Introduction
El rápido progreso de la biología molecular de las células y la necesidad constante de mejorar los medicamentos en la medicina ha creado la necesidad de biólogos estructurales para observar las estructuras de proteínas cada vez más complejos. Estos a menudo puede requerir determinadas modificaciones posteriores a la traducción, chaperones moleculares y co-factores para apoyar su elaborada plegamiento y la actividad enzimática. Mientras que la gran mayoría de las estructuras presentes en el Protein Data Bank han sido obtenidos usando sistemas de expresión bacterianos, los procariotas son incapaces de realizar un gran número de estas modificaciones y carecen de muchos co-factores esenciales eucariotas. Esto puede ser un problema para el estudio de complejos de múltiples subunidades grandes que son activados por pequeñas moléculas de señalización, así como para nuclear, superficie celular y proteínas secretadas que requieren mecanismos de plegado elaborados. Un número de E. cepas de E. coli han sido diseñados para superar algunas de estas limitaciones 1. En los últimos años, sin embargo, el uso de msistemas de expresión ammalian ha ido en aumento, ya que producen confiablemente proteínas eucarióticas que son de otra manera problemática de expresar en otros sistemas 2. Hoy en día es posible obtener líneas celulares de expresión de mamífero estables y transitorios a través de una variedad de técnicas que van desde la transducción viral de la transfección mediada por productos químicos, gen-transferencia física tales como la electroporación y la inyección directa 3. Aunque todos estos métodos tienen su propio conjunto de ventajas y desventajas, sólo unos pocos de ellos son adecuados para estudios estructurales son demasiado caros y / o tiempo.
Aquí se describe un método muy simple, rápido, de bajo costo pero altamente eficaz para la expresión de complejos de proteínas para la biología estructural en suspensión crecido células de mamíferos. El enfoque utiliza la co-transfección transitoria de un riñón embrionario humano (HEK) línea celular (por ejemplo, células HEK 293F Freestyle). Estas células se han derivado de la HEK 293 celínea ll, están adaptados para crecer en cultivos en suspensión, alcanzando altas densidades utilizando medios libres de suero (como FreeStyle 293 Expression Media). Después las células se transfectaron transitoriamente utilizando una versión ramificado de polietilenimina (PEI), un reactivo polimérico de bajo costo que se ha informado de funcionar por una amplia gama de células de mamífero 4 mediante la formación de complejos de ADN / PEI que entran en la célula huésped por endocitosis 5. Este método es adecuado tanto a pequeña escala (30 ml) y gran escala (hasta 300 ml) experimentos y puede producir altos niveles de complejos de proteínas purificadas. Es particularmente útil para el estudio de proteínas que requieren mecanismos de plegado complejos, co-factores particulares o modificaciones post-traduccionales que no pueden ser realizadas por bacterias, levaduras y células de insectos.
En este protocolo se presenta la expresión y purificación de la central de andamio de tres proteínas de la Sin3A complejo de represión transcripcional. Este consta de histonaDeacetilasa 1 (HDAC1), supresor de silenciamiento defectuosa 3 (SDS3) y Switch-independiente 3 (Sin3A). El complejo purificado se utiliza para los ensayos de cristalización de alto rendimiento.
Protocol
NOTA: El protocolo es adecuado para cualquier escala de expresión, por lo tanto, los volúmenes y cantidades de los reactivos deben ser escalados proporcionalmente. Un vector de expresión de mamífero adecuada debe ser utilizado para este protocolo. Aquí se utilizó un vector de expresión pcDNA 3.1 modificado que permite convenientemente la inclusión o exclusión de una etiqueta de afinidad dependiendo de la elección de las enzimas de restricción utilizados en la clonación (Figura 1). El siguiente protocolo describe un transfección a gran escala.
1. Gran Escala Cultura / La transfección en 1 L Botellas de rodillos
Crecer y mantener las células en suspensión adaptadas HEK293F de acuerdo con protocolos estándar. Típicamente cultivos iniciadores de entre 30 y 100 ml se cultivan en matraces de 250 ml de cultivo de células cónicas.
- Se siembran las células a 0,5 x 10 6 células / ml en un volumen final de 300 ml en cada frasco rotatorio 1 L.
NOTA: botellas de rodillos acomodar un mínimo de 150 ml a un máximo de300 ml de cultivo en suspensión. Para las transfecciones de mayor escala utilizar varias botellas. - Incubar durante 24 horas en un incubador agitador orbital a 37 ° C, 120 rpm, y 5% de CO 2 hasta que las células alcanzan una densidad de 1,0 x 10 6 células / ml (células deben dividir aproximadamente cada 24 h).
- Pipetear un total de 300 g de ADN esterilizada por filtración (ver método suplementario) en 30 ml de PBS y agitar vigorosamente durante 3 seg.
NOTA: Use un total de 1 g de ADN por cada millón de células transfectadas. Si dos o más plásmidos son para ser co-transfectada reducir la cantidad de cada uno de modo que la relación de ADN a las células permanece constante. - Añadir 1,2 ml de 0,5 mg / ml esterilizada por filtración PEI a la solución de PBS / ADN y agitar vigorosamente durante 3 seg.
- Incubar la mezcla a TA durante 20 min.
- Añadir el ADN / PEI mezclar a las células - que debe estar a una densidad de 1 x 10 6 células / ml (paso 1.3).
- Después de co-transfección, se incuban las célulasen un incubador agitador orbital durante un 48 horas más a 37 ° C, 120 rpm, y 5% de CO 2.
- Proteínas intracelulares de la cosecha por centrifugación las células a 3000 xg durante 5 min y almacenar el sedimento a -80 ° C.
NOTA: También puede utilizar un estándar (no-CO 2) agitación incubadora, si la atmósfera por encima de la cultura se sustituye con 5% de CO 2 y la tapa de la botella está sellada. Tendrá que ser reemplazado en cada paso (normalmente cada 2 días) la atmósfera.
2.-proteína compleja Purificación de extracto de células enteras
Este protocolo se ha optimizado para la purificación de complejos de proteínas nucleares utilizando marcado con FLAG.
- Descongelar sedimento celular en 40 ~ ml de tampón de lisis enfriado previamente (acetato de potasio 100 mM, 50 mM Tris pH 7,5, 5% de glicerol, 0,3% de Triton X-100, inhibidores de la proteasa) por l de cultivo.
- Vuelva a suspender el precipitado pipeteando arriba y abajo varias veces (para evitar la formación de espuma, no hacer vórtice). Completamente volver a suspender las células usando un homogeneizador de vidrio. Sonicar durante 3 ciclos (15 segundos, 15 segundos en off). Se centrifuga a 30.000 xg durante 25 min a 4 ° C y retener sobrenadante.
- Equilibrar 1,25 ml de anti-flag lleno de resina de agarosa por litro de cultivo por lavado tres veces con tampón de equilibrado resina (acetato de potasio 100 mM, Tris 50 mM pH 7,5).
- Incubar el extracto celular de la etapa 2.3 con la resina de afinidad en uno o más tubos de 50 ml de centrífuga y gire suavemente la muestra durante 30-120 min a 4 ° C.
- Centrifugar a 3000 xg durante 1 min a 4 ° C, el sobrenadante de descarte.
- Lavar la resina con 45 ml de tampón de pre-refrigerada 1 (acetato de potasio 100 mM, 50 mM Tris pH 7,5, 5% de glicerol, 0,3% de Triton X-100). Se centrifuga a 3.000 g durante 1 min y desechar el sobrenadante.
- Repita el paso 2.7 utilizando tampón de alta concentración de sal (acetato de potasio 300 mM, 50 mM Tris pH 7,5, glicerol al 5%), seguido por tampón de baja salinidad (acetato potásico 50 mM, Tris 50 mM pH 70,5, 5% de glicerol) y TEV división Buffer (50 mM de acetato de potasio, 50 mM Tris pH 7,5, 0,5 mM TCEP).
NOTA: Asegúrese de cada lavado es breve, es decir, suficiente para resuspender completamente la resina y no más. - Se recoge una muestra de 10 l de resina y diluir a 1 volumen de 2x tampón de carga de proteínas para el análisis (control a proteínas). No utilice agentes reductores para evitar la liberación del anticuerpo de la resina.
- Vuelva a suspender la resina en 8-10 ml de tampón enfriado previamente y la transferencia de escisión TEV a un tubo de centrífuga de 15 ml.
- Añadir ~ 40 g de la proteasa TEV (de existencias a 1 mg / ml) por litro de cultivo original y mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo varias veces.
- Reemplace atmósfera tubo con 100% gas N2 para evitar la oxidación de proteínas.
- Gire suavemente O / N a 4 ° C.
- Se centrifuga a 3.000 g durante 10 min. Transferir el sobrenadante en un filtro centrífugo de ultra con un peso molecular de corte apropiadas y concentrarhasta 500 l.
- Se recoge una muestra de 10 l de la proteína concentrada y diluir a 1 volumen de 2x tampón de carga de proteínas para el análisis. (TEV eluir control).
- Recoger una muestra de 10 l de la resina y se diluye en 1 volumen de 2x tampón de carga de proteínas para el análisis. No utilice agentes de reducción con el fin de evitar la liberación de grandes cantidades de anticuerpos a partir de la resina. (Control de resina Post-VET).
- Equilibrar la columna de cromatografía de exclusión de tamaño con tampón de filtración en gel (acetato de potasio 50 mM, 50 mM Tris pH 7,5, 0,5 mM TCEP).
- Se filtra la proteína a través de un filtro de 0,22 micras
- Cargar la muestra en la columna y recoger las fracciones.
- Ejecutar muestras de los pasos 2.9, 2.15 y 2.16 y las fracciones de filtración en gel de la etapa 2.19 en una SDS-PAGE y tinción de Coomassie para su análisis.
NOTA: Es recomendable ejecutar un SDS-PAGE de muestras de los pasos 2.9, 2.15 y 2.16 antes de la filtración en gel para confirmar la expresión de la proteína diana.
Representative Results
Aquí mostramos un 2 L (culturas 8 x 250 ml) co-transfección transitoria y purificación de la HDAC1, SDS3, Sin3A complejo ternario. HDAC1 y SDS3 interactúan con Sin3A a través del dominio de HDAC-interacción (HID) de Sin3A. Un típico rendimientos de purificación de hasta 1 mg de complejo por litro de cultivo.
Figura 1. esquemática del vector pcDNA 3.1 expresión modificada. El plásmido fue digerido con EcoRV y EcoRI para incluir la afinidad-etiqueta y TEV sitio de escisión en el extremo amino terminal de Sin3A. Para clonar versiones sin etiquetar de HDAC1 y SDS3, el vector se digirió con KpnI y EcoRI.
Figura 2. SDS-PAGE muestra la primera etapa de la purificación. El carril "proteína unida" muestra el complejo unido a la resina de afinidad. Después de la digestión TEV, la etiqueta presente en Sin3A-HID se escinde y el complejo se eluye de la resina como se muestra en las segunda y tercera carriles del gel.
Figura 3. Cromatograma de la utilización de cromatografía de exclusión por tamaño purificada-proteína compleja. Tenga en cuenta que el complejo puro se eluyó en el volumen vacío, ya que forma un dímero en solución.
Figura 4. SDS-PAGE que muestra las fracciones de la filtración en gel se muestra en la Figura 3.
Células HEK 293F teñidas de azul Figura 5. Trypan en 2.3x10 6 células / ml listos para ser transfectadas. Células sólo deben estar presentes como células individuales o en división, mientras que los grandes grupos pueden ser divididos por agitación vigorosa durante aproximadamente 25 segundos.
| Problema | Las causas posibles | Acción |
| Rendimiento baja proteína. | Bajo número de células transfectadas. | Hacer una densidad celular seguro es de aproximadamente 1,0 x 10 6 antes de añadir la mezcla de reacción de transfección a la cultura. |
| Las células podrían haber sido subcultivadas demasiadas veces. | Usar células madre nueva después de aproximadamente 90 paselas edades. | |
| ADN puede ser degradado o tienen una alta cantidad de impurezas. | Asegúrese de que el ADN plásmido se está utilizando tiene una relación de 260/280 entre 1,8 y 2,0. Ejecución del ADN en un gel de agarosa es aconsejable para evaluar su calidad. | |
| Proteína (s) que se expresa no son estables o bastante soluble. | Pruebe diferentes construcciones en pequeña escala antes de aumento de escala de las transfecciones. Asegúrese de que las etiquetas no interfieren con la estructura de la proteína (s) de interés. | |
| Las células un aspecto turbio y tienen un color y / o el olor inusual. | Las células se infectan con bacterias o levadura. | Una buena técnica estéril debe ser utilizado en todo momento. La fumigación de las campanas de flujo laminar y UV-desinfección de la sala de cultivo celular en caso de infección ayuda a contener el problema. |
| Las células tienen una baja viabilidad. | PH incorrecto en los medios de comunicación. | Asegúrese de que las culturas se hacen crecer a 8.5% de CO 2en todo momento. |
| Las células se han cultivado hasta una densidad de más de 3,0x10 6 células / ml. | Las células no deben cultivarse hasta densidades por encima de 2,5 x 10 6 células / ml inmediatamente antes de una transfección y nunca por encima de 3,0 x 10 6 células / ml. | |
| La purificación por afinidad no funcionaba | Proteína (s) no está siendo expresado. | Véase más arriba. |
| Condiciones de purificación pueden estar equivocados. | Ajuste condiciones de tampón (por ejemplo, alta concentración de sal, bajo en sal, pH.) |
Tabla 1 Solución de problemas.
| Sistema | Ventajas | Desventajas |
| E. coli |
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| P. pastoris |
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| De expresión de baculovirus en células de insecto |
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| Biorreactores con sistemas de mamíferos |
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| Células en suspensión HEK 293F |
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Cuadro 2 Ventajas y desventajas de los sistemas de expresión principal.
Discussion
Hemos desarrollado un método sencillo y eficaz de costes (PEI cuesta mucho menos que los reactivos de transfección disponibles comercialmente lipófilos) para expresar y purificar grandes cantidades de proteínas recombinantes y los complejos de múltiples subunidades a partir de células de mamíferos. Transfección óptima y eficacia de la expresión pueden ser alcanzados si el ADN plásmido de alta pureza (260/280 entre 1,8 y 2,0) se utiliza en combinación con PEI como se describe en la sección de protocolo. Las células deben cultivarse en medios sin suero y libres de antibióticos, por lo tanto, una técnica estéril es estrictamente necesario para los pases y transfectar células con el fin de evitar infecciones costosos y que consumen tiempo. La viabilidad celular debe ser de 90% o superior y culturas no deben sembrarse a densidades superiores a 2,5 x 10 6 células / ml inmediatamente antes de una transfección, ya que al hacerlo reducirá la producción de proteína. Para una transfección exitosa, sólo cultivos deben contener células individuales o en división. Los grupos pueden ser disueltas por el vigorvórtex ous de 20 a 30 segundos (Figura 5). La relación de cada plásmido utilizado en la co-transfección se puede variar por el usuario de acuerdo con la estequiometría de la ser complejo estudiado. Eficacia de la expresión puede ser optimizado para la proteína de interés, por lo que un tiempo de expresión adecuado puede ser establecida. La purificación debe realizarse manteniendo el frío muestra de proteína en todo momento para reducir el riesgo de la degradación proteolítica no deseada. La elección de las etiquetas y tampones de purificación es crítica, ya que pueden interferir con los elementos estructurales o de los sitios activos de ciertas proteínas, a menudo resultando en una reducción de la solubilidad y / o la pérdida de la actividad enzimática. Transfecciones a pequeña escala son particularmente útiles para el ensayo de diferentes construcciones para la purificación de complejos de proteínas grandes.
Hoy en día, una gran variedad de metodologías alternativas están disponibles para la expresión de proteínas eucarióticas recombinantes (Tabla 2). Por ejemplo, Baculovirus expresión en células de insecto es ampliamente utilizado debido a su alta eficacia de transducción y su falta de citotoxicidad en comparación con otras especies virales 6. Sin embargo, el proceso de hacer el virus es mucho tiempo y su inestabilidad no permite que el virus se puede almacenar durante largos períodos. Por otro lado, los sistemas de expresión de levadura ofrecen la posibilidad de crecer las células a densidades muy altas en cultivos de fermentación, resultando en altos rendimientos de proteína 7. Pero todavía carecen de la variedad completa de modificaciones post-traduccionales requeridas para proteínas eucarióticas para plegar correctamente e interactuar con sus compañeros de la proteína. HDAC3, por ejemplo, se expresa pero no se pliega en E. coli. Sin embargo, cuando se expresa en células 293F, hemos sido capaces de purificar una enzima activa en el complejo con su co-represor (SMRT) y una molécula de inositol tetrafosfato (IP4) 8, que no se encuentra en las células procariotas. Este método también nos ha permitido depurar y resolver el cristal structure de HDAC1 interactuar con MTA1 en el complejo NuRD, que se activa de manera similar por IP4 9. Idealmente, quisiéramos siempre para expresar proteínas eucariotas en su entorno natural, fisiológico. Sistemas de expresión de mamíferos que emplean células HEK 293-EBNA1 en biorreactores 10-12 se han descrito y producir niveles muy altos de proteína, pero estos pueden ser difíciles de usar.
Nuestro método es una alternativa sencilla y accesible para los sistemas de expresión en bacterias, levaduras y biorreactor. El método de expresión es rápido y no requiere el uso de equipo costoso, particularmente si la atmósfera botella rodillo o matraz se reemplazó con 5% de CO 2 y se utilizan incubadoras sacuden estándar. Hemos utilizado estos protocolos para co-transfectar múltiples plásmidos y purificar complejos con hasta cinco proteínas con rendimientos de> 1 mg / l de cultivo. Curiosamente, el sistema ayuda a la identificación de los complejos de buen comportamiento estables. Por ejemplo, excompresión del complejo binario de HDAC1 y Sin3A dio rendimientos limitadas de proteínas, sin embargo, además de SDS3 dio lugar a 5 veces mayores cantidades y por lo tanto dirige el biólogo estructural en la elección de construcciones adecuadas y complejos estables para la cristalización.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer al Dr. Xiaowen Yang (servicio de clonación Protex) para la preparación de las construcciones de expresión utilizados para este trabajo y de la Universidad de Leicester Core Services Biotecnología. Este trabajo fue apoyado por una beca BBSRC, el Programa de Wellcome Trust y subvenciones investigador principal WT085408 y WT100237 y BBSRC conceden RM31G0224.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle HEK 293F cells | LifeTechnologies | R790-07 | |
| FreeStyle 293 Expression Medium | LifeTechnologies | 12338-018 | |
| Anti-FLAG M2 Affinity Gel | SIGMA | A220 | |
| 250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning | 431144 | |
| Roller bottles with vented caps | Corning | 01836-02 | |
| Polyethylenimine, 25 kDa, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 - 4ºC |
| Mammalian expression vector | |||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Amicon | UFC30GV00 | |
| 15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off) | Amicon | UFC901008 | |
| Superdex 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17-5175-01 |
References
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