Introduction
O rápido progresso da biologia celular e molecular a necessidade constante de drogas melhorou em medicina criou uma necessidade para os biólogos estruturais de olhar para estruturas de proteínas cada vez mais complexos. Estas muitas vezes podem exigir determinadas modificações pós-traducionais, chaperones moleculares e co-fatores para apoiar a sua dobradura elaborado e atividade enzimática. Embora a grande maioria das estruturas presentes no Protein Data Bank foram obtidos usando os sistemas de expressão bacterianos, procariotas são incapazes de realizar um grande número de modificações e estas não têm muitos co-factores essenciais eucarióticas. Isto pode ser um problema para o estudo de grandes complexos de multi-subunidades que são activados por pequenas moléculas de sinalização, bem como para nuclear, da superfície da célula e as proteínas segregadas que requerem mecanismos de dobragem elaborados. Um número de E. coli foram projetados para superar algumas destas limitações 1. Nos últimos anos, no entanto, a utilização de msistemas de expressão ammalian tem vindo a aumentar, porque eles produzem de forma confiável proteínas eucarióticas que são de outra problemática para expressar em outros sistemas 2. Hoje em dia, é possível obter linhas celulares estáveis de mamífero e expressão transitória por meio de uma variedade de técnicas que vão desde a transdução virai da transfecção mediada por produto químico, o gene de transferência física, tais como electroporação e injecção directa 3. Apesar de todos esses métodos têm o seu próprio conjunto de vantagens e desvantagens, apenas alguns deles são adequados para estudos estruturais serem muito caros e / ou demorado.
Aqui nós descrevemos um método muito simples, rápido, de baixo custo, mas altamente eficiente para expressar complexos de proteínas para a biologia estrutural na suspensão crescido células de mamíferos. A abordagem utiliza transientes de co-transfecção de uma linha de rim embrionário humano (HEK) célula (por exemplo, células HEK 293F Livres). Estas células foram derivadas da ce HEK 293linha ll, estão adaptadas a crescer em culturas de suspensão, atingindo altas densidades utilizando meio isento de soro (por exemplo, 293 Freestyle Expressão Médio). As células são então transfectadas transitoriamente utilizando uma versão ramificada de polietilenimina (PEI), um reagente polimérico de baixo custo que tem sido relatado para funcionar para uma grande variedade de células de mamíferos 4, formando complexos ADN / PEI que entram na célula hospedeira por endocitose 5. Este método é adequado tanto para pequena escala (30 ml) e em larga escala (até 300 ml) e as experiências podem produzir níveis elevados de complexos de proteínas purificadas. É particularmente útil para o estudo de proteínas que requerem mecanismos de dobragem complexo, co-factores ou particulares de modificações pós-tradução que não pode ser realizada por bactérias, leveduras e células de insectos.
Neste protocolo, apresentam a expressão e purificação do andaime central de três proteínas do complexo de repressão transcricional Sin3A. Este consiste de histonaDeacetylase 1 (HDAC1), supressor defeituoso de silenciamento 3 (SDS3) e Switch-independente 3 (Sin3A). O complexo purificado é utilizado para ensaios de cristalização de alto rendimento.
Protocol
NOTA: O protocolo é adequado para qualquer escala de expressão, por conseguinte, os volumes e as quantidades dos reagentes deve ser dimensionado proporcionalmente. Um vector de expressão adequado de mamífero podem ser utilizados para este protocolo. Aqui utilizou-se uma modificação de pcDNA 3,1 vector de expressão que permite convenientemente a inclusão ou exclusão de um marcador de afinidade de acordo com a escolha das enzimas de restrição utilizados na clonagem (Figura 1). O protocolo seguinte descreve um transfecção grande escala.
1 Large Scale Cultura / transfecção em 1 L frascos cilíndricos
Crescer e manter as células adaptaram-HEK293F suspensão de acordo com protocolos padrão. Tipicamente, as culturas de arranque, entre 30 e 100 ml são cultivadas em balões de 250 ml de cultura de células cónicas.
- Células de sementeira em 0.5 x 10 6 células / ml para um volume final de 300 ml em cada frasco rolante 1 L.
NOTA: frascos rolantes acomodar um mínimo de 150 ml até um máximo de300 ml de cultura em suspensão. Para transfections maior escala usar várias garrafas. - Incubar durante 24 horas num incubador agitador orbital a 37 ° C, 120 rpm, e 5% de CO2, até atingir uma densidade de células de 1,0 x 10 6 células / ml (células devem dividir aproximadamente a cada 24 h).
- Pipetar um total de 300 ug de ADN, esterilizada por filtração (ver método suplementar) em 30 ml de PBS e vortex vigorosamente durante 3 seg.
NOTA: É um total de 1 ug de DNA por milh de culas transfectadas. Se dois ou mais plasmídeos são para ser co-transfectadas reduzir a quantidade de cada um de modo a que a proporção de ADN para células permanece constante. - Adicionar 1,2 ml de 0,5 mg / ml filtrar esterilizado PEI para a solução de PBS / ADN e vortex vigorosamente durante 3 seg.
- Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 20 min.
- Adicionar o ADN / PEI misturar com as células - que devem estar a uma densidade de 1 x 10 6 células / ml (passo 1.3).
- Após a co-transfecção, as células incubarnum incubador agitador orbital durante mais 48 horas a 37 ° C, 120 rpm, e 5% de CO 2.
- Proteínas intracelulares da colheita por centrifugação as células a 3000 xg durante 5 min e armazenar o sedimento a -80 ° C.
NOTA: Como alternativa, usar um padrão (não-CO 2) agitação da incubadora, quando a atmosfera acima da cultura é substituído com 5% de CO 2 e a tampa do frasco é selado. A atmosfera terá de ser substituída, em cada passagem (normalmente a cada 2 dias).
2.-Protein complexo purificação do extrato de células inteiras
Este protocolo é otimizado para a purificação de complexos nucleares que utilizam proteínas marcadas no pavilhão.
- Descongelar sedimento celular em ~ 40 ml de tampão de lise de pré-gelada (100 mM de acetato de potássio, 50 mM Tris pH 7,5, 5% de glicerol, 0,3% Triton X-100, os inibidores de protease) por l de cultura.
- Re-suspender o pellet pipetando para cima e para baixo várias vezes (para evitar a formação de espuma, não vórtice). Exaustivamente re-suspender as células utilizando um homogeneizador de vidro. Sonicar por 3 ciclos (15 seg, 15 seg em off). Centrifugar a 30.000 xg por 25 min a 4 ° C e manter sobrenadante.
- Equilibrar 1,25 ml de anti-bandeira embalado resina de agarose por litro de cultura por lavagem três vezes com tampão de equilibração de resina (de acetato de potássio 100 mM, Tris 50 mM, pH 7,5).
- Incubar o extracto de células inteiras a partir do passo 2.3 com a resina de afinidade, em um ou mais tubos de centrífuga de 50 ml e cuidadosamente girar a amostra durante 30-120 min a 4 ° C.
- Centrifugar a 3.000 xg durante 1 min a 4 ° C, o sobrenadante de descarte.
- Lava-se a resina com 45 ml de tampão de pré-refrigerada 1 (100 mM de acetato de potássio, 50 mM Tris pH 7,5, 5% de glicerol, 0,3% Triton X-100). Centrifugar a 3000 xg por 1 min e elimine o sobrenadante.
- Repetir o passo 2.7, utilizando tampão de alto teor salino (300 mM de acetato de potássio, 50 mM Tris pH 7,5, glicerol a 5%), seguido de tampão de baixa salinidade (50 mM de acetato de potássio, 50 mM Tris pH 70,5, glicerol a 5%) e Tampão de Clivagem TEV (50 mM de acetato de potássio, 50 mM Tris pH 7,5, TCEP 0,5 mM).
NOTA: Certifique-se de cada lavagem é breve ou seja, suficiente para totalmente re-suspender a resina, e não mais. - Coletar uma amostra de 10 mL de resina e diluir em um volume de tampão de carga de proteína 2x para análise (controle de proteínas). Não utilizar agentes redutores, para evitar a libertação de anticorpo a partir da resina.
- Re-suspender a resina em 8-10 ml de tampão de clivagem de TEV pré-refrigerado e transferência para um tubo de centrífuga de 15 ml.
- Adicionar ~ 40 ug de protease TEV (a partir de estoque de 1 mg / ml) por l de cultura original e misturar bem por pipetagem para cima e para baixo várias vezes.
- Substituir tubo atmosfera com 100% de gás N2 para evitar a oxidação da proteína.
- Delicadamente gire O / N a 4oC.
- Centrifugar a 3000 xg durante 10 min. Transferir o sobrenadante para um filtro de ultra-centrifugação com um peso molecular de corte adequado e concentraraté 500 ul.
- Recolher uma amostra de 10 ul da proteína concentrada e diluída em 1 volume de tampão de carga de proteína 2x para análise. (TEV controle eluato).
- Recolher uma amostra de 10 ul da resina e dilua em 1 volume de tampão de carga de proteína 2x para análise. Não utilizar agentes de redução, a fim de evitar a libertação de grandes quantidades de anticorpos a partir da resina. (Controle de resina pós-TEV).
- Equilibrar a coluna de cromatografia de exclusão de tamanho com tampão de filtração em gel (acetato de potássio 50 mM, 50 mM Tris pH 7,5, TCEP 0,5 mM).
- Filtra-se a proteína através de um filtro de 0,22 um
- Coloque a amostra na coluna e recolher as frações.
- Amostras executado a partir de passos 2.9, 2.15 e 2.16 e as fracções de filtração gel de passo 2,19 em um SDS-PAGE e Coomassie mancha para análise.
NOTA: É aconselhável correr um gel de SDS-PAGE de amostras de passos de 2,9, 2,15 e 2,16 antes da filtração em gel para confirmar a expressão da proteína alvo.
Representative Results
Aqui mostramos de 2 L (8 x 250 ml culturas) transiente de co-transfecção e a purificação da HDAC1, SDS3, complexo ternário Sin3A. HDAC1 e SDS3 interagir com Sin3A através do domínio HDAC-interação (HID) de Sin3A. Um rendimento típico de purificação superior a 1 mg de complexo por litro de cultura.
Figura 1 Representação esquemática do vector de expressão pcDNA 3.1 modificado. O plasmídeo foi digerido com EcoRV e EcoRI de modo a incluir o marcador de afinidade e o local de clivagem de TEV no terminal amino de Sin3A. Para clonar as versões não marcados de HDAC1 e SDS3, o vector foi digerido com Kpnl e EcoRI.
Figura 2. SDS-PAGE mostra a primeira fase de purificação. A pista "proteína ligada" mostra o complexo ligado à resina de afinidade. Após a digestão de TEV, o marcador presente na Sin3A-HID é clivada e o complexo é eluída a partir da resina, como mostrado no segundo e terceiro pistas do gel.
Figura 3: Cromatograma de cromatografia de exclusão de tamanho utilizando proteína purificada do complexo. Note-se que o complexo puro eluído no volume vazio porque forma um dímero em solução.
Figura 4 mostra SDS-PAGE das fracções da filtração em gel mostrado na Figura 3.
Figura 5 tripano células HEK 293F coradas de azul em 2.3x10 6 células / mL prontas para serem transfectados. Células só devem estar presentes na forma de células individuais ou divididas, enquanto grandes aglomerados pode ser cindida por vórtice vigoroso durante aproximadamente 25 seg.
| Problema | Possíveis causas | Ação |
| Rendimento de proteína baixa. | Baixo número de células transfectadas. | Certifique-se a densidade das células é de aproximadamente 1,0 x 10 6 antes da adição da mistura de reacção para a transfecção da cultura. |
| As células podem ter sido subcultivadas demasiadas vezes. | Use células-mãe fresca após aproximadamente 90 passeas idades. | |
| O ADN pode ser degradado ou ter uma grande quantidade de impurezas. | Certifique-se o ADN de plasmídeo a ser usado tem uma proporção de 260/280 entre 1,8 e 2,0. Executando o ADN num gel de agarose é aconselhável para avaliar a sua qualidade. | |
| Proteína (s) a ser expresso não são estáveis ou solúveis suficiente. | Teste diferentes construções em pequena escala antes de up-scaling as transfections. Certificar-se que as etiquetas não interfiram com a estrutura da proteína (s) de interesse. | |
| Células olhar turvo e ter uma cor e / ou cheiro estranho. | As células são infectadas com bactérias ou leveduras. | Boa técnica de esterilização deve ser utilizado em todos os momentos. Fumigating as capelas de fluxo laminar e UV-desinfecção sala de cultura celular em caso de infecção ajuda contendo o problema. |
| As células têm baixa viabilidade. | PH errado na mídia. | Certifique-se que as culturas são cultivadas em 5-8% de CO 2em todos os momentos. |
| As células foram cultivadas até uma densidade de mais de 3,0x10 6 células / ml. | As células não devem ser cultivadas até densidades acima de 2,5 x 10 6 células / ml, imediatamente antes de uma transfecção e nunca acima de 3,0 x 10 6 células / ml. | |
| A purificação por afinidade não funcionou | Proteína (s) não está a ser expressa. | Veja acima. |
| Condições de purificação pode estar errado. | Ajustar as condições de tampão (por exemplo, sal elevado, de baixa concentração salina, pH). |
Tabela 1 Solução de problemas.
| Sistema | Vantagens | Desvantagens |
| E. coli |
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| P. pastoris |
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| De expressão de baculovírus em células de insecto |
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| Biorreactores com sistemas de mamífero |
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| As células em suspensão HEK 293F |
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Tabela 2. vantagens e desvantagens dos sistemas de expressão principais.
Discussion
Desenvolvemos um método eficaz e simples de custo (PEI custa muito menos do que os reagentes de transfecção disponíveis comercialmente lipófilos) para a expressão e purificação de grandes quantidades de proteínas recombinantes e os complexos de múltiplas subunidades a partir de células de mamíferos. Transfecção óptima e a eficiência de expressão pode ser alcançada se o DNA de plasmídeo muito puro (260/280 entre 1,8 e 2,0), é usado em combinação com PEI como descrito na secção de protocolo. As células devem ser cultivadas em meios sérica e sem antibiótico, por conseguinte, uma técnica estéril é estritamente necessária para a passagem em células de transfecção e para evitar infecções dispendiosas e demoradas. A viabilidade das células deve ser de 90% ou superior, e as culturas não devem ser cultivadas a densidades superiores a 2,5 x 10 6 células / ml, imediatamente antes de uma transfecção, pois isso irá reduzir o rendimento de proteína. Para a transfecção de sucesso, culturas deve conter apenas uma única célula ou divisão. Clusters podem ser quebrados pelo vigorous vórtex de 20 a 30 segundos (Figura 5). A proporção de cada um plasmídeo utilizado na co-transfecção pode ser variado pelo utilizador de acordo com a estequiometria do complexo ser estudado. A eficiência de expressão pode ser optimizado para a proteína de interesse, de modo que um tempo de expressão adequado pode ser estabelecida. A purificação devem ser realizadas mantendo a amostra fria proteína em todos os momentos para reduzir o risco de degradação proteolítica não desejado. A escolha de marcas e memórias intermédias de purificação é crítica, uma vez que podem interferir com os elementos estruturais ou locais activos de determinadas proteínas, resultando muitas vezes na solubilidade e / ou a perda de actividade enzimática reduzida. Transfecções pequena escala são particularmente úteis para testar diferentes construções para a purificação de grandes complexos de proteínas.
Hoje em dia, uma grande variedade de metodologias alternativas estão disponíveis para a expressão de proteínas eucarióticas recombinantes (Quadro 2). Por exemplo, Baculovirus de expressão em células de insecto é amplamente utilizado devido à sua elevada eficiência de transdução e a sua falta de toxicidade em comparação com outras espécies virais 6. No entanto, o processo de fabrico do vírus é demorado e sua instabilidade não permite que o vírus a ser armazenado por longos períodos. Por outro lado, os sistemas de expressão de levedura oferece a possibilidade de as células a densidades muito elevadas de crescimento em culturas de fermentação, resultando em rendimentos elevados de proteína 7. Mas ainda não têm toda a variedade de modificações pós-tradução necessárias para proteínas eucarióticas para dobrar correctamente e interagem com os seus parceiros de proteína. HDAC3, por exemplo, é expresso, mas não se dobra em E. coli. No entanto, quando expressa em células 293F, que foram capazes de purificar uma enzima activa num complexo com o seu co-repressor (SMRT) e uma molécula de inositol tetrafosfato (IP4) 8, o qual não se encontra em células procarióticas. Este método também permitiu-nos a purificar e resolver o cristal Structure de HDAC1 interagindo com MTA1 no complexo NURD, a qual é igualmente activado pelo IP4 9. Idealmente, nós sempre gostaria de expressar proteínas eucarióticas em seu ambiente natural, fisiológico. Os sistemas de expressão de mamífero empregando células HEK 293-EBNA1 em biorreatores 10-12 foram descritas e produzir níveis muito elevados de proteína, mas estas podem ser complexas.
O nosso método é uma alternativa simples e acessíveis a expressão em sistemas de bactérias, leveduras e biorreatores. O método de expressão é rápido e não requer o uso de equipamento caro, especialmente se o ambiente em frascos rotativos ou frasco é substituída com 5% de CO 2 e agitam as incubadoras convencionais são utilizados. Usámos estes protocolos de co-transfectar vários plasmídeos e purificar complexos com até cinco proteínas com rendimentos de> 1 mg / L de cultura. Curiosamente, o sistema ajuda a identificação de complexos estáveis bem comportados. Por exemplo, expressão do complexo binário de HDAC1 e deram rendimentos limitados Sin3A de proteína, mas a adição de SDS3 resultou em 5 vezes quantidades mais elevadas e, portanto, guia a biologia estrutural na escolha de construções adequadas e complexos estáveis para cristalização.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Xiaowen Yang (serviço de clonagem PROTEX) para preparar as construções de expressão utilizadas para este trabalho e da Universidade de Leicester Núcleo de Biotecnologia Services. Este trabalho foi financiado por uma bolsa de estudo BBSRC, o Programa Wellcome Trust e subsídios pesquisador sênior WT085408 & WT100237 e BBSRC conceder RM31G0224.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle HEK 293F cells | LifeTechnologies | R790-07 | |
| FreeStyle 293 Expression Medium | LifeTechnologies | 12338-018 | |
| Anti-FLAG M2 Affinity Gel | SIGMA | A220 | |
| 250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning | 431144 | |
| Roller bottles with vented caps | Corning | 01836-02 | |
| Polyethylenimine, 25 kDa, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 - 4ºC |
| Mammalian expression vector | |||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Amicon | UFC30GV00 | |
| 15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off) | Amicon | UFC901008 | |
| Superdex 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17-5175-01 |
References
- Baneyx, F.
- Aricescu, A. R., Owens, R. J. Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology. Current opinion in structural biology. 23 (3), 345-356 (2013).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Boussif, O., Zanta, M. A., Behr, J. P. Optimized galenics improve in vitro gene transfer with cationic molecules up to 1000-fold. Gene therapy. 3 (12), 1074-1080 (1996).
- Godbey, W. T., Wu, K. K., Mikos, A. G. Poly (ethylenimine) and its role in gene delivery. Journal of Controlled Release. 60 ((2-3)), 149-160 (1999).
- Beljelarskaya, S. N. Baculovirus expression systems for production of recombinant proteins in insect and mammalian cells. Molecular Biology. 45 (1), 123-138 (2011).
- Cregg, J. M., Vedvick, T. S., Raschke, W. C. Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris. Nature Biotechnology. 11 (8), 905-910 (1993).
- Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. R. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate. Nature. 481 (7381), 335-340 (2013).
- Millard, C. J., Watson, P. J., et al. Class I HDACs Share a Common Mechanism of Regulation by Inositol Phosphates. Molecular Cell. 51 (1), 57-67 (2013).
- Tom, R., Bisson, L., Durocher, Y. Transfection of HEK293-EBNA1 Cells in Suspension with Linear PEI for Production of Recombinant Proteins. CSH protocols. , pdb.prot4977 (2008).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Research. 30 (2), (2002).
- Baldi, L., Muller, N., et al. Transient Gene Expression in Suspension HEK‐293 Cells: Application to Large‐Scale Protein Production. Biotechnology Progress. 21 (1), 148-153 (2005).
