Introduction
Стремительный прогресс биологии молекулярной клеточной и постоянная потребность в улучшенных препаратов в медицине создал необходимость структурных биологи смотреть на все более сложных белковых структур. Они могут часто требуют особых пост-трансляционных модификаций, молекулярные сопровождающих и ко-факторов, чтобы поддержать их сложную укладку и ферментативную активность. В то время как подавляющее большинство структур, присутствующих в белке банка данных были получены с использованием бактериальных систем экспрессии, прокариоты не могут выполнять большое количество этих модификаций и имеют много существенных эукариотических ко-факторов. Это может быть проблемой для изучения крупных мульти-субъединицы комплексов, которые активируются малыми сигнальных молекул, а также для атомной, клеточной поверхности и секретируемых белков, которые требуют сложных складные механизмы. Ряд Е. штаммы кишечной палочки были разработаны с целью преодоления некоторых из этих ограничений 1. В последние годы, однако, использование мammalian системы экспрессии растет, потому что они надежно производить эукариотических белков, которые в противном случае проблематично выразить в других системах 2. В настоящее время можно получить стабильные и переходные млекопитающих экспрессию клеточных линий с помощью различных методов, которые варьируются от вирусной трансдукции к химическому-опосредованной трансфекции, физическое передачи генов, таких как электропорация и непосредственным впрыском 3. В то время как все эти методы имеют свой собственный набор преимуществ и недостатков, лишь немногие из них подходят для структурных исследований, являющихся либо слишком дорого, и / или времени.
Здесь мы опишем очень простой, быстрый, недорогой, но очень эффективный способ для выражения белковых комплексов для структурной биологии в подвесных выросли клетках млекопитающих. Подход использует переходный котрансфекции в эмбриональной почки человека (НЕК) клеточной линии (например, Freestyle НЕК 293F клеток). Эти клетки были получены из НЕК 293 CELL линия, приспособлены расти в суспензионных культур, достигнув высоких плотностей с помощью сыворотки среде (например, FreeStyle 293 Expression среды). Затем клетки трансфицированы с помощью разветвленной версию полиэтиленимином (PEI), недорогой полимерный реагент, который, как сообщается, работает для большого диапазона клетках млекопитающих 4 путем формирования ДНК / PEI комплексы, которые входят в клетку-хозяина эндоцитозом 5. Этот метод подходит как для малых масштабах (30 мл) и крупномасштабных (до 300 мл) эксперименты и может производить высокие уровни очищенных белковых комплексов. Это особенно полезно для изучения белков, которые требуют сложных механизмов складывания, ко-факторов или особых посттрансляционных модификаций, которые не могут быть выполнены с помощью бактерий, дрожжей и клеток насекомых.
В этом протоколе приведены экспрессию и очистку белка трех центральной строительные леса от Sin3A транскрипционной репрессии комплекса. Он состоит из гистоновДезацетилазы 1 (HDAC1), подавитель дефектных глушителей 3 (SDS3) и Switch-независимый 3 (Sin3A). Очищенный комплекс используется для испытаний кристаллизации с высокой пропускной способностью.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол подходит для любого масштаба выражения, поэтому объемы и количества реагентов должны быть расширены пропорционально. Подходящий экспрессирующий вектор млекопитающего, должны быть использованы для этого протокола. Здесь мы использовали модифицированный pcDNA 3,1 вектор экспрессии, что удобно позволяет включение или исключение аффинной метки в зависимости от выбора ферментов рестрикции, используемые в клонировании (Рисунок 1). Следующий протокол описывает масштабную трансфекции.
1 Крупномасштабная Культура / Трансфекцию в 1 л роллер-флаконах
Расти и поддерживать HEK293F подвески адаптированных клеток в соответствии со стандартными протоколами. Как правило закваски от 30 до 100 мл, выращивают в 250 мл конические колбы культур клеток.
- Семенной клеток при 0,5 × 10 6 клеток / мл в конечном объеме 300 мл в 1 л каждого ролика бутылки.
Примечание: роллер-флаконах вместить как минимум 150 мл максимум300 мл суспензионной культуре. Для более крупных трансфекций использовать несколько бутылок. - Выдержите в течение 24 часов в орбитальном шейкере инкубаторе при температуре 37 ° С, 120 оборотов в минуту, и 5% СО 2, пока клетки достижения плотности 1,0 х 10 6 клеток / мл (клетки должны разделить примерно каждые 24 ч).
- Пипетировать в общей сложности 300 мкг стерилизованным фильтрацией ДНК (см дополнительный метод) в 30 мл PBS и вихря энергично в течение 3 сек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте в общей сложности 1 мкг ДНК на миллион трансфекции клеток. Если два или более плазмиды будут совместно трансфицируют уменьшить количество каждого так, что отношение к ДНК клеток остается постоянным. - Добавить 1,2 мл 0,5 мг / мл стерилизованным фильтрацией PEI в растворе PBS / ДНК и вихря энергично в течение 3 сек.
- Инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 20 мин.
- Добавить ДНК / ПЭИ смешать с клетками, - которые должны быть при плотности 1 × 10 6 клеток / мл (этап 1.3).
- После котрансфекции, инкубировать клеткив орбитальном шейкере инкубаторе в течение еще 48 ч при 37 ° С, 120 оборотов в минуту, и 5% СО 2.
- Урожай внутриклеточные белки клетки центрифугированием при 3000 х г в течение 5 мин и сохранить гранулу при -80 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, использовать стандарт (помимо СО 2) инкубатора, если над культуры атмосфера заменяется 5% CO 2 и крышка бутылки запечатана. Атмосфера должны быть заменены на каждом проходе (обычно через каждые 2 дня).
2 Белки-комплекс Очистка от полного клеточного экстракта
Этот протокол оптимизирован для очистки ядерных комплексов с использованием флага-меченных белков.
- Размораживание осадок клеток в ~ 40 мл предварительно охлажденного буфера для лизиса (100 мМ ацетат калия, 50 мМ Трис, рН 7,5, 5% глицерин, 0,3% Тритон Х-100, ингибиторы протеаз) в л культуры.
- Re приостановить гранул с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз (чтобы избежать вспенивания, не вихрь). Тщательно повторно приостанавливать клеток с использованием стеклянного гомогенизатора. Разрушать ультразвуком в течение 3 циклов (15 секунд на, 15 с не горит). Центрифуга при 30000 мкг в течение 25 мин при 4 ° С и сохраняют супернатант.
- Равновесие 1,25 мл анти-флага упакованы в агарозном смолы на литр культуры путем трехкратной промывки смолы уравновешивающим буфером (100 мМ ацетат калия, 50 мМ Трис, рН 7,5).
- Инкубируют экстракт целой клетки с шагом 2,3 с аффинной смолой в одном или более 50 мл центрифужные пробирки и осторожно повернуть образец для 30-120 мин при 4 ° С.
- Центрифуга при 3000 мкг в течение 1 мин при 4 ° С, отбросить супернатант.
- Промыть смолы с 45 мл предварительно охлажденного буфера 1 (100 мМ ацетат калия, 50 мМ Трис, рН 7,5, 5% глицерин, 0,3% Тритон Х-100). Центрифуге при 3000 х г в течение 1 мин и отбросить супернатант.
- Повторите шаг 2,7 с помощью высокой буферной соли (300 мМ ацетат калия, 50 мМ Трис, рН 7,5, 5% глицерин), а затем с низким содержанием соли буфере (50 мМ ацетата калия, 50 мМ Трис, рН 70,5, 5% глицерин) и ТРВ Расщепление буфера (50 мМ ацетат калия, 50 мМ Трис, рН 7,5, 0,5 мМ ТСЕР).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, каждый мытье кратко т.е. достаточно, чтобы полностью повторно приостанавливать смолы и больше не. - Соберите 10 мкл образец смолы и развести в 1 объеме 2x загрузки белок буфера для анализа (связан управления белок). Не следует использовать восстанавливающие агенты, с тем чтобы избежать отпускания антитела из смолы.
- Повторное приостановить смолы в 8-10 мл предварительно охлажденного буфера и передачи ТРВ расщепления в 15 мл центрифужную пробирку.
- Добавить ~ 40 мкг TEV протеазы (со склада в 1 мг / мл) на L самобытной культуры и хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз.
- Заменить атмосферу трубки с 100% N 2 газа для предотвращения окисления белков.
- Плавно поворачивайте O / N в 4 °.
- Центрифуге при 3000 х г в течение 10 мин. Передача супернатант в ультра центробежным фильтром с соответствующим молекулярным весом отсечки и сосредоточитьсядо 500 мкл.
- Соберите 10 мкл пробы концентрированного белка и развести в 1 объеме 2x загрузки белок буфера для анализа. (ТРВ элюата контроль).
- Сбор 10 мкл образца смолы и разбавленной в 1 объеме 2x загрузки белок буфере для анализа. Не следует использовать восстанавливающими агентами для того, чтобы избежать больших количествах выпускать антитела из смолы. (Post-ТРВ контроль смолы).
- Равновесие колоночной хроматографии с гель-гель-фильтрационной буфере (50 мМ ацетат калия, 50 мМ Трис, рН 7,5, 0,5 мМ TCEP).
- Фильтр белка через 0,22 мкм фильтр
- Загрузите образец в колонке и собирать фракции.
- Запуск образцы из шагов 2.9, 2,15 и 2,16 и фракций гель-фильтрации с шагом 2,19 на SDS-PAGE и Coomassie пятно для анализа.
Примечание: Желательно, чтобы запустить SDS-PAGE образцов из шагов 2,9, 2,15 и 2,16 до гель фильтрации, чтобы подтвердить экспрессию белка-мишени.
Representative Results
Здесь показано, 2 л (8 х 250 мл культуры) переходных ко-трансфекции и очистку HDAC1, SDS3, Sin3A тройного комплекса. HDAC1 и SDS3 взаимодействовать с Sin3A через домен ГДАЦ-взаимодействия (HID) из Sin3A. Типичные выходы очистки до 1 мг комплекса на литр культуры.
Рисунок 1 Схема модифицированного вектора экспрессии pcDNA 3.1. Плазмиду расщепл ли EcoRV и EcoRI, чтобы включать в себя аффинной метки и сайт расщепления TEV на амино-конце Sin3A. Чтобы клонировать немаркированные версии HDAC1 и SDS3, вектор переваривают с KpnI и EcoRI.
Рисунок 2 SDS-PAGE показывая первый шаг очистки. "Связанный белок" пер показывает комплекс связанный с аффинной смолы. После TEV пищеварения, тэг присутствует на Sin3A-HID отщепляется и комплекс элюируют из смолы, как показано на второй и третьей полос в геле.
Рисунок 3 Хроматограмма белка комплекса очищали с помощью гель-проникающей хроматографии. Следует отметить, что чистый комплекс элюировали в свободном объеме, потому что он образует димер в растворе.
Рисунок 4 SDS-PAGE с указанием фракций гель-фильтрации, показанного на фиг.3.
Рисунок 5 трипановый синий окрашенных НЕК 293F клетки в 2.3x10 6 клеток / мл, готовые для трансфекции. Клетки должны присутствовать только в виде единичных или делящихся клеток, в то время как крупные кластеры могут быть разбиты энергичным встряхиванием в течение примерно 25 сек.
| Задача | Возможные причины | Действие |
| Низкий выход белка. | Малое количество клеток трансфецировали. | Убедитесь, что плотность клеток составляет примерно 1,0 · 10 6 перед добавлением реакционной смеси к трансфекции культуры. |
| Клетки можно было бы субкультивировали слишком много раз. | Используйте свежие акции клетки после примерно 90 проходвозрастов. | |
| ДНК может быть снижено или имеют высокое количество примесей. | Убедитесь, что ДНК плазмиды используются имеет отношение 260/280 между 1,8 и 2,0. Запуск ДНК в агарозном геле Желательно, чтобы оценить его качество. | |
| Белок (ы) выражается не являются стабильными или недостаточно растворимы. | Проверьте различные конструкции в малом масштабе До расширения масштабов Трансфекции. Убедитесь, что теги не вмешиваться в структуре белка (ов), представляющие интерес. | |
| Клетки выглядят облачно и имеют необычный цвет и / или запах. | Клетки заражены бактериями или дрожжами. | Хорошо стерильных должны использоваться во все времена. Окуриватели капюшоны ламинарного потока и УФ-обеззараживания комнату культуре клеток в случае заражения помогает, содержащий проблему. |
| Клетки имеют низкую жизнеспособность. | Неправильный рН в средствах массовой информации. | Убедитесь культуры выращиваются на 5-8% CO 2в любое время. |
| Клетки культивировали до плотности более 3.0x10 6 клеток / мл. | Клетки не должны быть выращены до плотности выше 2,5 х 10 6 клеток / мл непосредственно перед трансфекции и никогда выше 3,0 х 10 6 клеток / мл. | |
| Affinity очистки не работает | Белки (ы) не выражается. | Смотрите выше. |
| Условия очистки может быть неправильным. | Отрегулируйте условия буфер (например, с высоким содержанием соли, с низким содержанием соли, рН.) |
Таблица 1 Устранение неполадок.
| Система | Преимущества | Недостатки |
| Кишечная палочка |
|
|
| П. pastoris |
|
|
| Бакуловируса экспрессии в клетках насекомых |
|
|
| Биореакторы с системами млекопитающих |
|
|
| НЕК 293F подвески клетки |
|
|
Таблица 2 Преимущества и недостатки основных систем экспрессии.
Discussion
Мы разработали простой и экономически эффективный способ (ПЭИ стоит значительно меньше, чем коммерчески доступных реагентов трансфекции липофильных) для выражения и очистки больших количеств рекомбинантных белков и мульти-субъединицы комплексов из клеток млекопитающих. Оптимальное трансфекции и эффективность экспрессии могут быть достигнуты, если особо чистой плазмидной ДНК (260/280 между 1,8 и 2,0) используется в комбинации с ПЭИ, как описано в разделе протокола. Клетки должны быть культивированы в serum- и антибиотиков, свободной от средств массовой информации, таким образом, стерильных строго необходимое для пассирования и трансфекции клеток для того, чтобы избежать дорогостоящих и трудоемких инфекции. Жизнеспособность клеток должно быть 90% или выше и культуры не должны быть выращены в концентрации, превышающей 2,5 х 10 6 клеток / мл непосредственно перед трансфекции, так как это уменьшит выход белка. Для успешного трансфекции культуры должны содержать только один или делящиеся клетки. Кластеры могут быть разрушены силойПодразделения вихревание 20 до 30 сек (рисунок 5). Отношение каждой плазмиды, используемой в ко-трансфекции может быть изменена пользователем в соответствии с стехиометрии комплекса изучается. Эффективность экспрессии может быть оптимизирована для белка, представляющего интерес, так что подходящее время выражение может быть установлена. Очистка должна быть выполнена сохраняя образец белка холод в любой момент времени, чтобы снизить риск нежелательного протеолитической деградации. Выбор меток и буферов очистки имеет решающее значение, так как они могут мешать структурных элементов или активных центров некоторых белков, часто приводит к снижению растворимости и / или потере ферментативной активности. Масштабные трансфекции Небольшие особенно полезны для тестирования различных конструкций для очистки больших белковых комплексов.
В настоящее время большое разнообразие альтернативных методик доступны для экспрессии рекомбинантных белков эукариот (таблица 2). Например, Baculoviрус экспрессии в клетках насекомых широко используется благодаря своей высокой эффективности трансдукции и ее отсутствие цитотоксичности по сравнению с другими видами вирусных 6. Тем не менее, процесс создания вирус является трудоемким и его нестабильность не позволяет вирусу храниться в течение длительных периодов. С другой стороны, системы экспрессии дрожжей дают возможность выращивания клеток до очень высоких плотностей в ферментере культур, в результате чего с высокими выходами белковых 7. Но они все еще не имеют полный спектр посттрансляционных модификаций, необходимых для эукариотических белков правильно сложить и взаимодействовать с их партнерами белка. HDAC3, например, выражается, но не раза в E. палочка. Тем не менее, при экспрессии в клетках 293F, мы смогли очистить активный фермент в комплексе с его корепрессор (SMRT) и молекулы инозитол тетрафосфат (IP4) 8, который не нашел в прокариотических клетках. Этот метод также позволяет нам очистить и решить кристалл улructure из HDAC1 взаимодействуя с mta1 в NuRD комплекса, который аналогичным образом активируется IP4 9. В идеале, мы всегда хотели бы выразить эукариотических белков в их естественной, физиологической среде. Системы экспрессии млекопитающих, использующие НЕК 293-EBNA1 клеток в биореакторах 10-12 были описаны и дают очень высокие уровни белка, но они могут быть сложными в использовании.
Наш метод является простым и доступным альтернативой экспрессии в бактериях, дрожжах и биореактора систем. Способ выражение быстро и не требует использования дорогостоящего оборудования, в частности, если атмосфера роллер-флакон или колбу заменяется с 5% СО 2 и стандартные Автоклавы используются. Мы использовали эти протоколы со-трансфекции плазмиды несколько комплексов и очистить до пяти белков с выходами> 1 мг / л культуры. Интересно, что система помогает выявить устойчивые хорошо себя комплексов. Например, эксPression бинарного комплекса HDAC1 и Sin3A дали ограниченные выходы белка, но добавление SDS3 привело к 5-кратное увеличение количества и, следовательно, ведет структурную биолог в выборе подходящих конструкций и стабильных комплексов для кристаллизации.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Xiaowen Ян (PROTEX клонирование службы) за подготовку экспрессирующие конструкции, используемые для этой работы и Университета Лестера Основные биотехнологии служб. Эта работа была поддержана студенчества BBSRC, Целевой программы Wellcome и старших гранты Следователь WT085408 & WT100237 и BBSRC предоставить RM31G0224.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle HEK 293F cells | LifeTechnologies | R790-07 | |
| FreeStyle 293 Expression Medium | LifeTechnologies | 12338-018 | |
| Anti-FLAG M2 Affinity Gel | SIGMA | A220 | |
| 250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning | 431144 | |
| Roller bottles with vented caps | Corning | 01836-02 | |
| Polyethylenimine, 25 kDa, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 - 4ºC |
| Mammalian expression vector | |||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Amicon | UFC30GV00 | |
| 15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off) | Amicon | UFC901008 | |
| Superdex 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17-5175-01 |
References
- Baneyx, F.
- Aricescu, A. R., Owens, R. J. Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology. Current opinion in structural biology. 23 (3), 345-356 (2013).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Boussif, O., Zanta, M. A., Behr, J. P. Optimized galenics improve in vitro gene transfer with cationic molecules up to 1000-fold. Gene therapy. 3 (12), 1074-1080 (1996).
- Godbey, W. T., Wu, K. K., Mikos, A. G. Poly (ethylenimine) and its role in gene delivery. Journal of Controlled Release. 60 ((2-3)), 149-160 (1999).
- Beljelarskaya, S. N. Baculovirus expression systems for production of recombinant proteins in insect and mammalian cells. Molecular Biology. 45 (1), 123-138 (2011).
- Cregg, J. M., Vedvick, T. S., Raschke, W. C. Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris. Nature Biotechnology. 11 (8), 905-910 (1993).
- Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. R. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate. Nature. 481 (7381), 335-340 (2013).
- Millard, C. J., Watson, P. J., et al. Class I HDACs Share a Common Mechanism of Regulation by Inositol Phosphates. Molecular Cell. 51 (1), 57-67 (2013).
- Tom, R., Bisson, L., Durocher, Y. Transfection of HEK293-EBNA1 Cells in Suspension with Linear PEI for Production of Recombinant Proteins. CSH protocols. , pdb.prot4977 (2008).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Research. 30 (2), (2002).
- Baldi, L., Muller, N., et al. Transient Gene Expression in Suspension HEK‐293 Cells: Application to Large‐Scale Protein Production. Biotechnology Progress. 21 (1), 148-153 (2005).
