Introduction
分子細胞生物学の急速な進歩と医療における改善された薬物についての一定の必要性は、構造生物学者は、ますます複雑なタンパク質の構造を見てする必要性を作成しています。これらは、しばしば、その精巧なフォールディングおよび酵素活性をサポートするために特定の翻訳後修飾、分子シャペロン、および補因子を必要とし得る。タンパク質データバンクに存在する構造体の大部分は、細菌発現系を用いて得られている一方で、原核生物は、これらの修飾の多数を実行することができず、多くの必須の真核生物の補因子を欠いている。これは、小さなシグナル伝達分子によってだけでなく、核、細胞表面や精巧な折りたたみ式機械を必要とする分泌タンパク質のために活性化される大きなマルチサブユニット複合体の研究のために問題となることがあります。 Eの数大腸菌株は、これらの制限1のいくつかを克服するように操作されている。 mが、近年では、しかし、使用ammalian発現系は、それらが確実に他のシステム2で表現する他の方法で問題となる真核生物のタンパク質を産生するために増加している。今日では、化学物質媒介トランスフェクション、ウイルス形質導入の範囲のさまざまな技術を通じて安定かつ一過性の哺乳動物発現細胞株を得るために、そのようなエレクトロポレーションおよび直接噴射3のような物理的遺伝子導入が可能である。これらの方法の全ては、長所と短所の独自のセットを有するが、それらのほんの数は、構造研究があまりにも高価および/または時間を消費するのいずれかであるのに適している。
ここでは、非常に、シンプルで高速、安価なまだサスペンション成長し、哺乳動物細胞における構造生物学のためのタンパク質複合体を発現させるための非常に効率的な方法を説明します。アプローチは、ヒト胎児腎臓（HEK）細胞株（ 例えば、フリースタイル、HEK 293F細胞）の一過性同時トランスフェクションを使用しています。これらの細胞は、HEK 293 CEから誘導されているllのラインは、（例えば、フリースタイル293発現培地など）を、無血清培地を用いて高密度に達し、懸濁培養中で増殖するように適合されている。次いで、細胞を一過性ポリエチレンイミン、分枝バージョン（PEI）、エンドサイトーシス5によって宿主細胞に入るDNA / PEI複合体を形成することによって、哺乳動物細胞4の広い範囲のために機能することが報告されている安価なポリマー試薬を用いてトランスフェクトされる。この方法は、（300ミリリットルまで）小規模（30ml）および大規模の両方に適しており、実験および精製されたタンパク質複合体を高レベルで生成することができる。これは、複雑な折り畳み機械、細菌、酵母、および昆虫細胞によって行うことができない補因子、または特定の翻訳後修飾を必要とするタンパク質を研究するために特に有用である。
このプロトコルでは、Sin3A転写抑制複合体からの3タンパク質中央足場の発現および精製を提示する。これはヒストンで構成されていデアセチラーゼ1（HDAC1）、不良サイレン3（SDS3）のサプレッサーおよびスイッチに依存しない3（Sin3A）。精製された複合体は、ハイスループット結晶化試験のために使用される。
Protocol
注：プロトコルは、そのための試薬のボリュームと量が比例的にスケールされるべきである、式の任意のスケールに適しています。適切な哺乳動物発現ベクターは、このプロトコルを使用しなければならない。ここでは、便利なクローニング（ 図1）で使用される制限酵素の選択に応じて親和性タグの包含または除外することができ変更されたpcDNA 3.1発現ベクターを使用していました。以下のプロトコルは、大規模なトランスフェクションについて説明します。
1Lのローラーボトル中で1大規模文化/トランスフェクション
標準的なプロトコルに従ってHEK293F懸濁適応細胞を成長させ、維持する。典型的には30〜100 mLのスターター培養物を250 mlコニカル細胞培養フラスコ中で増殖させる。
- 各1リットルのローラーボトル300 mlの最終体積中に0.5×10 6細胞/ mlの種子細胞。
注：ローラーボトルは、最大に150ミリリットルの最小値を受け入れる懸濁培養を300ml。より大規模なトランスフェクションのために複数のボトルを使用しています。 - 細胞は1.0×10 6細胞/ mlの密度に達するまで、37℃でオービタルシェーカーインキュベーター内で24時間、120rpmで、5％CO 2でインキュベート（細胞が約24時間ごとに分割します）。
- ろ過滅菌したDNAの300μgの合計ピペット3秒間激しくPBS 30mlおよび渦に（補助メソッドを参照してください）。
注：百トランスフェクションされた細胞あたり1μgのDNAの合計を使用してください。二つ以上のプラスミドをする同時トランスフェクトされた場合細胞に対するDNAの比が一定となるようにそれぞれの量を減らす。 - 3秒間、PBS / DNA溶液激しく渦に0.5 mg / mlのフィルター滅菌PEIの1.2ミリリットルを追加します。
- 20分間RTでミックスをインキュベートする。
- 1×10 6細胞/ ml（ステップ1.3）の密度であるべきである- DNA / PEIを細胞に混ぜ入れる。
- 同時トランスフェクションの後、細胞をインキュベートさらに37℃で48時間、120 rpmで、5％CO 2、オービタルシェーカーインキュベーター中。
- 5分間3000×gで細胞を遠心分離することによって細胞内タンパク質を収穫し、-80℃でペレットを格納します。
注：上記の培養雰囲気がCO 2 5％で置き換え、そしてボトルの蓋が密閉されている場合あるいは、振盪インキュベーター標準（非CO 2）を使用。雰囲気は各継代（通常は2日ごと）に交換する必要があります。
全細胞抽出物から2タンパク質複合体精製
このプロトコルは、フラグ標識タンパク質を用いた核複合体の精製のために最適化されています。
- あらかじめ冷却溶解緩衝液（100mM酢酸カリウム、50mMトリスpH7.5で、5％グリセロール、0.3％トリトンX-100、プロテアーゼ阻害剤）の培養物1Lあたりの約40中への細胞ペレットを解凍。
- 再懸濁（ボルテックス、発泡を避けるためにしないでください）上下にピペッティング数倍ペレットを。 完全にガラスホモジナイザーを用いて細胞を再懸濁。 3サイクル（15秒、15秒オフ）のために超音波処理。 4℃で25分間30,000×gで遠心分離し、上清を保持している。
- 樹脂の平衡化緩衝液（100mM酢酸カリウム、50mMトリスpH7.5）で3回洗浄することによって培養物のリットル当たり抗フラグパックアガロース樹脂1.25mlの平衡。
- 一つ以上の50ml遠心チューブ中の親和性樹脂と歩調2.3からの全細胞抽出物をインキュベートし、穏やかに、4℃で30〜120分間、サンプルを回転させる。
- 4℃、廃棄上澄みで1分間3000×gで遠心分離します。
- 予め冷却した緩衝液45mlを1（100mM酢酸カリウム、50mMトリスpH7.5で、5％グリセロール、0.3％トリトンX-100）で樹脂を洗浄する。 1分間3000×gで遠心分離し、上澄みを捨てる。
- 高塩緩衝液を用いて手順を繰り返し2.7低塩緩衝液（50mMの酢酸カリウム、50 mMトリスpHを7に続く（300 mMの酢酸カリウム、50mMトリスpH7.5で、5％グリセロール）0.5、5％グリセロール）及びTEV切断緩衝液（50mMの酢酸カリウム、50mMトリスpH7.5の、0.5 mMのTCEP）。
注：各洗浄は、すなわち完全にもはや樹脂を再懸濁し、するのに十分短いことを確認します。 - 樹脂の10μlのサンプルを収集し、分析のために2倍のタンパク質ローディングバッファー（結合したタンパク質制御）の1体積中に希釈する。樹脂から抗体を解放する避けるために還元剤を使用しないでください。
- 15mlの遠心管にあらかじめ冷却TEV切断バッファーと転送8-10中へ樹脂を再懸濁する。
- 追加〜40元の培養1L当たり（1 mg / mlの時ストックから）TEVプロテアーゼμgの上下に数回ピペッティングしてよく混ぜます。
- タンパク質の酸化を防止するために、100％のN 2ガ スでチューブ雰囲気を交換してください。
- 静かに、4℃でO / N回転させます。
- 10分間の3000×gで遠心分離します。適切な分子量カットオフの超遠心フィルターに上清を移し、集中500μlのまで。
- 濃縮されたタンパク質の10μlのサンプルを収集し、分析のために2倍のタンパク質ローディングバッファーの1の体積に希釈する。 （TEVは、コントロールを溶出）。
- 樹脂の10μlのサンプルを収集し、分析のために2倍のタンパク質ローディングバッファー1体積中に希釈する。樹脂から大量の抗体を解放しないようにするために、還元剤は使用しないでください。 （ポスト-TEV樹脂制御）。
- ゲルろ過バッファー（50mMの酢酸カリウム、50mMトリスpH7.5の、0.5 mMのTCEP）でのサイズ排除クロマトグラフィーカラムを平衡化する。
- 0.22μmのフィルターに通してタンパク質をフィルター
- カラムに試料をロードし、画分を収集します。
- ステップ2.9、2.15と2.16と分析のためのSDS-PAGEおよびクーマシー染色の手順2.19からゲル濾過分画から実行サンプル。
注：それは、標的タンパク質の発現を確認するためのステップ2.9、2.15および2.16以前のゲル濾過からのサンプルのSDS-PAGEを実行することをお勧めします。
Representative Results
ここでは、HDAC1、SDS3、Sin3A三元複合体の2 L（8×250ミリリットル培養）一過性の同時トランスフェクションおよび精製を示している。 HDAC1とSDS3はSin3AのHDAC-相互作用ドメイン（HID）を介してSin3Aと対話します。文化リットル当たり複雑な1mgのまでの典型的な精製収量。
修飾されたpcDNA 3.1発現ベクターの図1の模式図。プラスミドをSin3Aのアミノ末端上のアフィニティータグおよびTEV切断部位を含むようにEcoRVおよびEcoRIで消化し た。 HDAC1とSDS3のタグなしバージョンのクローンを作成するには、ベクターは、KpnIとEcoRIで消化した。
図2のSDS-PAGE精製の 第一段階を示す。「結合タンパク質」レーンは、親和性樹脂に結合した複合体を示している。 TEV消化後、Sin3A-HID上に存在するタグが切断されると、ゲルの第二および第三のレーンに示すように、複合体は、樹脂から溶出される。
タンパク質複合体のサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製する図3クロマトグラムは、溶液中で二量体を形成するので、純粋な複合体は空隙容量に溶出されることに注意してください。
図3に示すゲル濾過画分を示す図4のSDS-PAGE。
図2.3×10 6個/ mlで5トリパンブルー染色HEK 293F細胞に形質移入することができる状態に。大規模なクラスタを約25秒間激しくボルテックスによって分割されてもよい細胞は、唯一、単一または分裂細胞として存在すべきである。
| 問題 | 考えられる原因 | アクション |
| 低タンパク質収量。 | トランスフェクションされた細胞の数が少ない。 | 必ず細胞密度が1.0×10 6培養物にトランスフェクション反応混合物を添加する前に約あることを確認してください。 |
| 細胞は、何度も継代培養された可能性があります。 | 約90パスの後、新鮮な株式細胞を使用して、年齢。 | |
| DNAの分解又は不純物を多量に有してもよい。 | 使用されているプラスミドDNAが1.8と2.0の間260/280比を有することを確認してください。アガロースゲル上でDNAを実行すると、その品質を評価することをお勧めします。 | |
| タンパク質（複数可）を発現している安定したか十分に溶解しない。 | トランスフェクションのスケーリングアップする前に、小スケールでの異なる構築物をテストします。必ずタグは、目的のタンパク質（単数または複数）の構造に干渉しないことを確認します。 | |
| 細胞は曇って見え、珍しい色および/または臭気を持つ。 | 細胞は、細菌や酵母に感染している。 | グッド無菌技術は常に使用する必要があります。層流フードや感染症の場合には、UV-消毒細胞培養室を燻蒸すると、問題を含むことができます。 |
| 細胞は、低い生存率を持っている。 | メディアでの間違ったpH値。 | 培養はCO 2百分の5から8で成長していることを確認してくださいすべての回で。 |
| 細胞は3.0×10 6細胞/ mlの上に密度まで培養した。 | 細胞は、2.5×10 6細胞/すぐにトランスフェクションの前に、決して3.0×10 6個 / mlを超えるミリリットル以上の密度にまで成長させることがないようにしてください。 | |
| アフィニティー精製は動作しませんでした | タンパク質は、（複数の）発現されていない。 | 上記を参照してください。 |
| 精製条件は、間違っているかもしれない。 | 緩衝条件の調整（ 例えば、高塩、低塩、pHが。） |
表1のトラブルシューティング。
| システム | メリット | デメリット |
| E.コリ |
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| P.パストリス |
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| 昆虫細胞中でバキュロウイルス発現 |
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| 哺乳動物系でバイオリアクター |
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| HEK 293F懸濁細胞 |
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表2の利点と主な発現システムの欠点。
Discussion
私たちは、哺乳動物細胞から組換えタンパク質及び多サブユニット複合体を大量に発現させ、精製するために（PEIは、市販の親油性のトランスフェクション試薬よりもはるかに少ない費用）簡単かつコスト効果的な方法を開発した。プロトコルセクションに記載したように、高純度のプラスミドDNA（1.8と2.0との間の280分の260）はPEIと組み合わせて使用される場合、最適なトランスフェクションおよび発現効率に達することができる。細胞を血清および抗生物質を含まない培地で培養されなければならないので、滅菌技術は厳密にコストと時間がかかる感染症を避けるために継代し、細胞をトランスフェクトするために必要とされる。細胞の生存率が90％以上でなければならず、文化が2.5×10 6個の細胞よりも大きな密度まで成長させることはありません/すぐにトランスフェクションの前に、そうするように、タンパク質収量が減少しますミリリットル。成功したトランスフェクションのために、培養物を単一または分裂細胞にのみ含まれている必要があります。クラスタは活力によって分割することができるOUはボルテックス20〜30秒（ 図5）。同時トランスフェクションに用いた各プラスミドの比率が研究され、複合体の化学量論に従って、ユーザによって変更することができる。適切な発現時間を確立することができるように、発現効率は、目的のタンパク質に対して最適化することができる。精製は、望ましくないタンパク質分解の危険性を減らすために常時冷たいタンパク質試料を保持行われるべきである。彼らはしばしば減少溶解性および/または酵素活性の損失をもたらす、構造要素または特定のタンパク質の活性部位を妨害することがあるので、タグ及び精製緩衝液の選択は、重要である。小規模トランスフェクションは、大きなタンパク質複合体の精製のための異なる構築物を試験するために特に有用である。
今日では、代わりの方法論の多種多様な組換え真核生物のタンパク質（ 表2）の発現のために利用可能である。たとえば、Baculovi昆虫細胞におけるコーラス発現は広く、その高い形質導入効率および他のウイルス種6と比較して細胞毒性の欠如に使用される。しかし、ウイルスを作製するプロセスは、時間がかかり、その不安定性は、ウイルスが長期間保存することはできません。一方、酵母発現系は、高いタンパク質収率7で得られた、増殖する細胞の発酵槽培養物における非常に高い密度の可能性を提供する。しかし、彼らはまだ、真核生物のタンパク質が正しく折り畳まおよびそれらのタンパク質パートナーと相互作用することに必要な翻訳後修飾の完全な多様性を欠いている。 HDAC3は、例えば、発現されるが、Eにフォールドしない大腸菌 。 293F細胞内で発現した場合しかし、私たちはそのプレッサー（SMRT）および原核細胞には見られない、イノシトール四リン（IP4）8の分子との複合体中の活性酵素を精製することができました。また、このメソッドは、STを精製し、結晶を解決するために私達を許可している同様IP4 9によって活性化されるNuRD複合体でMTA1との相互作用HDAC1のructure。理想的には、私たちは常にその自然、生理的環境における真核生物のタンパク質を表したいと思います。バイオリアクター10-12にHEK 293-EBNA1細胞を用いた哺乳動物発現系が記載およびタンパク質の非常に高いレベルをもたらすが、これらは使用するのが複雑であることができるされている。
本手法は、細菌、酵母およびバイオリアクター系における発現への簡単アクセス可能な代替手段です。表現方法は、高速であり、ローラーボトルまたはフラスコの雰囲気は、5％CO 2で置換されている、標準的な振とうインキュベータが使用される場合は特に、高価な機器の使用を必要としない。私たちは、複数のプラスミドトランスフェを共同文化の> 1 mg / Lの収率で最大5つのタンパク質と複合体を精製するために、これらのプロトコルを使用している。興味深いことに、システムは安定行儀複合体の識別を支援します。たとえば、元HDAC1とSin3Aの二元複合体のpressionは、タンパク質の制限された収量を与え、まだSDS3の追加は、5倍高い量をもたらし、したがって、結晶化に適した構築物および安定な複合体の選択における構造生物学者を案内する。
Acknowledgments
私たちは、この仕事とレスターコアテクノロジー·サービス大学のために使用される発現構築物を調製するための博士孝文ヤン（PROTEXクローニングサービス）を感謝したいと思います。この作品は、BBSRCの学生の身分によってサポートされていました、ウェルカムトラストプログラムとシニア調査官補助金WT085408＆WT100237とBBSRCはRM31G0224を付与します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle HEK 293F cells | LifeTechnologies | R790-07 | |
| FreeStyle 293 Expression Medium | LifeTechnologies | 12338-018 | |
| Anti-FLAG M2 Affinity Gel | SIGMA | A220 | |
| 250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning | 431144 | |
| Roller bottles with vented caps | Corning | 01836-02 | |
| Polyethylenimine, 25 kDa, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 - 4ºC |
| Mammalian expression vector | |||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Amicon | UFC30GV00 | |
| 15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off) | Amicon | UFC901008 | |
| Superdex 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17-5175-01 |
References
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