The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.
The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.
분자 세포 생물학의 급속한 발전과 의학에서 개선 된 의약품에 대한 지속적인 필요가 구조 생물 학자들이 점점 더 복잡한 단백질 구조를 보면 할 필요를 만들었습니다. 이들은 종종 자신의 정교한 폴딩 및 효소 활동을 지원하기 위해 특정 번역 후 변형, 분자 보호자와 공동 요인을 요구할 수 있습니다. 박테리아 발현 시스템을 사용하여 수득 된 단백질 데이터 뱅크에 존재하는 구조의 대부분 동안, 원핵 이러한 변형의 다수를 수행 할 수없는 많은 진핵 필수적인 공동 요인이 부족하다. 이 작은 신호 전달 물질에 의해뿐만 아니라 핵, 세포 표면과 정교한 접는 기계를 필요로 분비 단백질 활성화 대형 멀티 – 서브 유닛 단지의 연구에 문제가 될 수 있습니다. E.의 숫자 대장균 균주는 이러한 한계 일의 일부를 극복하기 위해 설계되었다. m의 최근에는, 그러나, 사용그들이 안정적으로 다른 시스템 2에 표현 그렇지 않으면 문제가된다 진핵 세포 단백질을 생산하기 때문에 ammalian 발현 시스템이 증가하고있다. 오늘은 화학 매개 형질 전환에 바이러스 성 전달에 이르기까지 다양 다양한 기술을 통해 안정적이고 과도 포유 동물 발현 세포주를 얻을 수있다, 이러한 일렉트로 및 직접 분사 3과 같은 물리적 유전자 전달. 이들 방법 모두가 장점과 단점을 자신의 세트를 가지고 있지만, 그 중 일부는 어느 너무 비싸고 및 / 또는 시간 소모적 인 구조적 연구에 적합하다.
여기에서 우리는 서스펜션 성장 포유 동물 세포에서 구조 생물학에 대한 단백질 복합체를 표현하기위한 매우 간단하고, 빠르고, 저렴하면서도 효율적인 방법을 설명합니다. 접근 방법 (예를 들어, 자유형 HEK 293F 세포) 인간 배아 신장 (HEK) 세포주의 과도 공동 형질을 사용합니다. 이러한 세포는 HEK 293 CE로부터 유도 된LL 라인은, 혈청이없는 배지를 사용하여 고밀도 (예 : 자유형 293 식 매체로서)에 도달, 현탁 배양 물에서 성장하도록 적응된다. 세포는 일시적으로 폴리에틸렌 이민의 분지 버전 (PEI), 엔도 시토 시스 (5)에 의해 숙주 세포를 입력 DNA / PEI 복합체를 형성함으로써 포유 동물 세포 (4)의 넓은 범위에서 작동하는 것으로보고되었다 저렴 중합체 시약을 사용하여 형질 전환된다. 이 방법은 소규모 (30 ml) 및 (300 mL로) 큰 규모의 실험 모두에 적합하며 정제 단백질 복합체의 높은 수준을 생성 할 수있다. 그것은 복잡한 접는 기계, 공동 요인 또는 박테리아, 효모 및 곤충 세포에 의해 수행 할 수없는 특정 번역 후 변형을 필요로하는 단백질을 연구에 특히 유용합니다.
이 프로토콜에서 우리는 Sin3A 전사 억제 복합체의 세 가지 단백질 중앙 지지체의 발현 및 정제를 제시한다. 이 히스톤 구성아세틸 라제 일 (HDAC1), 결함이 음소거 세 (SDS3)의 보호 회로 및 스위치 독립적 인 세 (Sin3A). 정제 된 단지는 높은 처리량 결정화 실험에 사용됩니다.
우리는 표현 및 재조합 단백질 및 포유 동물 세포에서 다중 서브 유닛 단지 많은 양의 정제 (PEI는 시중에서 판매하는 친 유성 형질 전환 시약보다 훨씬 적은 비용) 간단하고 비용 효율적인 방법을 개발했습니다. 프로토콜 절에서 설명한 바와 같이 고순도의 플라스미드 DNA (280 분의 260 1.8 내지 2.0) PEI와 조합하여 사용하는 경우 최적의 형질 전환 및 발현 효율에 도달 할 수있다. 세포 serum-과 항생제가없는 배지에서 배양해야하므로, 멸균 기술은 엄격히 비용과 시간이 소요되는 감염을 방지하기 위해 계대 및 형질 세포 요구된다. 세포 생존율이 90 % 이상이어야하며 문화가 2.5 × 10 6 세포보다 더 큰 밀도로 성장하지 말아야 / 즉시 형질 전환하기 전에, 이렇게 같이 단백질 생산량을 줄일 ML. 성공적인 형질의 경우, 문화는 단일 또는 분할 세포를 포함해야합니다. 클러스터는 활기에 의해 나누어 질 수있다30 초 (그림 5) OU를 소용돌이로 교반 (20). 공동 – 형질 전환에 사용 된 각 플라스미드의 비율은 연구 복잡한 존재의 화학량 론에 따라 사용자에 의해 변경 될 수있다. 적합한 발현 시간이 설정 될 수 있도록 발현 효율, 관심 단백질에 대해 최적화 될 수있다. 정제는 불필요한 단백질 가수 분해의 위험을 감소시키기 위해 시점의 단백질 샘플 차가운 유지 수행되어야한다. 그들은 종종 감소 된 용해도 및 / 또는 효소 활성의 손실의 결과, 구조적 요소 또는 특정 단백질의 활성 부위를 방해 할 수 있기 때문에, 태그와 정화 버퍼의 선택은 중요하다. 소규모 형질 큰 단백질 복합체의 정제를위한 다른 구조를 테스트하기 위해 특히 유용하다.
오늘, 대체 방법의 큰 다양성 재조합 진핵 생물의 단백질 (표 2)의 표현을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, Baculovi곤충 세포에서 발현 RUS 널리 높은 전달 효율과 기타 바이러스 종 6과 비교하여 세포 독성의 결여로 인해 사용된다. 그러나 바이러스의 제조 공정은 시간 소모적이며 불안정성 바이러스 오랜 기간 동안 저장 될 수 없습니다. 한편, 효모 발현 시스템은 높은 단백질 수율 7의 결과, 발효기 배양에서 세포에 매우 높은 밀도의 증가 가능성을 제공한다. 그러나 그들은 여전히 제대로 접과 단백질 파트너와 상호 작용하는 진핵 생물의 단백질에 필요한 번역 후 변형의 전체 다양성이 부족하다. HDAC3은, 예를 들면, 발현 되나 E.를 접을하지 대장균. 293F 세포에서 발현 때, 우리는 공동 억제 (SMRT)와 원핵 세포에서 발견되지 이노시톨 tetraphosphate (IP4) 8의 분자 복잡한에서 활성 효소를 정제 할 수 있었다. 이 방법은 성을 정화하고 결정을 해결하기 위해 우리를 허용했다HDAC1 유사 IP4 구에 의해 활성화되는 NuRD 단지에서 MTA1와 상호 작용 ructure. 이상적으로, 우리는 항상 자연, 생리적 환경에서 진핵 생물의 단백질을 표현하고 싶습니다. 생물 반응기에서 10-12 HEK-293 세포를 EBNA1 이용한 포유 동물 발현 시스템을 설명하고 단백질의 매우 높은 수준을 수득하지만, 이러한 사용이 복잡 할 수있다.
우리의 방법은 박테리아, 효모 및 생물 반응기 시스템의 표현에 대한 간단하고 접근 대안입니다. 발현 방법은 빠르고 롤러 병 또는 플라스크 분위기 5 % CO 2 인큐베이터 진탕 및 표준을 사용하는 대체되는 경우에 특히 고가의 장비의 사용을 요구하지 않는다. 우리는 여러 플라스미드 – 형질을 공동 문화> 1 ㎎ / ℓ의 수율 최대 5 단백질과 복합체를 정화하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 흥미롭게도, 시스템이 안정적으로 잘 작동 단지의 식별을하는 데 도움이됩니다. 예, 예를 들어HDAC1과 Sin3A의 이진 단지의 Pression의 단백질의 제한 수율을 준, 아직 SDS3의 추가는 더 높은 금액을 5 배, 따라서 적절한 구조와 결정화 안정적인 단지 선택에 구조 생물학을 안내 결과.
The authors have nothing to disclose.
우리는이 작업과 레스터 핵심 생명 공학 서비스의 대학에 사용되는 식 구조를 준비 박사 Xiaowen 양 (PROTEX 복제 서비스) 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 BBSRC 학생이기 의해 지원되었다, 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 프로그램 및 수석 수사관 보조금 WT085408 & WT100237 및 BBSRC는 RM31G0224을 부여합니다.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
FreeStyle HEK 293F cells | LifeTechnologies | R790-07 | |
FreeStyle 293 Expression Medium | LifeTechnologies | 12338-018 | |
Anti-FLAG M2 Affinity Gel | SIGMA | A220 | |
250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning | 431144 | |
Roller bottles with vented caps | Corning | 01836-02 | |
Polyethylinamine, 25 kDa, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 – 4ºC |
Mammalian expression vector | – | – | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
0.22 µm Centrifugal Filter Units | Amicon | UFC30GV00 | |
15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off) | Amicon | UFC901008 | |
Superdex 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17-5175-01 |