Introduction
وقد أدى التقدم السريع لبيولوجيا الخلية الجزيئية والحاجة المستمرة لتحسين العقاقير في الطب حاجة لعلماء الأحياء الهيكلية للنظر في الهياكل البروتين على نحو متزايد أكثر تعقيدا. يمكن لهذه غالبا ما تتطلب تعديلات خاصة بعد متعدية، المحرمين الجزيئية والعوامل المشتركة لدعم للطي من محكم والنشاط الأنزيمي. في حين أن الغالبية العظمى من الهياكل الحالية في بنك معلومات البروتين قد تم الحصول عليها باستخدام أنظمة التعبير البكتيرية، بدائيات النوى غير قادرة على تنفيذ عدد كبير من هذه التعديلات وتفتقر العديد من العوامل المشارك حقيقية النواة الأساسية. وهذا يمكن أن يكون مشكلة لدراسة المجمعات متعددة فرعية الكبيرة التي يتم تفعيلها من خلال جزيئات صغيرة مما يشير كذلك لالنووية وسطح الخلية والبروتينات يفرز التي تتطلب وضع آليات قابلة للطي. وهناك عدد من E. وقد تم تصميم سلالات القولونية للتغلب على بعض هذه القيود 1. في السنوات الأخيرة، ومع ذلك، فإن استخدام منظم التعبير ammalian قد تزايد لأنها تنتج موثوق البروتينات حقيقية النواة التي هي على خلاف ذلك للتعبير عن إشكالية في الأنظمة الأخرى 2. اليوم، فإنه من الممكن الحصول على خطوط الخلايا التعبير الثدييات مستقرة وعابرة من خلال مجموعة متنوعة من التقنيات التي تتراوح بين تنبيغ الفيروسية لترنسفكأيشن بوساطة الكيميائية والفيزيائية تحويل الجينات مثل Electroporation للوالحقن المباشر 3. في حين أن كل من هذه الأساليب لديها مجموعة من المزايا والعيوب، فقط عدد قليل منها هي مناسبة للدراسات الهيكلية أنها إما مكلفة للغاية و / أو وقتا طويلا.
نحن هنا وصف طريقة بسيطة جدا وسريعة، وغير مكلفة حتى الآن كفاءة عالية للتعبير عن مجمعات البروتين لعلم الأحياء الهيكلي في تعليق نمت خلايا الثدييات. يستخدم نهج عابر شارك في ترنسفكأيشن خط الجنينية البشرية الكلى (HEK) الخلايا (مثل خلايا حرة HEK 293F). وقد استمدت هذه الخلايا من 293 م HEKخط ليرة لبنانية، يتم تكييفها لتنمو في الثقافات تعليق، ووصلت كثافة عالية باستخدام المصل خالية سائل الإعلام (مثل حرة 293 التعبير المتوسطة). ثم و transfected خلايا عابر باستخدام نسخة من أفرع polyethylenimine (PEI)، وكاشف البوليمرية غير مكلفة التي ذكرت في العمل لمجموعة كبيرة من خلايا الثدييات 4 من خلال تشكيل الحمض النووي / المجمعات PEI التي تدخل الخلية المضيفة عن طريق الإلتقام 5. هذا الأسلوب هو مناسبة لكلا نطاق صغير (30 مل) وعلى نطاق واسع (ما يصل الى 300 مل) التجارب ويمكن أن تنتج مستويات عالية من المجمعات البروتين المنقى. انها مفيدة بشكل خاص لدراسة البروتينات التي تتطلب أجهزة معقدة للطي، والعوامل المشارك أو خاصة التعديلات بعد متعدية التي لا يمكن أن يقوم بها البكتيريا والخميرة وخلايا الحشرات.
في هذا البروتوكول نقدم التعبير وتنقية السقالة وسط ثلاثة البروتين من مجمع القمع النسخي Sin3A. هذا يتكون من هيستونDeacetylase 1 (HDAC1)، المكثف من المعيب إسكات 3 (SDS3) والتبديل مستقلة-3 (Sin3A). يتم استخدام مجمع النقي للمحاكمات تبلور عالية الإنتاجية.
Protocol
ملاحظة: بروتوكول مناسب لحجم أي تعبير، وبالتالي أحجام وكميات الكواشف يجب تحجيمها بشكل متناسب. يجب أن تستخدم مناسبة متجه التعبير الثدييات لهذا البروتوكول. نحن هنا استخدام تعديل pcDNA 3.1 ناقلات التعبير التي تسمح بسهولة إدراج أو استبعاد علامة تقارب اعتمادا على اختيار تقييد الانزيمات المستخدمة في الاستنساخ (الشكل 1). يصف البروتوكول بعد ترنسفكأيشن نطاق واسع.
1. كبيرة الثقافة مقياس / ترنسفكأيشن في 1 لتر زجاجات الأسطوانة
النمو والحفاظ على خلايا تكييفها تعليق HEK293F وفقا لبروتوكولات القياسية. وعادة ما تزرع ثقافات المبدئ بين 30 و 100 مل في 250 مل المخروطية قوارير ثقافة الخلية.
- خلايا البذور عند 0.5 × 10 6 خلية / مل إلى الحجم النهائي من 300 مل في كل زجاجة الأسطوانة 1 L.
ملاحظة: زجاجات الأسطوانة تستوعب ما لا يقل عن 150 مل لمدة أقصاها300 مل من ثقافة تعليق. لtransfections نطاق أوسع استخدام زجاجات متعددة. - احتضان لمدة 24 ساعة في حاضنة شاكر المدارية عند 37 درجة مئوية، 120 دورة في الدقيقة، و 5٪ CO 2 حتى تصل إلى خلايا كثافة 1.0 × 10 6 خلية / مل (خلايا يجب تقسيم تقريبا كل 24 ساعة).
- ماصة ما مجموعه 300 ميكروغرام من الحمض النووي فلتر تعقيم (انظر طريقة التكميلي) في 30 مل من برنامج تلفزيوني ودوامة بقوة لمدة 3 ثانية.
ملاحظة: استخدم ما مجموعه 1 ميكروغرام من الحمض النووي في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مليون. إذا اثنين أو أكثر من البلازميدات هي يشترك transfected-تقلل من كمية كل ذلك أن نسبة الحمض النووي لخلايا لا تزال مستمرة. - إضافة 1.2 مل من 0.5 ملغ / مل تصفية تعقيم-PEI إلى PBS / حل DNA ودوامة بقوة لمدة 3 ثانية.
- احتضان هذا المزيج في RT لمدة 20 دقيقة.
- إضافة DNA / PEI المزيج إلى الخلايا - التي ينبغي أن تكون في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 6 خلية / مل (الخطوة 1.3).
- شارك في ترنسفكأيشن التالية، واحتضان الخلايافي حاضنة شاكر المداري ل48 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية، 120 دورة في الدقيقة، وCO 2 5٪.
- البروتينات داخل الخلايا الحصاد بواسطة الطرد المركزي الخلايا في 3000 x ج لمدة 5 دقائق وتخزين بيليه في -80 درجة مئوية.
ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدام معيار (غير CO-2) يهز حاضنة، إذا تم استبدال الغلاف الجوي فوق الثقافة مع CO 2 5٪ ومختومة في غطاء زجاجة. سوف تحتاج الجو لتحل محلها في كل ممر (عادة كل أيام 2).
2. البروتين تنقية معقدة من استخراج خلية كاملة
تم تحسين هذا البروتوكول لتنقية المجمعات النووية باستخدام بروتينات الموسومة العلم.
- تذويب بيليه الخلية إلى ~ 40 مل من تحلل العازلة قبل المبردة (100 ملي خلات البوتاسيوم، و 50 ملي تريس 7.5 درجة الحموضة، الجلسرين 5٪، 0.3٪ تريتون X-100، مثبطات الأنزيم البروتيني) لكل لتر من الثقافة.
- إعادة تعليق بيليه بواسطة pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات (لتجنب رغوة، لا الدوامة). تماما اعادة تعليق الخلايا باستخدام الخالط الزجاج. يصوتن لمدة 3 دورات (15 ثانية على، 15 ثانية إيقاف). أجهزة الطرد المركزي في 30،000 x ج لمدة 25 دقيقة في 4ºC والاحتفاظ طاف.
- تتوازن 1.25 مل من مكافحة العلم معبأة الراتنج الاغاروز لكل لتر من الثقافة عن طريق غسل ثلاث مرات مع العازلة الراتنج موازنة (100 ملي خلات البوتاسيوم، و 50 ملي تريس 7.5 درجة الحموضة).
- احتضان استخراج خلية كاملة من الخطوة 2.3 مع الراتنج تقارب في واحدة أو أكثر من 50 مل أنابيب الطرد المركزي وتناوب بلطف العينة ل30-120 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 1 دقيقة في 4 درجة مئوية، وطاف تجاهل.
- غسل الراتنج مع 45 مل من العازلة قبل المبردة 1 (100 ملي خلات البوتاسيوم، و 50 ملي تريس 7.5 درجة الحموضة، الجلسرين 5٪، 0.3٪ تريتون X-100). أجهزة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف.
- كرر الخطوة 2.7 باستخدام العازلة عالية من الملح (300 ملي خلات البوتاسيوم، و 50 ملي تريس 7.5 درجة الحموضة، الجلسرين 5٪)، تليها عازلة الملح منخفضة (50 ملي خلات البوتاسيوم، و 50 ملي تريس درجة الحموضة 7.5 و 5٪ الجلسرين) والشق TEV العازلة (50 ملي خلات البوتاسيوم، و 50 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 7.5، 0.5 ملي TCEP).
ملاحظة: تأكد من كل غسل هو أي جيزة، كافية تماما لاعادة تعليق الراتنج ولم يعد. - جمع عينة 10 ميكرولتر من الراتنج وتمييع إلى 1 حجم 2X العازلة تحميل البروتين لتحليل (ملزمة تحكم البروتين). لا تستخدم وكلاء الحد من أجل تجنب الافراج عن الأجسام المضادة من الراتنج.
- إعادة تعليق الراتنج إلى 8-10 مل من قبل المبردة عازلة TEV انشقاق ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
- إضافة ~ 40 ميكروغرام من TEV البروتيني (من المخزون في 1 ملغ / مل) لكل لتر من الثقافة الأصلية ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات.
- استبدال أنبوب الغلاف الجوي مع 100٪ N 2 الغاز لمنع أكسدة البروتين.
- تناوب بلطف O / N في 4ºC.
- أجهزة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 10 دقيقة. نقل طاف في عامل تصفية الطرد المركزي فائقة مع الوزن الجزيئي قطع المناسبة والتركيزوصولا إلى 500 ميكرولتر.
- جمع عينة 10 ميكرولتر من البروتين المركز وتمييع إلى 1 حجم 2X العازلة تحميل البروتين للتحليل. (TEV شطافة السيطرة).
- جمع عينة 10 ميكرولتر من الراتنج وتمييع إلى 1 حجم 2X العازلة تحميل البروتين للتحليل. لا تستخدم الحد من وكلاء من أجل تجنب إطلاق كميات كبيرة من الأجسام المضادة الراتنج. (بعد TEV السيطرة الراتنج).
- تتوازن حجم استبعاد العمود اللوني هلام مع العازلة الترشيح (50 ملي خلات البوتاسيوم، و 50 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 7.5، 0.5 ملي TCEP).
- تصفية البروتين من خلال مرشح 0.22 ميكرون
- تحميل العينة إلى العمود وجمع الكسور.
- عينات من خطوات تشغيل 2.9، 2.15 و 2.16 وكسور الترشيح هلام من الخطوة 2.19 على SDS-PAGE Coomassie وصمة عار للتحليل.
ملاحظة: ومن المستحسن لتشغيل SDS-PAGE عينات من الخطوات 2.9، 2.15 و 2.16 قبل هلام الترشيح لتأكيد التعبير عن بروتين الهدف.
Representative Results
نحن هنا تظهر L 2 (8 × 250 مل الثقافات) عابرة شارك في ترنسفكأيشن وتنقية HDAC1، SDS3، Sin3A مجمع الثلاثي. HDAC1 وSDS3 التفاعل مع Sin3A من خلال المجال HDAC التفاعل (HID) من Sin3A. وعائدات تنقية نموذجية تصل إلى 1 ملغ من مجمع للتر الواحد من الثقافة.
الرقم 1. تخطيطي لتعديل ناقلات pcDNA 3.1 التعبير. تم هضمها البلازميد مع EcoRV وEcoRI لتشمل تقارب العلامة وTEV انشقاق الموقع على محطة الأمينية من Sin3A. لاستنساخ إصدارات لازال من HDAC1 وSDS3، تم استيعاب ناقلات مع KpnI وEcoRI.
الشكل 2. SDS-PAG E تظهر الخطوة الأولى لتنقية ويبين "بروتين ملزمة" حارة المجمع منضمة إلى الراتنج تقارب. TEV التالية الهضم، والمشقوق العلامة موجودة على Sin3A-HID قبالة ومزال مجمع من الراتنج كما هو مبين في الممرات الثانية والثالثة من هلام.
الرقم 3. المخطط الاستشرابي من البروتين النقي معقدة باستخدام استبعاد حجم اللوني. لاحظ أن مجمع النقي مزال في حجم الفراغ لأنه يشكل ديمر في الحل.
الرقم 4. SDS-PAGE تظهر أجزاء من الترشيح هلام هو مبين في الشكل 3.
r.within الصفحات = "دائما"> 
الشكل 5. التريبان خلايا HEK 293F الزرقاء الملطخة في 2.3x10 6 خلية / مل جاهزة ليتم transfected. يجب أن تكون خلايا فقط بوصفها واحدة أو تقسيم الخلايا، في حين يمكن تقسيم مجموعات كبيرة تصل من قبل vortexing قوية لحوالي 25 ثانية.
| مشكلة | الأسباب المحتملة | العمل |
| انخفاض العائد البروتين. | انخفاض عدد الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. | جعل كثافة الخلية المؤكد تقريبا 1.0 × 10 6 قبل إضافة خليط التفاعل ترنسفكأيشن للثقافة. |
| خلايا قد تم subcultured مرات كثيرة جدا. | استخدام خلايا الأسهم جديدة بعد ما يقرب من 90 تمريرةالأعمار. | |
| DNA قد تدهورت أو لديك كمية عالية من الشوائب. | تأكد من أن الحمض النووي بلازميد تستخدم لديه نسبة 260/280 بين 1.8 و 2.0. تشغيل DNA على هلام الاغاروز من المستحسن لتقييم جودتها. | |
| بروتين (ق) التي أعرب ليست مستقرة بما فيه الكفاية أو ذوبان. | اختبار بنيات مختلفة في نطاق ضيق قبل يصل تسلق transfections. جعل علامات على يقين لا تتداخل مع بنية البروتين (ق) من الفائدة. | |
| الخلايا تبدو غائمة ولها لون غير عادي و / أو رائحة. | يصاب الخلايا مع البكتيريا أو الخميرة. | يجب استخدام تقنية معقمة جيدة في جميع الأوقات. تبخير اغطية تدفق الصفحي والأشعة فوق البنفسجية تعقيم غرفة زراعة الخلايا في حالة من حالات العدوى يساعد على احتواء المشكلة. |
| الخلايا لديها قابلية منخفضة. | درجة الحموضة خاطئة في وسائل الإعلام. | جعل تزرع ثقافات المؤكد في 5-8٪ CO 2في جميع الأوقات. |
| تم تربيتها خلايا تصل إلى كثافة أكثر من 3.0x10 6 خلية / مل. | لا ينبغي أن نمت الخلايا يصل إلى كثافة فوق 2.5 × 10 6 خلية / مل على الفور قبل ترنسفكأيشن وأبدا فوق 3.0 × 10 6 خلية / مل. | |
| لم تنقية تقارب لا تعمل | لا يتم أعرب البروتين (ق). | انظر أعلاه. |
| شروط تنقية قد تكون خاطئة. | ضبط الظروف عازلة (مثل الملح العالية، والملح منخفضة، ودرجة الحموضة.) |
الجدول 1. استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
| نظام | مزايا | عيوب |
| كولاي |
|
|
| P. pastoris |
|
|
| التعبير الفيروسة العصوية في خلايا الحشرات |
|
|
| المفاعلات الحيوية مع أنظمة الثدييات |
|
|
| خلايا تعليق HEK 293F |
|
|
الجدول 2. مزايا وعيوب الأنظمة التعبير الرئيسية.
Discussion
قمنا بتطوير طريقة فعالة واضحة وبكلفة (PEI تكاليف أقل بكثير من المتاحة تجاريا الكواشف ترنسفكأيشن محبة للدهون) للتعبير عن وتنقية كميات كبيرة من البروتينات المؤتلف والمجمعات متعددة فرعية من خلايا الثدييات. يمكن الوصول ترنسفكأيشن الأمثل والكفاءة التعبير إذا تم استخدام DNA البلازميد نقية للغاية (260/280 بين 1.8 و 2.0) في تركيبة مع PEI كما هو موضح في قسم البروتوكول. يجب أن يكون مثقف الخلايا في serum- وخالية من المضادات الحيوية وسائل الإعلام، وبالتالي، مطلوب تقنية معقمة بدقة عن الركض والخلايا transfecting من أجل تجنب العدوى مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. وينبغي أن يكون بقاء الخلية 90٪ أو أعلى، وينبغي ألا نمت الثقافات إلى كثافة أكبر من 2.5 × 10 6 خلية / مل على الفور قبل ترنسفكأيشن، لأن ذلك سوف يقلل العائد البروتين. لترنسفكأيشن ناجحا، يجب الثقافات تحتوي فقط على الخلايا واحدة أو تقسيم. يمكن تقسيم المجموعات من قبل قوةvortexing لالأوس 20 الى 30 ثانية (الشكل 5). نسبة كل بلازميد المستخدمة في التعاون ترنسفكأيشن يمكن أن تختلف من قبل المستخدم وفقا لرياضيات الكيمياء للكائن معقد دراستها. يمكن تحسين كفاءة التعبير عن البروتين من الفائدة، بحيث يمكن إنشاء الوقت التعبير مناسب. يجب أن يتم تنفيذ تنقية حفظ البرد عينة البروتين في جميع الأوقات للحد من مخاطر تدهور بروتين غير المرغوب فيها. اختيار العلامات ومخازن تنقية أمر بالغ الأهمية، لأنها قد تتداخل مع العناصر الهيكلية أو المواقع المفعلة بعض البروتينات، مما أدى إلى انخفاض الذوبان و / أو فقدان النشاط الأنزيمي في كثير من الأحيان. transfections صغار مفيدة بشكل خاص لاختبار بنيات مختلفة لتنقية البروتين المجمعات الكبيرة.
اليوم، تتوفر للتعبير عن البروتينات المؤتلف حقيقية النواة (الجدول 2) مجموعة كبيرة ومتنوعة من منهجيات بديلة. على سبيل المثال، Baculoviويستخدم روس التعبير في خلايا الحشرات على نطاق واسع بسبب ارتفاع كفاءة ترنسدوكأيشن وافتقارها إلى سمية الخلايا بالمقارنة مع الأنواع الفيروسية الأخرى 6. ومع ذلك، فإن عملية جعل الفيروس تستغرق وقتا طويلا ولا يسمح عدم الاستقرار الفيروس ليتم تخزينها لفترات طويلة. من ناحية أخرى، نظم الخميرة التعبير توفر إمكانية خلايا الكثافة إلى عالية جدا متزايد في الثقافات تخمير، مما أدى إلى عوائد بروتين عالية 7. لكنها لا تزال تفتقر إلى مجموعة كاملة من التعديلات بعد متعدية المطلوبة للبروتينات حقيقية النواة لأضعاف بشكل صحيح والتفاعل مع الشركاء البروتين. HDAC3، على سبيل المثال، يتم التعبير لكن لا أضعاف في E. القولونية. ومع ذلك، عندما أعرب في 293F الخلايا، وتمكنا من تنقية انزيم نشط في مجمع مع الجهات المشاركة في كاظمة (SMRT) وجزيء من اينوزيتول tetraphosphate (IP4) 8، والتي لم يتم العثور في الخلايا أولية النواة. هذه الطريقة سمحت لنا أيضا لتنقية وحل الكريستال الحادي وructure من HDAC1 التفاعل مع MTA1 في مجمع NuRD، الذي ينشط مماثل IP4 9. من الناحية المثالية، نود دائما للتعبير عن البروتينات في حقيقية النواة الطبيعية وبيئتها الفسيولوجية. وقد وصفت النظم التعبير الثدييات التي تستخدم خلايا HEK 293-EBNA1 في المفاعلات الحيوية 10-12 وتسفر مستويات عالية جدا من البروتين، ولكن هذه يمكن أن تكون معقدة للاستخدام.
أسلوبنا هو بديل بسيط وفي متناول التعبير في أنظمة البكتيريا والخميرة ومفاعل حيوي. طريقة التعبير هو سريع ولا يتطلب استخدام معدات غالية الثمن، خاصة إذا تم استبدال الأسطوانة زجاجة أو قارورة الجو مع 5٪ CO 2 وتستخدم حاضنات تهز القياسية. وقد استخدمنا هذه البروتوكولات إلى المشاركة في البلازميدات بالنقل متعددة وتنقية المجمعات مع ما يصل الى خمسة البروتينات مع غلة> 1 ملغ / لتر من الثقافة. ومن المثير للاهتمام، ونظام يساعد على تحديد مستقرة المجمعات حسن تصرف. على سبيل المثال، السابقأعطى بريشن من مجمع ثنائي HDAC1 وSin3A عوائد محدودة من البروتين، ولكن أدت إضافة SDS3 في 5 أضعاف كميات أكبر، وبالتالي يوجه الأحياء الهيكلي في اختيار التركيبات المناسبة والمجمعات مستقرة للتبلور.
Acknowledgments
نود أن نشكر الدكتور يانغ شياو ون (PROTEX خدمة الاستنساخ) لإعداد بنيات التعبير المستخدم لهذا العمل وجامعة ليستر الخدمات الأساسية الحيوية. وأيد هذا العمل من قبل studentship BBSRC، وبرنامج يلكوم ترست والمنح باحث العليا WT085408 وWT100237 وBBSRC منح RM31G0224.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle HEK 293F cells | LifeTechnologies | R790-07 | |
| FreeStyle 293 Expression Medium | LifeTechnologies | 12338-018 | |
| Anti-FLAG M2 Affinity Gel | SIGMA | A220 | |
| 250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning | 431144 | |
| Roller bottles with vented caps | Corning | 01836-02 | |
| Polyethylenimine, 25 kDa, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 - 4ºC |
| Mammalian expression vector | |||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Amicon | UFC30GV00 | |
| 15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off) | Amicon | UFC901008 | |
| Superdex 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17-5175-01 |
References
- Baneyx, F.
- Aricescu, A. R., Owens, R. J. Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology. Current opinion in structural biology. 23 (3), 345-356 (2013).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Boussif, O., Zanta, M. A., Behr, J. P. Optimized galenics improve in vitro gene transfer with cationic molecules up to 1000-fold. Gene therapy. 3 (12), 1074-1080 (1996).
- Godbey, W. T., Wu, K. K., Mikos, A. G. Poly (ethylenimine) and its role in gene delivery. Journal of Controlled Release. 60 ((2-3)), 149-160 (1999).
- Beljelarskaya, S. N. Baculovirus expression systems for production of recombinant proteins in insect and mammalian cells. Molecular Biology. 45 (1), 123-138 (2011).
- Cregg, J. M., Vedvick, T. S., Raschke, W. C. Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris. Nature Biotechnology. 11 (8), 905-910 (1993).
- Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. R. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate. Nature. 481 (7381), 335-340 (2013).
- Millard, C. J., Watson, P. J., et al. Class I HDACs Share a Common Mechanism of Regulation by Inositol Phosphates. Molecular Cell. 51 (1), 57-67 (2013).
- Tom, R., Bisson, L., Durocher, Y. Transfection of HEK293-EBNA1 Cells in Suspension with Linear PEI for Production of Recombinant Proteins. CSH protocols. , pdb.prot4977 (2008).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Research. 30 (2), (2002).
- Baldi, L., Muller, N., et al. Transient Gene Expression in Suspension HEK‐293 Cells: Application to Large‐Scale Protein Production. Biotechnology Progress. 21 (1), 148-153 (2005).
