Summary
Biz burada bir verici ve alıcı florofor siteleri arasında bir proteaz bölünme mevkisinin katılması, geliştirilmiş bir lüminesans Rezonans Enerji Transferi (LRET) yöntemini tarif etmektedir. Bu tadilat ile proteinlerin arıtılmadan zar proteinlerinin çalışmaya izin ilgi zar proteinleri, ortaya çıkan spesifik LRET sinyalleri elde edilmesine olanak sağlamaktadır.
Abstract
Lüminesans Rezonans Enerji Transferi, ya LRET, 10-100 Å mesafe aralığındaki proteinlerin iki site arasındaki mesafeleri ölçmek için kullanılan güçlü bir tekniktir. Çeşitli koşullar altında bağlandı mesafelerin ölçülmesi ile, proteinin konformasyonel değişiklikleri kolayca değerlendirilebilir. LRET, bir lantanid, en sık şelatlı Terbiyum ile, böyle uzun bir donör sadece emisyon ömür, birden fazla alıcı florosforlar kullanmak için esneklik ve kolay bir yol olarak hassaslaşmış akseptör emisyon tespit etmek için fırsat olarak avantajlar sağlamaktadırlar, donör flüorofor olarak kullanılır Ayrıca, verici-tek sinyali tespit riski olmadan enerji transferi ölçülür. Burada, zar proteinleri ifade dokunulmamış memeli hayvan hücrelerinin yüzeyi üzerinde analiz ile LRET kullanmak için bir yöntem tarif eder. Biz LRET florofor çifti arasında bir proteaz bölünme mevkisinin katılması. Orijinal LRET sinyali aldıktan sonra, bu bölgede bölünme kapsamındaki proteinden gelen spesifik LRET sinyalini ortadan kaldırırBize nicel bölünmesinden sonra kalan arka plan sinyali çıkarmak için izin ilgi. Bu yöntem, daha fazla fizyolojik olarak ilgili ölçüm değerlerinin proteinin saflaştırılması için gerek kalmadan yapılmasına izin verir.
Introduction
Lüminesans Rezonans Enerji Transferi (LRET) iyi bilinen bir flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) tekniği 1 bir türevidir. FRET benzer şekilde, 10-100 LRET 1-3 aralığında ilgilenilen proteinin üzerinde özel sahalara bağlı verici ve alıcı florofor arasındaki mesafeler ve mesafe değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir. LRET ilkeleri, donor-florofor emisyon spektrumu halinde akseptör-florofor emme spektrumu ile üst üste bindiğinde, iki florofor arasındaki yakın meydana Ayrıca rezonans enerji transferi FRET benzerdir. Bu transfer verimi aşağıdaki denklem ile, iki florofor arasındaki mesafe ile alakalıdır:
Denk. 1
R, iki florofor arasındaki mesafedir, E en verimliliğidirAşağıda tartışıldığı ji transferi ve R, 0, transfer verimi yarı maksimal olduğundaki mesafe örneğin flüorofor çifti için Förster yarıçapı vardır. Bu denklemden, bir o verim ters altıncı güç 1 yükseltilmiş mesafenin büyüklüğü ile ilgilidir görebilirsiniz. Bu zaman FRET çiftinin R 0 yakın hatta küçük mesafe değişikliklere zarif duyarlı olmaya FRET ve LRET ölçümler sağlar bu ters altıncı güç bağımlılığıdır. Özellikle proteinlerden veya diğer makromoleküllerden üzerinde arzu edilen the etiketlenebilmesi, bir yapısal değişimleri izlemek için bu duyarlılığının avantajından yararlanmak için izin verir.
Geleneksel organik boya molekülünü kullanan FRET, karşılaştırıldığında, LRET ilave avantajlar sunmaktadır. LRET ise, aksine, donor-florofor, bir lantanid serisi katyon, tipik olarak, Tb 3 + veya 3 + AB gibi bir organik boya kullanarak, 1,4-6 kullanılır. U düşmek Flüoroforlarnder Bu kategori, örneğin, terbium kelatı, ki bu da alıcı Flüoroforlann geniş bir yelpazede kullanılabilecek çok yönlü. Şelatlanmış lantanit emisyon spektrumu çok keskin bir emisyon tepe noktaları içeren, bu esneklik, alıcı florofor çeşitli biri ile kullanılacak olan donor-florofor ait tek bir türün izin veren, mümkün olmaktadır. Böylece, duyarlı alıcı emisyon donör emisyon 5 den sızdırma-through kirlenmesine neden korkusu olmadan tespit edilebilir. Deneyci, iki florofor (Şekil 1 ve Tablo 1) arasındaki mesafeye göre beklenen spesifik akseptörü seçer. Bu şelat lantanid florofor olarak, metal iyonu, makromolekül 1 belirli bir fonksiyonel gruba iyonu halata bir bioreactive işlevsel grup hem de uyarım, normal olarak zayıf emici lantanid duyarlı hale bir anten grubu içeren bir molekül ile kenetlenmiştir, 5,6. Oncheyecanlı e lantanit milisaniye mertebesinde bir çürüme oranı ile fotonların serbest bırakılması ile zemin durumuna rahatlayın. Çürüme bir tekli-to-tekli gevşeme ne de üçüz-to-tekli gevşeme ne olduğundan, fotonların emisyon düzgün flüoresan veya fosfor denilen olamaz, ama daha düzgün bir aydınlık 1 denir. Lantanide luminesansın uzun çürük büyük ölçüde ömrü ölçümleri yardımcı olur. Ömür ölçümler, daha sonra aşağıdaki ilişki ile verimliliğini belirlemek için kullanılabilir:
Denk. 2
nerede, E transferi verimliliği, τ D enerji transferi katılmayan donör (şelatlı lantanide) ömrü ve alıcısı ile enerji transferi katılan zaman τ DA donörün ömrü. LRET ile, τ DA al canterbium yaşam süresi çok daha büyük bir organik akseptör-floroforu daha uzun olduğundan çok hassaslaştırılmış alıcı emisyonunun ömrü olarak ölçülür. Alıcı onun kışkırtmaktan uyarma (donör lantanit) gibi aynı ömrü ile yayar ve akseptör kendi içsel floresan ömür boyu ömür boyu herhangi bir katkısı nispeten ihmal edilebilir düzeydedir. Akseptörüne donör: 1 oranında yerine donör emisyon daha duyarlı emisyonunu ölçerek, biz de tam bir 1'de etiketleme sağlamak için gereksinimini ortadan kaldırır. Protein yerine alıcısı ve verici fluoroforlar hem de aynı anda etiketli olabilir. Bir heterojen olarak etiketli nüfus sonuçlanır, ancak çift verici etiketli proteinler, alıcı dalga boyunda vermeyecek ve çift alıcı etiketli proteinler heyecan olmayacaktır. Ayrıca, florofor arasındaki mesafe, verici olarak bir izotropik lantanidler kullanarak, özellikle belirli bir flüorofor, takılan bu sistein Alanı, aynı olabilir, bu nedenle J`o`kfl olmalıdırd donör veya alıcı ya gereksiz almak için belirli bir siteyi belirtmek için. Şiddeti bir heterojen bir nüfusa sahip etkilenebilir, ama hala tespit edilecek yeterli daha fazla olmalıdır.
Denemelerin planlaması zaman florofor seçimi çiftinin R, 0 değeri hem de beklenen mesafe aralığı tarafından dikte edilmelidir ölçülmüştür. R, 0 değeri, aşağıdaki denklem ile tanımlanır:
Denk. 3
burada, R, 0 Angstrom olarak Förster yarıçapı, 2 κ (genellikle 2/3 olduğu varsayılır) iki boyalar arasındaki yönlendirme faktördür φ D donör kuantum verimi, J donörün arasında entegral bir spektral örtüşme M emisyon spektrumu ve akseptör en absorbans spektrumu - 1cm-1 mil 4, ve n, 1 ortamın kırılma indisidir.
Bizim laboratuar inceleniyoruz protein üzerindeki donör ve akseptör etiket siteleri arasında bir proteaz tanıma sitesi eklenmesi ile geleneksel LRET tekniğe bir değişiklik eklemiştir. Bu modifikasyon gibi bütün olarak memeli hücreleri gibi non-7 arıtıldı sistemlerde araştırma sağlar. Sistein de etiketli olan hücrelerde sistein sülfhidril grupları, diğer proteinlere bağlanan maleimid-konjüge boyalar ile etiketleme işleminde bu yana, etiketleme için yerler olarak sistein kullanılırken bu teknik, özellikle yararlıdır. Bununla birlikte, ilgi konusu bir protein üzerinde bir proteaz bölünme mevkilerini de dahil olmak üzere ve daha önce ve bölünmeden sonra ömürleri ölçülerek deneyi kantitatif ham sinyalinden proteaz bölünme sonra arka plan sinyalini çıkarmak olabilir. Bu çıkarma (Şek ilgilenilen proteinin kaynaklanan belirli bir sinyal izoleure 2). Yukarıda tarif edilen değiştirilmiş bir biçimi kullanılarak, LRET terbiyum şelat verici ve bir protein üzerindeki alıcı sonda arasındaki mesafe değişiklikleri ölçmek ve dolayısıyla saflaştırma için ihtiyaç duyulmadan, proteinin yaklaşık olarak fizyolojik halde yapısal değişimleri izlemek için de kullanılabilir.
Şekil 1.The emme ve siyah şelatlı terbiyum, hem de kırmızı temsili bir alıcı, Alexa 488, emisyon spektrumu. Birden fazla emisyon tepe ve terbiyum çelatın her bir zirve için keskin, dar yayma özelliğine edin. Bu model, terbiyum alıcı florofor ile birlikte kullanılabilir mümkün kılar ve terbiyum yayılıma gösterir, bu aralıklar içinde, duyarlı emisyon ölçümü kolaylaştırır. A ile oldukça iyi örtüşüyor nm 486 de Terbiyum emisyon zirve iki flüorofor arasındaki meydana rezonans enerji transferi için izin Alexa 488 bsorption pik. 515 nm dalga bu terbiyumun emisyon zirveleri arasında vadi içinde ve oldukça 520 nm Alexa 488 emisyon zirvesine yakın olarak bu çifti için hassaslaşmış emisyonu tespit etmek için mükemmel bir seçimdir. Alıcı zirveye yakın olmak, arzu olsa, değil gerekli-565 nm de hala terbiyumun emisyonu tespit olmadan Alexa 488 emisyonu tespit edebildiğini unutmayın.
| Akseptör-florofor | R 0 (Å) | Emisyon dalgaboyu (nm) |
| Atto 465 | 36 | 3px; "> 508|
| Fluorescein | 45 | 515 |
| Alexa 488 | 46 | 515 |
| Alexa 680 | 52 | 700 |
| Alexa 594 | 53 | 630 |
| Alexa 555 | 65 | 565 | 65 | 575 |
Tablo 1. LRET donör 11 olarak terbiyumun şelatını kullanmak için yaygın olarak kullanılan alıcı Flüoroforlann listesi. Verici ve alıcı, AMPA reseptörlerinin çözünür agonist bağlanma alanına bağlı zaman R, 0 değerleri ölçüldü. Her yeni sistem çalışılan tekrar R 0 değerini ölçmek için idealdir.
Şekil 2. sunulan LRET yöntemin bir bakış. (A) AMPA reseptörü ligand bağlanması üzerine yapısal değişimlere maruz kalan bir zar proteinidir. Kapaklı şeklinde ligand-binding etki kırmızı burada daire içine. (B) protein bağlı olmayan AMPA ligand bağlayıcı etki alanı, bir açık konformasyon (sol) olarak bulunmaktadır. Glutamat ligand bağlı olduğunda, protein ligandının (sağ) kapatır. LBD üzerinde ispat bölgelerinde florofor yerleştirilmesiyle, bu konformasyonel değişimin doğası sonra floresan ömrünü etkileyecek flüoroforlar değişiklikleri arasındaki mesafe olarak görülebilir. (Cı) ile etiketlenmesi, bütün hücreler, ilgilenilen protein hem de arka plan zar proteinlerinin her ikisi de etiketlenmesi (sol) meydana gelebilir. Proteaz bölünme sonra, ilgilenilen protein LRET sinyal sağlam bir arka plan sinyali (sağ) bırakarak, optimum olmayan bir fragmanının çözünür bir salınmasına kaybolur. Bu plan sinyal daha sonra ham sinyal düşülür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ilgili proteini içeren Construct oluşturma
Uygun bir vektör içine ilgi konusu proteini eksprese eden genin klonlanması. Örneğin, seri ya da pcDNA pRK5 gibi kullanımlar vektörler HEK293 ve CHO hücreleri gibi memeli sistemlerinde ifade için uygundur gibi.
Fluorophoresle Takip edilecek Protein üzerindeki Siteleri seçin 2.
- Protein içinde mümkün yapısal değişiklikleri yansıtmak mümkün etiketleme siteleri seçin. Eğer mümkünse, bu tespit etmek için, proteinin ya da homolog proteinin bir kristal yapısını kullanır. Hiçbir kristal yapısı mevcut değilse, proteinin olası yapısı tahmin etmek ve böylece, uygun bölgelere ilişkin bilgi almak için çevrimiçi yazılım.
- Protein sokulabileceği şekilde seçilen kalıntıların yan zincirleri, yüzeyde maruz kalan ve florofor için erişilebilir olduğu şekilde tortuları seçin.
- Artıklarını seçmekligand bağlanması karışmayan örneğin siteler için protein fonksiyonu için kritik değildir.
- Sistein mutasyonu ise, protein yapısı minimal bozukluklarına neden olur örneğin serin, benzer siteleri, tercih vermek.
- Etiketleme the seçtikten sonra, protein, sadece bu amaçlanan sitelerden LRET verir sağlamak için mutasyonlar tercih. Uzaklıkta potansiyel floresan etiketler ile konjüge maleimit bağlanan şekilde düzenli olmayan, disülfit bağlı, mutasyona sistein, standart alana-yönlendirilmiş mutagenesis protokolleri kullanarak. , Bunlar proteinin katlanmış şeklinde floresan boyalar ile reaksiyona girmemesi gerekmektedir Bu beri uzak, disülfit bağlı, sistein ve gömüldü, serbest sisteinleri mutasyona etme.
- Standart alana-yönlendirilmiş mutagenez yöntemi kullanılarak nokta mutasyonu yaparak istenen sitelerinin sistein artıklarını tanıtılması.
- Özellikle proteinden sisteinlerin bir kapalı yarabilir bir proteaz bölünme sitesini içerir. Eğerbu, tutucu (tanıma sekansı LVPRGS) veya trombin için protein ile mutasyona mevkisinin katılması için protein dizisi sağlar Faktör Xa (tanıma sekansı IDGR veya IEGR) sokulan sistein yakınında bölünmesini dizisi ve proteaz için erişilebilir; aksi takdirde tetra-ya da heksa-peptid dizisi, bir bütün olarak ilave edilebilir. Yarılma üzerine katılan sistein biri geri kalanından ayrışmaktadır şekilde site seç-protein bazı durumlarda, bu mutasyona uğramış bir sistein yan iki bölünme mevkilerinin gerektirebilir.
3. Test Protein İfadesi ve İşlevselliği
- Mutasyona uğrayan proteinin ifadesini teyit etmek için bir Western blot gerçekleştirin.
- Hiç, bir işlevsel olmayan proteinin yapısal değişiklikleri önlemek için eğitim durumunda, mutasyonlar minimal protein işlevi değişmiş sağlamak için proteinin işlevsel bir test gerçekleştirir.
NOT: Tüm proteinler farklı işlevlere sahip olduğundan, tek bir f yoktur LRET için özel olarak kullanılan unctional deneyi; Bununla birlikte, işlevsel tahlillerde bazı örnekler, iyon kanalları için enzimlerin enzim aktivitesi deneyleri, reseptörleri için ligand bağlanma deneyleri ve elektrofizyoloji çalışmaları içerir.
4. İkinci edilecek Flüoroforlar seçin
Beklenen mesafe aralığına göre seçeneğini flüorofor arasındaki aralık 0.5-1x florofor çiftinin R, 0 olacak şekilde ölçülmüştür.
NOT: Bu genellikle daha uzun ömür vardır arka plan, bir daha kolay çıkarma sağlar. Bu çifti için R 0 53 Å (Tablo 1) çünkü Örneğin, beklenen mesafe aralığı ölçülen eğer yaklaşık 35 Å, donör ve alıcı olarak Alexa 594 kadar terbiyumun selat olacağını kullanmak için uygun bir flüorofor çifti vardır.
Geçici olarak Memeli Hücrelerinin Gereken miktarı ile transfekte olan proteini de ifade 5.
ntent ">, geçici olarak, ortak transfeksiyon reaktifleri herhangi biri kullanılarak seçilen memeli hücrelerine ilgi konusu proteini transfekte Tipik haliyle, HEK ve bunlara CHO hücre çizgileri için LRET deney başına dört adet 10 cm'lik kaplar kullanır;., ancak bu miktar, protein ekspresyonuna bağlı olarak değişebilir , stabilite, vs. hücrelerin hasat edilmesinden önce 36-48 saat boyunca protein ifade etmek için izin verin.6. Proteinler Etiket
- Kültür çanak hücreleri ayırmak. Sadece çanak dibine tampon pipetle HEK hücreleri ayırmak. Ekstrasellüler tampon ile medya yıkayarak, bir hücre kazıyıcı ile CHO hücreleri ayırmak.
- 3 dakika boyunca 1100 x g'de santrifüj ile hücreler toplanır. Sonraki yıkamadan sonra, yanı sıra etiketleme sonra hücrelerin toplanması için bu aynı santrifüj ayarları kullanın.
- Daha sonra, 100-300 nM'lik nihai bir konsantrasyona kadar eşit mol miktarlarında, verici ve alıcı florofor ekleyin hücre tamponu, 3 ml süspanse. Rotator f inkübeya da oda sıcaklığında 1 saat.
- Daha sonra, bağlanmamış florofor kaldırmak LRET ölçümleri için hücre dışı bir tampon maddesi (genellikle 2 mi) içinde, bu hücrelerin süspansiyonu hücre tamponu ile 3-4x bu etiketlenmiş hücreleri yıkayın.
- Bir kontrol olarak, bir akseptör-floroforu ilavesi olmaksızın, sadece, donor-florofor (terbiyum şelat) ile hücrelerden oluşan ayrı bir dizi etiket.
Not: Bu donör okunur deneylerden elde edilen veriler analiz tamamlanması için gereklidir. Bu deneyler, aynı ya da farklı günlerde yapılabilir. - Etiketleme işlemi de işlev etiketlenmesi için kullanılan siteye bağlı olarak engel olabilecek Yine, fonksiyonel doğrulama, etiketli mutant protein ile bu kez gerçekleştirin.
NOT: Bu deneyler, aynı ya da farklı günlerde yapılabilir.
7. LRET Deneyi kurun
- 1 ml 'lik bir minimum hacimde bir kuartz küvet içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler yerleştirin.
- Bilgisayar ve cihaz üzerinde açın ve DAT parametrelerini ayarlamakBu duruma göre, bir satın alma programı.
- (Terbium Şelatın için iyi çalışır nm 330-340) donör floroforun absorbans aralığı dalgaboyu ayarlayın.
- Alıcı emisyon kullanılan alıcısı göre değişir göz önünde tutarak, uygun emisyon dalga boyu ayarlayın. Önemlisi, sadece alıcı emisyonunu ölçer ve herhangi akmalarını donörün emisyonundan içermeyen bir algılama dalga boyu seçmek. Örneğin, bir alıcı Tablo 1 Alexa 555 için 565 nm bir dalga boyuna kullanılır. Proteinin, sadece vericinin ile değil alıcı içermeyen etiketli edildiği donör okunur ölçümleri için, terbiyum çelat yayımını ölçmek için 545 nm dalga boyuna kullanır.
- Emisyon algılama uzunluğu uzun ömür bileşeni cevapsız olmayacak emin olmak için en az üç kez beklenen LRET ömür boyu olacak şekilde ayarlanır.
- Tarama gerçekleştirin. 99 Piyango en az üç taramaları sonuçlarının tutarlılığını sağlamak için vermeyin. Inci KaydetBir metin dosyası (* txt) e sonuçları.
- (Örneğin, bir ligand eklenmesi gibi) farklı koşullar ile ilgili bir proteinin yapısal değişiklikleri ölçmek için, bu koşullar değiştirebilir ve tekrar yeni bir koşul altında aynı numune üzerinde 99 temizleyicileri her birinin en az üç taramalar yapar. Glutamat reseptörlerinin yapısı üzerinde glutamat etkileri incelenirken, örneğin, adım 7.3 taranan aynı numune için 1 mM glutamat ekleyin ve yeniden tarama.
- Uygun proteaz beş adede kadar ekleyin ve bölünme tamamlanır ve daha fazla değişim birbirini izleyen üç taramalar için ömür boyu görülene kadar sürekli taramalar alır. Genellikle, iki bölme ile 3 saat içinde tamamlanır. Bir Faktör Xa proteaz klivaj sahası bölünmesi için kullanılmaktadır, örneğin, örneğe Faktör Xa 3 ul ekleyin ve 3 saat boyunca her 30 dakikada bir tarama.
8. Elde edilen verileri analiz
- Veri analiz yazılımı açın.
- Floresan ömrünü yükleyinmetin dosyalarını açmak için İthalat ASCII kullanarak veri. Bir dosya içine tüm çoğaltır yanı sıra nihai plan ölçümleri, yükleyin.
- Son verileri almak için her deneysel koşul için tüm taramaları verilerin ortalamasını. Bireysel denemeler içeren sütunları vurgulamak Bunu yapmak için, daha sonra menü çubuğunda Veri menüsü altında, denemelerinden ortalama floresan yoğunlukları yanı sıra, standart sapma ve standart hata görüntülemek için Satırlar üzerine İstatistiklere tıklayın.
- Akseptörünün duyarlı emisyon ömrünü temsil eden bir eğri oluşturmak için X-ekseni üzerinde mikrosaniye Y ekseni ve hizmet ömrü floresan ile bir çizgi grafiği olarak ortalama değerleri çizilir. Verilerin daha iyi görünüm için izin, bir günlük ölçekte komplo Y-eksenini değiştirmek.
- Tam bölünmeye işaret örtüşme gösteren son taramalar ortalama plan ölçüm verileri üzerinde adımı yineleyin 8.3.
- Üzerinde ortalama arka plan verileri görüntülemekortalama ham verileri içerir aynı parsel. Bunu yapmak için, Plot menüsü altında bulunan Katman Denetimi iletişim kutusunu açın. Sonra, ortalama Katman İçindekiler listesine arka plan içeren veri aktarımı.
- Ortalama ham verilere ortalama plan veri hizalayın. Bunu yapmak için, çarpma veya arka kuyruk ucu ham veri kuyruk ucu ile örtüşmektedir kadar gerektiği gibi arka plan verileri bölmek için Matematik menüsü altında Basit Matematik işlevini kullanın.
NOT: Bu kuyruk sonunda, ilgilenilen protein ömrü zaten tamamen çürümüş olması gerekir; Ne hizalanır önce ve proteaz bölünme sonrasında sadece arka plan sinyali mevcuttur. - Tekrar Basit Matematik işlevini kullanarak, başlangıç ham LRET sinyalinden hizalanmış plan sinyali çıkarın.
- Bir üslü için veri uygun (tek veya çoklu üstel, siteler ve deneysel tasarım bağlı).
- Bitiminden sonra başlayacak takılması için başlangıç sınıra ayarlayınlazer nabız. Sonraki tüm eğri parçaları için aynı StartPoint kullanın.
- Tek üslü bir bozulma için aşağıdaki denkleme süresi uyacak şekilde Seç Uydurma İşlevi iletişim kutusunda, üstel bozulma seçin:
Denk. 4
y floresans yoğunluğunu temsil eder, y, 0 x zaman, T floresan süresi, A, 1, sinyal yoğunluğu nedeniyle sistemden gürültü arka plan yoğunluğu temsil etmektedir, ve x, 0 ofset zamandır. - X 0-0 Fix Montaj Fonksiyonu başlatmak ve veri uygun.
Not: Deney tek siteleri bir çiftten sinyal sahip olacak şekilde tasarlanmıştır, elde edilen verileri kolayca tek üslü bir bozulma 8 ile uygun olmalıdır. Uyum kalıntı uyum iyiliğini belirlemek için iyi bir yöntemdir ve ek çürüme ömürleri kullana iseed.
- Förster denklemi (Denklem yukarıdaki 1 ve 2 yeniden düzenlenmesini) kullanarak floroforlar arasındaki mesafeyi hesaplamak için veri elde ömür kullanın:
Denk. 5
Not: τ DA hassaslaştırılmış alıcı emisyon ömrü gibi ölçülmüştür edilmiş olan, yukarıda da belirtildiği gibi tüm değişkenlerdir. R 0 ve R ölçümleri konusunda daha fazla ayrıntı ve örnekler başka 7,9,10 bulunabilir. - Tekrarlanabilirliği sağlamak deney ve veri analizini, en az üç kez tekrarlayın. Aynı ölçüm bireysel tekrarlar arasında tutarsızlık söz içine verilerin geçerliliğini çağırır; ek kontrol deneyleri veya tekrarlar kullanın. Hatayı yayar (Dr. Thomas Huber tarafından geliştirilen) ücretsiz Gustavus Hata analizi hesap veya benzer bir sistemi kullanarak ölçüm hataları hesaplayınömür boyu uyuyor.
Denk. 4 
Denk. 5 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir lantanide donörü ile başarılı bir LRET ölçüm milisaniye zaman aralığında sadece ömür boyu bir donör olmalıdır. Verici ile kabul hem etiketli proteini sensitize LRET emisyon süresi. Arka plan çıkarma Şekil 3 sonra mikro saniye aralığında bir kullanım ömrüne sahip, özellikle daha kısa (zaman içinde stabil olmalıdır ömrü bir artışa parçalanma sonucu proteazın doyurmaya yani artık proteaz bölünme Şekil 4, komple olduğunu gösterir) değiştirmek. LRET sinyal sitelerinin sadece bir grup gelen, arka çıkarılmasından sonra elde edilen salım süresi, tek bir üslü süresi vermelidir.
Yapısal değişiklikleri ölçerken, spesifik LRET sinyali ölçüm Şekil 3'ün hata dışında boyunca bir değişiklik göstermelidir. Ölçüm hatası hatanın yayılma hesaplanabiliryaşamların uyum ile ilişkili s. Denklem 4, ömrü, τ tarif üslü zayıflamalı fonksiyonların en az sayıda veri takıldıktan sonra, tespit edilebilir. LRET çifti test koşullarında iki floroforlar arasındaki mesafeyi hesaplamak için denklem 5 kullanma, verici-alıcı ve verici sadece ömürleri R 0 değeri ile birlikte kullanılabilir. Proteinin genel yapısı ve fonksiyonu bu koşullarının değişmesinden kaynaklanan mesafe değişikliği ile ilgili şimdi deneyci işidir.
Asit-Algılama İyon Kanal 1a (ASIC1a) Şekil 3. LRET ölçümleri. Floresan yoğunluğu görsel yorumlama kolaylığını artırmak için bir logaritmik olmuştur. (A) Kaynak örnekler sadece tek exponentia göstermektedirpH değişmez l çürüme. Verici-alıcı etiketli örneklerde, (b), hassaslaşmış emisyon boyunca bir düşüş (kırmızı siyah) 8-6 pH düşüşü üzerinde görülmektedir. Bu ömür boyu azalma ASIC1a bir parmak ve başparmak alanları arasındaki mesafe bir azalma gösterir. Bu rakam, Ramaswamy, ve arkadaşları, 2013 8 modifiye edilmiştir.
Şekil 4. Asit Algılama iyon kanalı 1a (ASIC1a) üzerinde yapılan ölçümleri LRET geri çıkarma etkisi. Siteleri, özellikle bir proteaz bölünme sitesinin ayrılır florofor ile işaretlenmiş olması. LRET ölçümleri yapıldıktan sonra, bu durum, proteazın özel sinyal kaybına protein numune ve ilgi sonuç proteinin takip eden yarılmaya ilave edilir. Kalır Herhangi LRETDiğer zar proteinlerinin varlığını sürdüren diğer sistein bağlı florofor arka floresan olan. Bu arka plan Çıkarma ilgilenilen protein için gerçek LRET verileri izole eder. Bu rakam, Ramaswamy, ve arkadaşları, 2013 8 modifiye edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LRET bilim adamları, tek bir proteinin içinde yanı sıra multimer alt birimler arasındaki etki arasındaki mesafeleri ölçmek için olanak sağlayan güçlü bir tekniktir. Bu nedenle, LRET proteinlerden veya diğer makromoleküllerden yapısal değişiklikleri ve dinamiğini incelenmesi için çok uygundur. Yukarıdaki protokol kolayca hipotezlerini test etmek için düzgün donanımlı laboratuvarı izin vermelidir; Ancak, yeni araştırmacının başına bela olabilecek hata birçok ortak kaynakları vardır. Az veya hiç LRET sinyali görülürse, ilk kullanılan dalga boyu ayarlarını kontrol edin. Uyarma terbiyum (330-340 nm) absorbans aralığı içinde olması gerekmektedir. Verici-alıcı ölçümleri için, emisyon dalga boyu akseptör-floroforu ile eşleşmelidir ise örnek, yalnızca verici florofor alıcı florofora ve olmadan etiketlendi verici bir tek ölçümler için, emisyon dalga boyu, Şekil 1 'de gösterilen tepe birine olmalıdır Tablo 1 kullanılır. wavele isength ayarları doğru, tamponlar uyumluluğunu kontrol. Bazı flüoroforlar belirli tampon maddeler ile ya da bazı pH aralıklan içinde uyumlu olmayabilir. Sonraki, artıkları ve Flüoroforlann seçim uyumlu olduğundan emin olun. Deney tasarımı tamamen doğruysa, o zaman sorun büyük olasılıkla florofor ya da protein ya da kendisi ile birlikte yer almaktadır. Zamanla, florofor stok çözeltileri bozulması ve yetersiz etiketleme neden olabilir. Son olarak, protein ekspresyonunu ve işlevselliği. Pek çok mutasyon, sistein oluşumu ile birlikte, doğal sistein çıkarılması, ve en az bir proteaz bölünme sitesinin getirilmesi dahil olmak üzere, ilave edilmiştir. Bu nedenle, hatta normal transfeksiyon koşullar altında, mütasyonlar görülen sinyal düşürücü altında ifade ilgilenilen proteinin protein ve destabilize neden olmaları mümkündür. Ifade ise, mutasyon ya da farklı etiketleme yerleştirilmesini artıkları neden proteinin denatürasyonuna yol açabilirvahşi tip proteinin görülen beklenen mesafelerden. Western blot proteininin ifadesini kontrol etmek için kullanılabilir. Özellikle yüzey kaçakçılığı ortaya koyacak ilgi protein için bir western blot tarafından izlenen bir yüzey membran proteini kaçakçılığı, hücre yüzeyinde biyotinilasyonunun ve yüzey maruz proteinlerin çekme-aşağı, hakkında herhangi bir soru varsa. LRET protein türü çok çeşitli kullanılabilir çünkü fonksiyonel testler için, özellikle LRET ile kullanım için tavsiye tek bir tahlil yoktur. Yine de, fonksiyonel analizlerin olası örnek enzim aktivitesi deneyleri, ligand bağlama deneyleri ve elektrofizyoloji çalışmaları içerir. Protein ifade veya işlev çok olumsuz tanıttı mutasyonlar tarafından etkilenmiş, daha sonra yeni etiketleme siteler seçilmelidir.
Bir LRET sinyal görülür, ancak böyle bir sonuç beklendiği durumlarda, tek bir üstel tarafından plan doğru çıkartılmış olduğu ilk çeki monte edilemezse. Af Eğerter çıkarma, bir multi-üstel çürüme görülür, bu sinyal amaçlanan ne başka çoklu etkileşim gelen gözlenen LRET bir göstergesi olabilir. Diğer tüm erişilebilir sisteinler proteinden çıkarıldığından emin olmak için kontrol edin. Bir kristal yapı varsa, bu sisteinlerin kontrol etmek için çok yararlı bir araç olacaktır. Yine, disülfid ile bağlanmış ve gömüldü, ulaşılmaz sisteinler uzak mutasyona gerek yoktur. , Onları mutasyona proteinin bir yerli olmayan sistein tanıtmak ve verici-alıcı etiketli örnek hiçbir LRET sinyal yok olduğundan emin olmak için bir zorlayıcı sebep varsa, bu sisteinlerin erişilememesi test etmek için. Tüm erişilebilir sisteinler gerçekten uzak mutasyona uğramış ise protein çoklu altbirimden varsa veya bir kompleksin parçası ise, ve, sonra bu yakın proteinleri veya alt birimden takılarak boya nedeniyle karıştırıcı LRET sinyali olabilir. Bu sorunları ile yardımcı olabilir farklı bir proteaz bölünme sitesi Seçimi; aksi takdirde, diğer etiketleme sitesilar Seçilen gerekebilir. Montaj ile sorun, sadece sinyal-gürültü meselesi, son olarak olası problem, Düşük protein ifade etmektir. İfade etc farklı transfeksiyon koşullar, farklı bir vektör aracılığıyla optimize edilmesi gerekir.
LRET ölçümler anormal bir ya da görünüşte fiziksel anlamsız sonuç üretmek varsa, kolayca belirgin olmayabilir protein özgü sorunları olabilir. Örneğin asit algılamalı iyon kanalları, bazı hücre ölümü ve protein denatürasyonu neden olabilir pH değişiklikleri için bir asitin daha dikkatli ilavesiyle gerçekleştirilebilir. Bu durumda, birden çok numune, her pH için, bir test edilecek hazır olmak gerekir. Ayrıca, rezonans enerji transferi ek olarak, yerel ortam değişikliği bir floresan sinyalini etkiler. Bu tür bir değişim önemli ise, bir çift ya da çok üslü olarak verici sadece ölçüm not edilecektir. Bu gibi durumlarda, etiketleme siteleri m farklı konumlara taşınması gerekirAKE emin koşullarında değişiklik Flüoroforlann spektral özelliklerini değiştirmez.
Zihin sorunların bu kaynakları tutmak bile, bir deneyci farkında olmalıdır hangi LRET bazı uyarılar ve sınırlamalar vardır. İlk olarak konvansiyonel etiketleme tekniği etiketleme sistein artıklarının dayanır. Non-spesifik kalıntılarının etiketleme azaltmak için, diğer sisteinler genellikle dışarı mutasyona uğramıştır; Bununla birlikte, bu yöntem, her zaman pratik değildir. , Bir protein, proteinin yapısı veya fonksiyonu için kritik olan yapısı ile doğal olmayan bir çok-sistein disülfür bağlı varsa, örneğin, daha sonra büyük ölçüde tekniğin sınırlandırılmasını ve veri yorumlama artan imkansız olacaktır onları mutasyonunu içerir. R, 0 değerini 2 κ yönlendirme faktörü etkisi nedeniyle kesin mesafe herhangi bir hata olasılığı olarak da, LRET tekniği, yerine mutlak mesafelerinden daha mesafe değişiklikleri tespit etmek için daha uygundurBu hatalar, herkese eşit koşullarda ölçümleri etkileyebilir çünkü mesafe değişikliği analizinde azaltılmalıdır. Alternatif teknikler bu sınırlamalar bazılarının üstesinden gelmek için yapılabilir. Örneğin, çok sayıda sistein eklenmesi kurtulmak için, bir His-tag tutturmak ve nikel-NTA bağlı bir florofor ile etiket olabilir. Aynı zamanda, yerli tryptophans böylece, verici olarak kullanıldığında, terbiyum tryptophans çok daha küçük bir kullanım ömrüne sahip olduğu anlayışı ile, bir florofor olarak kullanılabilir yoğunluk ölçümleri göre kullanım süresi ölçümleri daha uygun olabilir. Atomunu mesafelerde daha fazla tam atomu gerekirse, örneğin X-ışını kristalografisi, moleküler dinamik ya da NMR gibi teknikler yine de bu mutlak mesafelerin almak için daha fazla uygun tekniklerdir.
Onun zarif duyarlılık değişiklikleri uzaklığa nedeniyle, LRET çözüm faz proteinleri için angström düzeyinde çözünürlük ile mesafe değişimleri ölçebilir ve yüksek Puri için gerek kalmadan deneysel veriler sağlayabilirty, izotop etiketler veya NMR ve moleküler dinamiklerini bozar boyutu kısıtlama. Teknik öğrenme ve hakim sonra, proteinlerin konformasyonel değişikliklere neden incelemeleri çok daha hızlı ve daha önce mevcut geleneksel tekniklere kıyasla daha kolay bir şekilde yapılabilir. LRET bireysel moleküllerin konformasyon yerine topluluk ortalamasının nüfus dağılımını incelemek böyle tek bir molekül, FRET (smFRET) gibi başka özel bir rezonans enerji transferi teknikleri için mükemmel bir temel sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Sağlık Hibe GM094246, Amerikan Kalp Birliği Hibe 11GRNT7890004 ve Ulusal Bilim Vakfı Hibe MCB-1110501 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate | Life Technologies | PV3579 | |
| Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide | Life Technologies | F-150 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide | Life Technologies | A-10254 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20346 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide | Life Technologies | A-10256 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20344 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| QuantaMaster 3-SS | Photon Technology International | Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the millisecond range | |
| FluoreScan 2.0 | Photon Technology International | Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument | |
| Origin 8.6 | OriginLab | Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software | |
| Quartz cuvette | Starna Cells, Inc | 3-Q-10 | |
| Stir bar | Bel-Art Products | F37119-0007 | Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette |
References
- Selvin, P. R. Principles and biophysical applications of lanthanide-based probes. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 275-302 (2002).
- Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 719-726 (1967).
- Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
- Selvin, P. R., Hearst, J. E. Luminescence energy transfer using a terbium chelate: improvements on fluorescence energy transfer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 10024-10028 (1994).
- Chen, J., Selvin, P. R. Thiol-reactive luminescent chelates of terbium and europium. Bioconjugate Chemistry. 10, 311-315 (1999).
- Ge, P., Selvin, P. R. Thiol-reactive luminescent lanthanide chelates: part 2. Bioconjugate Chemistry. 14, 870-876 (2003).
- Gonzalez, J., Rambhadran, A., Du, M., Jayaraman, V. LRET investigations of conformational changes in the ligand binding domain of a functional AMPA receptor. Biochemistry. 47, 10027-10032 (2008).
- Ramaswamy, S. S., Maclean, D. M., Gorfe, A. A., Jayaraman, V. Proton mediated conformational changes in an Acid Sensing Ion Channel. J. Bio. Chem. 288, (2013).
- Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. Conformational changes at the agonist binding domain of the N-methyl-D-aspartic acid receptor. The Journal of Biological Chemistry. 286, 16953-16957 (2011).
- Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. Subunit arrangement in N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. The Journal of Biological Chemistry. 285, 15296-15301 (2010).
- Kokko, T., Kokko, L., Soukka, T. Terbium(III) chelate as an efficient donor for multiple-wavelength fluorescent acceptors. Journal of Fluorescence. 19, 159-164 (2009).
