser. Använd vanliga riktad mutagenes protokoll för att mutera bort icke disulfidbundna cysteiner som potentiellt skulle kunna binda till maleimid-konjugerade fluorescerande taggar. Inte mutera bort disulfidbundna cysteinerna och begravd, fria cysteiner, eftersom de inte reagerar med fluorescerande färgämnen i den vikta formen av proteinet.
3. Introducera cysteinrester i de önskade platserna genom att punktmutationer genom att använda standardställesriktad mutagenes protokoll.
4. Inkludera ett proteas klyvningsställe som specifikt kan klyva bort en av cysteinerna från proteinet. Omproteinsekvens tillåter det, införa webbplatsen genom konservativt mutera proteinet har en trombin (igenkänningssekvens LVPRGS) eller faktor Xa (igenkänningssekvens IDGR eller lEGR) sekvens nära den introducerade cystein och tillgänglig för proteasklyvning; annars tetra- eller hexa-peptidsekvensen kan sättas in som en helhet. Välj platsen så att vid klyvning en av de införda cysteinerna dissocierar från resten av det protein-i vissa fall detta kan kräva två klyvningsställen som flankerar en muterad cystein.

3 Testa Expression och funktionalitet av protein

1. Utför en western blöt för att bekräfta uttryck av det muterade proteinet.
2. Utför en funktionell analys av proteinet för att säkerställa att mutation har förändrat proteiners funktion endast minimalt, om alls, för att undvika att studera konformationsförändringar i en dysfunktionell protein.
   OBS: Eftersom alla proteiner har olika funktioner, finns det ingen enskild f unktionell analys som används specifikt för LRET; dock några exempel på funktionella analyser inkluderar enzymaktivitetsanalyser för enzymer, ligandbindande analyser för receptorer och elektrofysiologiska studier för jonkanaler.

4 Välj de Fluoroforer som ska användas

Välj fluoroforer baserade på den förväntade avståndet intervallet mäts så att intervallet är mellan 0.5-1x R ₀ av fluoroforen paret.
OBS: Detta möjliggör en enklare subtraktion av bakgrunden, som normalt har mycket längre livslängd. Till exempel, om det förväntade avståndet intervall som mäts är ca 35 Å, en lämplig fluorofor paret att använda vore terbium kelat som donator och Alexa 594 som acceptor, eftersom R ₀ för detta par är 53 Å (tabell 1).

5. uttrycka proteinet genom transient transfektion av den erforderliga mängden av däggdjursceller

ntent "> transient transfektera proteinet av intresse i de valda däggdjursceller som använder någon av de vanliga transfektionsreagens Normalt använder fyra 10-cm rätter per LRET experiment för HEK och CHO cellinjer,. emellertid kan denna mängd variera beroende på proteinuttryck , stabilitet, osv. Låt cellerna att uttrycka proteinet för 36-48 h före skörd.

6. Märk Proteiner

1. Drag av celler från odlingsskålen. Drag av HEK-celler, genom enkelt pipettering buffert mot botten av skålen. Drag av CHO-celler med en cellskrapa, tvätta bort media med extracellulär buffert.
2. Samla cellerna genom centrifugering vid 1100 xg under 3 min. Använd samma centrifug inställningar för att samla cellerna efter märkning, samt efter de efterföljande tvättar.
3. Suspendera cellerna i 3 ml av extracellulär buffert, tillsätt sedan donator och acceptor fluoroforer i ekvimolära mängder upp till en slutlig koncentration av 100 till 300 nM. Inkubera på en rotator feller 1 h vid RT.
4. Tvätta dessa märkta celler 3-4x med extracellulärt buffert för att avlägsna obundna fluoroforer, häng sedan dessa celler i extracellulärt buffert (vanligen 2 ml) för LRET mätningar.
5. Som kontroll, märka en separat uppsättning celler med endast donatorfluorofor (terbium kelat) utan tillsats av något acceptorfluorofor.
   OBS: Data från dessa givare endast experiment krävs för att slutföra analysen. Dessa experiment kan utföras på samma eller olika dagar.
6. Återigen utför funktionellt godkännande, denna gång med märkt mutantprotein, eftersom märkningsprocessen kan också störa funktionen beroende på vilken plats som används för märkning.
   OBS: Dessa experiment kan göras på samma eller olika dagar.

7 Ställ in LRET Experiment

1. Placera de resuspenderade cellerna i en kvartskyvett med en minimivolym av 1 ml.
2. Starta datorn och instrumentet och justera parametrarna för datett förvärvsprogram i enlighet därmed.
   1. Ställ excitationsvåglängden till absorbans intervallet donatorfluoroforen (330-340 nm fungerar bra för terbium kelat).
   2. Ställ emissionsvåglängden på lämpligt sätt, med tanke på att den emissions acceptorn varierar beroende på acceptorn används. Viktigt välja en detektionsvåglängd som mäter endast utsläpp acceptorn och inkluderar inte någon genomblödning från givarens emission. Använd till exempel en våglängd på 565 nm för Alexa 555 som en acceptor Tabell 1. För givar enbart mätningar, där proteinet märkts med donator men utan acceptor, använd en våglängd på 545 nm för mätning terbium kelat utsläpp.
   3. Ställ in längden på detektions utsläpp att vara minst tre gånger den förväntade LRET livstid att se till att en lång livslängd komponenten inte kommer att saknas.
3. Utför sökningen. Ta minst tre skannar av 99 svep för att säkerställa överensstämmelse med resultaten. Spara: tee resultat som en textfil (* txt).
4. För att mäta konformationsförändringar av ett protein med avseende på olika villkor (t.ex. tillägg av en ligand), ändra dessa villkor och återigen utför minst tre skanningar av 99 sveper vardera på samma prov under denna nya tillstånd. Om att studera effekter av glutamat på konforma av glutamatreceptorer, exempelvis lägga glutamat till 1 mM till samma prov skannas i steg 7.3, och sedan skanna igen.
5. Lägg till upp till fem enheter av den lämpliga proteas och ta skannar kontinuerligt tills klyvning är klar och ingen ytterligare förändring ses i livstid för tre på varandra följande undersökningar. Vanligtvis är klyvning komplett i två till tre timmar. Om en faktor Xa-spaltningsstället som används för proteas klyvning, till exempel, lägga till 3 | il av faktor Xa till provet, och skanna varje 30 min under 3 tim.

8 Analysera data som erhållits

1. Öppna dataanalys programvara.
2. Ladda fluorescens livstiddata med Importera ASCII för att öppna textfiler. Ladda alla replikat samt de sista mätningarna bakgrund, i en fil.
3. Medelvärdet data från alla scanningar för varje experimentell tillstånd för att få de slutliga uppgifterna. För att göra detta markerar du de kolumner som innehåller de individuella prövningar, då under menyn Data i menyraden, klicka på statistik på rader för att visa de genomsnittliga fluorescensintensiteter från försöken samt standardavvikelse och standardfel.
4. Plotta de genomsnittliga värdena som ett linjediagram med fluorescensintensitet på Y-axeln och livstid i mikrosekunder på X-axeln för att skapa en kurva som representerar livstid sensibiliserade utsläpp av acceptorn. Ändra Y-axeln av tomten till en log-skala, för att möjliggöra bättre visualisering av data.
5. Upprepa steg 8.3 på data bakgrundsmätning, i genomsnitt de sista genomsökningar som visar överlappning indikerar fullständig klyvning.
6. Visa de genomsnittliga bakgrundsdata omsamma tomt som innehåller den genomsnittliga rådata. För att göra detta, öppna Layer dialogrutan Kontroll finns under Plot menyn. Sedan överföra data innehåller bakgrunden menar i listan över Layer Innehåll.
7. Rikta de genomsnittliga bakgrundsdata till de genomsnittliga rådata. För att göra detta använder Simple Math funktionen under Math menyn för att multiplicera eller dividera bakgrundsuppgifter som behövs tills svansen slutet av bakgrunden överlappar den bakre änden av rådata.
   OBS: Vid denna bakre änden, livstid från proteinet av intresse borde ha redan helt skämda bort; vad är i linje är helt enkelt bakgrundssignalen närvarande både före och efter proteasklyvning.
8. Subtrahera inriktade bakgrundssignalen från den ursprungliga råa LRET signal, återigen med hjälp av Simple Math funktionen.
9. Montera data till en exponentiellt avtagande (enstaka eller flera exponentials, beroende på vilka webbplatser och experimentell design).
   1. Ställ in startgränsen för montering börja efter utgångenav laserpulsen. Använd samma startpunkt för alla efterföljande kurva beslag.
   2. I Välj Fitting Function dialogrutan väljer exponentiellt avtagande, så att den passar livstid att följande ekvation för en enda exponentiell avklingning:
      Ekv. 4
      där representerar y fluorescensintensiteten, y ₀ representerar bakgrundsnivån på grund av buller från systemet, A ₁ är signalstyrkan, t är fluorescens livstid, x är tiden, och x ₀ är tidsförskjutningen.
   3. Fix x ₀ till _0, starta Fitting Funktion, och passar data.
      OBS: Om försöket är konstruerad för att ha signaler från ett par platser, bör de erhållna data enkelt vara lämpligt med en enda exponentiellt avtagande ^8. Rest av passformen är en bra metod för att bestämma godhet passform och om ytterligare sönderfallslivstider är requirred.
10. Använd livstider som erhållits från data för att beräkna avståndet mellan fluoroforer använder Förster ekvation (en ombildning av ekvationerna 1 och 2 ovan):
    Ekv. 5
    OBS: Alla variablerna är som nämnts ovan med τ _DA ha mätt som sensibiliserade acceptor utsläpps livstid. Ytterligare detaljer och exempel på mätningar av R ₀ och R kan hittas någon annanstans ^7,9,10.
11. Upprepa experimentet och dataanalys för minst tre gånger för att säkerställa reproducerbarhet. Bristande överensstämmelse mellan individuella upprepningar av samma mätning ifrågasätter giltigheten av data; använda ytterligare kontrollexperiment eller upprepningar. Beräkna mätfel med hjälp av gratis Gustavus Felanalys kalkylator (utvecklad av Dr Thomas Huber) eller ett liknande system som sprider felet ipassar på livstid.

Representative Results

En framgångsrik LRET mätning med lantanider givare bör ha en donator endast livstid i millisekund tidsintervall. Livslängden på sensibiliserade LRET utsläpp för proteinet märkt med både givaren och acceptorn blir särskilt kortare, med en livslängd på mikrointervall efter bakgrundssubtraktion Figur 3. Proteasklyvning resulterar i en ökning av livslängden som bör bli stabil över tiden ( dvs inte längre förändras), som visar att proteasklyvning är klar Figur 4. Om LRET signalen kommer från endast en uppsättning av platser bör den resulterande emissions livstid efter subtraktion av bakgrunden ger en exponentiell livstid.

Vid mätning av konformationsförändringar, bör den specifika LRET signalen visar en förändring i livet utanför felaktig mätning Figur 3. Kan Felet i mätningen beräknas genom förökning av felets associerade med passning av livstider. Efter anpassning av data till det minsta antal exponentiellt avtagande funktioner som beskrivs i ekvation 4, livstid, τ, kan bestämmas. Med hjälp av ekvation 5, kan givaren-acceptor och givar endast livstider användas tillsammans med R ₀ värde för LRET paret för att beräkna avståndet mellan de två fluoroforerna på de villkor som testades. Avseende distansförändringen till följd av förändrade dessa villkor till den övergripande strukturen och funktionen hos proteinet är nu en uppgift för försöksledaren.

Figur 3. LRET mätningar av Syra Avkännings jonkanal 1a (ASIC1a). Fluorescensintensitet har plottas på en logaritmisk skala för att förbättra den lätthet av visuell tolkning. (A) Uppgifter om givaren enbart prover visar en enkel Exponential förfall som inte förändras med pH. (B) I donator-acceptor-märkta prover, är en minskning av livslängden hos sensibiliserade utsläpp sett på en minskning i pH 8-6 (svart till rött). Denna livstid minskning indikerar en minskning i avståndet mellan finger och tummen domänerna av ASIC1a. Denna siffra har modifierats Ramaswamy, et al, 2013 ^8.

Figur 4 Effekten av bakgrundssubtraktion på LRET mätningar gjorda på Syra Avkännings jonkanalen 1a (ASIC1a). Ställena att vara specifikt märkta med fluoroforer är separerade av ett proteas klyvningsstället. Efter LRET mätningar görs, är proteaset presenterad för proteinprovet och efterföljande klyvning av proteinet av intresse resulterar i en förlust av den specifika signalen. Alla LRET som förblirär bakgrundsfluorescens från fluoroforer bundna till andra cysteiner närvarande på andra membranproteiner. Subtrahera denna bakgrund isolerar de sanna LRET data för proteinet av intresse. Denna siffra har modifierats Ramaswamy, et al, 2013 ^8.

Discussion

LRET är en kraftfull teknik som gör det möjligt för forskare att mäta avstånd mellan områden i ett enda protein samt mellan subenheter i ett multiprotein. Som sådan är LRET väl lämpad för att undersöka de strukturförändringar och dynamik proteiner eller andra makromolekyler. Protokollet ovan bör ge korrekt utrustade labb för att enkelt testa sina hypoteser; emellertid, det finns många gemensamma felkällor som kan plåga den nya utredare. Om lite eller inget LRET signal ses, kontrollera först våglängds inställningar som används. Excitation bör vara i absorbansen intervallet terbium (330-340 nm). För donator endast mätningar, i vilka provet har märkts med donatorfluorofor och utan acceptorfluorofor bör emissionsvåglängden vara en av topparna som visas i figur 1, medan för donator-acceptor-mätningar bör emissionsvåglängden stämmer acceptorfluoroforen används Tabell 1. Om wavelength inställningar är korrekta, kontrollera kompatibiliteten mellan buffertar. Vissa fluoroforer kanske inte är kompatibla med vissa buffertar eller i vissa pH-intervall. Nästa, se till att valet av restprodukter och fluoroforer är kompatibla. Om den experimentella designen är helt korrekt, då problemet troligen ligger antingen med fluoroforema eller själva proteinet. Med tiden kan stamlösningar av fluoroforer degradera och kan resultera i otillräcklig märkning. Kontrollera slutligen uttryck och funktion av proteinet. Många mutationer har lagts till, däribland införandet av cysteiner, avlägsnande av infödda cysteiner, och införandet av minst en proteasklyvningsställe. Sålunda är det möjligt att, även under normala transfektion betingelser de introducerade mutation destabilisera protein och orsakar under-uttryck av proteinet av intresse, sänka signal ses. Om uttryckt kan de mutationer eller märkning orsaka denaturering av proteinet, vilket orsakar de rester som skall placeras på olika sättfrån de förväntade avstånd sett i vildtypsprotein. Western blöts kan användas för att kontrollera expression av proteinet. Om det finns några frågor om handel med en ytmembranprotein, biotinylering av cellytan och pull-down av ytexponerade proteiner, följt av en western blöt för proteinet av intresse, kommer särskilt att visa ytan trafficking. För funktionstester, finns det ingen enskild analys för att rekommendera för användning specifikt med LRET eftersom LRET kan användas på en mängd olika proteintyper. Igen men möjliga exempel på funktionella analyser inkluderar enzymaktivitetsanalyser, ligandbindande analyser och elektrofysiologiska studier. Om proteinuttryck eller funktion har alltför negativt av de införda mutationer, då nya märkningsplatser måste väljas.

Om en LRET signal ses men kan inte monteras av en enda exponentiell när sådant resultat förväntas, kontrollera först att bakgrunden var rätt subtraheras. Om, after subtraktion, en multi-exponentiellt avtagande ses, kan denna signal vara en indikation på LRET följs av andra än vad som var avsett flera interaktioner. Kontrollera att alla andra tillgängliga cysteiner har tagits bort från proteinet. Om en kristallstruktur är tillgänglig, kommer det att bli ett mycket användbart verktyg för att kontrollera om dessa cysteiner. Återigen, disulfidbunden och begraven, behöver otillgängliga cysteiner behöver inte muterat bort. För att testa otillgänglighet av dessa cysteiner om det finns tvingande skäl att inte mutera bort dem, introducera en främmande cystein i proteinet och se till att det inte finns någon LRET signal i en donator-acceptor märkt prov. Om alla tillgängliga cysteiner verkligen har muterats bort, och om proteinet har flera subenheter eller ingår i en komplex, så kan det finnas confounding LRET signal på grund av färga fästa dessa närliggande proteiner eller subenheter. Att välja en annan proteasklyvningsställe kan hjälpa till med dessa problem; annars andra märknings platss kanske måste väljas. Slutligen om problemet med kopplingen är helt enkelt en fråga om signal-till-brus, beror på lågt uttryck av proteinet den troliga problemet. Expression måste sedan optimeras genom olika transfektion förhållanden, en annan vektor osv.

Om mätningarna LRET producerar en onormal eller till synes fysiskt menings resultat, kan det finnas proteinspecifika frågor som kanske inte är lätt uppenbart. Till exempel, med syra-sensing jonkanaler, även försiktig tillsats av en syra för att ändra pH kan resultera i viss celldöd och proteindenaturering. Således flera prov måste förberedas, en för varje pH som skall testas. Dessutom, förutom att resonansenergiöverföring kan lokala miljön förändras påverka en fluorescenssignal. En sådan förändring, om betydande, skulle noteras i givar enbart mätning som en dubbel eller fler exponentiellt avtagande. I dessa fall, de märkningsplatser måste flyttas till olika positioner till me till förändringen i förhållanden ändrar inte de spektrala egenskaperna hos fluoroforer.

Även samtidigt som dessa källor till problem i åtanke, det finns några varningar till och begränsningar LRET varav en försöksledaren måste vara medveten om. Först konventionell märkningsteknik bygger på märkning cysteinrester. För att minska märkning av icke-specifika rester är andra cysteiner typiskt muterad ut; emellertid är denna metod inte alltid praktiskt. Till exempel, om ett protein har många icke-disulfidbundna cysteinerna hemma i sin struktur som är avgörande för proteinets struktur eller funktion, sedan mutera dem kommer att vara omöjligt, kraftigt öka begränsningen av teknik och tolkning av data. Dessutom är mer lämpad för att påvisa förändringar i avstånd, snarare än absoluta avstånd i LRET tekniken, som fel på absolut avstånd på grund av effekten av orienteringsfaktorn κ ² på R ₀ värdet sannoliktsänkas i distansändring analys eftersom dessa fel påverkar mätningar under alla förhållanden lika. Alternativa tekniker kan göras för att övervinna några av dessa begränsningar. Till exempel, för att undvika att lägga alltför många cysteiner kan man fästa en His-tag och märk den med en fluorofor bunden till nickel-NTA. Dessutom kan infödda tryptofaner användas som en av fluoroforer med insikten att om de används som givare, tryptofaner har mycket mindre livslängd än terbium, alltså intensitetsbaserade mätningar kan vara lämpligare än livstidsmätningar. Om mer exakt atom till atom avstånd krävs tekniker såsom röntgenkristallografi, molekyldynamik, eller NMR är fortfarande mer lämpliga metoder för att få dessa absoluta avstånd.

På grund av dess utsökta känslighet för distans förändringar kan LRET mäta avstånd förändringar med Ångström-nivå upplösning för lösning-fas proteiner och kan ge experimentella data utan behov av hög purity, isotop etiketter eller begränsningen storlek som försämrar både NMR och molekyldynamik. Efter att ha lärt och behärska tekniken, kan undersökningar i konformationsförändringar av proteiner göras mycket snabbare och med större lätthet än redan tillgängliga konventionella metoder. LRET ger också en utmärkt grund för vidare specialiserade resonansenergiöverföringstekniker som enda molekyl FRET (smFRET), vilket kan undersöka befolkningsfördelningen konforma tillstånd av enskilda molekyler, snarare än ensemblen genomsnittet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate	Life Technologies	PV3579
Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide	Life Technologies	F-150	Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide	Life Technologies	A-10254	Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide	Life Technologies	A-20346	Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide	Life Technologies	A-10256	Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide	Life Technologies	A-20344	Choice of acceptor depends on the specific experiment
QuantaMaster 3-SS	Photon Technology International		Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the millisecond range
FluoreScan 2.0	Photon Technology International		Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument
Origin 8.6	OriginLab		Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software
Quartz cuvette	Starna Cells, Inc	3-Q-10
Stir bar	Bel-Art Products	F37119-0007	Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette