Abstract
Широкое использование следующего поколения последовательности открыло новые возможности для исследования рака и диагностики. NGS принесет огромные суммы новых данных по раку, и особенно генетики рака. Современные знания и будущие открытия сделает его необходимо изучить огромное количество генов, которые могут быть вовлечены в генетической предрасположенности к раку. В связи с этим, мы разработали дизайн Nextera учиться 11 полных генов, участвующих в репарации ДНК повреждения. Этот протокол был разработан для безопасного учиться 11 генов (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, Rad50, RAD51C, RAD80, и TP53) от промоутера в 3'-UTR у 24 пациентов одновременно. Этот протокол, основанный на транспозазы технологии и гДНК обогащения, дает большое преимущество с точки зрения времени для генетической диагностики, благодаря отведать мультиплексирование. Этот протокол можно безопасно использовать с гДНК крови.
Introduction
В 2010 году почти 1,5 миллиона человек (в основном женщины) развился рак молочной железы во всем мире. По оценкам, от 5 до 10% из этих случаев были наследственными. Почти 20 лет назад, BRCA1 и BRCA2 были определены как участие в наследственной рака груди и яичников 1. Поскольку около 15 лет назад, BRCA1 и BRCA2 кодирующие области были последовательными, чтобы определить генетическую предрасположенность к груди и рака яичников. Изменения в BRCA1 и BRCA2 обнаруживаются в 10 до 20% отдельных семей 2, предполагая, что анализ этих регионах не является достаточным для эффективного скрининга. В последнее время анализ некодирующих последовательностей (промоутер, интронов, 3-'UTR) от BRCA1 и BRCA2 подчеркнул, что новые мутации / вариации могут быть связаны с более высоким риском рака молочной железы 3-6.
BRCA1 и BRCA2 белки участвуют в гомологичной рекомбинации Ремонт (HHR), который завершается многочисленными партнерами 7. В то время как изменения в генах BRCA1 или BRCA2 вызвать дефекты в репарации ДНК, другие партнеры также могут влиять на риск рака молочной железы. Эта гипотеза представляется, были проверены с BRIP1 8 и PALB2 9 имеют проверенную влияние на рак шейки матки и рака молочной железы, соответственно. Кроме того, два других "умеренного риска" гены предрасположенности рака молочной железы, ATM и CHEK2, также могут быть изучены обычно 10.
Исходя из этих исследований, мы решили разработать протокол для анализа 11 генов (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, Rad50, RAD51C, RAP80, и TP53) у 24 пациентов одновременно, используя очень простой и относительно быстрый протокол на основе транспозазы технологии, с обогащением и секвенирования по средней пропускной устройства. Спасибоэтой методике, то последовательность полные гены от начала промотора до конца 3'-UTR, для RAP80, для которых интронного область 2500 п.н. не была покрыта (CHR5: 176,381,588-176,390,180) исключением. Это представляет в общей сложности около 1000300 б.п. учился с 2734 зондов. Обычно, BRCA1 и BRCA2 экзонных последовательности анализируются Sanger секвенирования, которая нуждается в 1,5 месяцев меньше чем за 20 больных. В соответствии с настоящим протокола (рисунок 1), в то же время, могут быть проанализированы 11 полные гены более 75 пациентов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Оценка гДНК (геномная ДНК) Выход
- Количественно недавно извлечены гДНК перед приготовлением библиотеке. Используйте метод флуорометрического оценки доходности количественно нетронутыми гДНК (избежать с помощью спектрофотометра для оценки доходности гДНК). Измерьте (260/280 нм) соотношение и убедитесь, что он находится между 1,8 и 2 Примечание: 50 нг гДНК необходимы для эксперимента.
2 гДНК Обогащение: День 1, Утро
- Перед началом
- Из комплекта по обогащению ДНК (см таблицу материалов / оборудования), оттепель буфера ДНК (TD) и фермент ДНК (TDE1) решений на льду. По крайней мере, за 30 минут до использования, принести очистки магнитных шариков и остановить целевую (ST) буфер до комнатной температуры (RT). Добавить 20 мкл образца гДНК на 2-2,5 нг / мкл непосредственно в 96-луночный планшет, 1 также на образец. ВАЖНО: Используйте положительный контроль для проверки протокол (образец с известным изменением последовательности).
- Tagmentation
- МIX все реагенты тщательно, перевернув 5x, и спин вниз кратко. При комнатной температуре добавляют 25 мкл TD буфера в каждую лунку, содержащую 50 нг (20 мкл) гДНК, а затем 5 мкл буфера TDE1. Установите пипеткой 50 мкл, мягко пипетки весь объем вверх и вниз 10 раз.
- Закройте планшет клейкой пленкой и центрифуги в течение 1 мин при 280 х г при 20 ° С. Затем поместите пластину в амплификаторе (крышку нагревали при 100 ° C) и выполните следующую программу: 55 ° C в течение 5 мин и 10 ° C в течение неограниченного времени.
- Во время этой инкубации подготовить лист с образцом с программным обеспечением Эксперимент Менеджер определить индексы, которые будут использоваться.
- Tagmentation Очистка
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение. Будьте очень осторожны.- Проверьте отсутствие осадка в очистных магнитных шариков и ST буфера. Если осадки присутствуют, разогреть решения в руках. Оттепель буфер ресуспендирование (RSB) на льду.
- В РТ, вихревое решение ST и добавить15 мкл в каждую лунку, содержащую образец. Установите пипеткой 65 мкл, мягко пипетки весь объем вверх и вниз 10 раз. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре. Закройте планшет и центрифуги в течение 1 мин при 280 х г при 20 ° С.
- Добавить 52 мкл предварительно смешанных очистки магнитных шариков в каждой лунке. Установите пипеткой 117 мкл, мягко пипетки весь объем вверх и вниз 10 раз. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре. Закройте планшет и центрифуги в течение 1 мин при 280 х г при 20 ° С.
- Удалите клейкую пленку. Поместите 96-луночного планшета на магнитной подставке в течение 2 мин при комнатной температуре. Убедитесь, что супернатант выглядит вполне ясно.
- Подготовьте свежий 80% раствором этанола (в течение 24 образцов, добавляют 2 мл дистиллированной воды до 8 мл этанола). Снимите и выбросьте супернатантную, стараясь не потревожить бусы.
- Удерживая пластину на магнитной подставке, добавить 200 мкл свежеприготовленного 80% этанола в каждую лунку, не нарушая бусы и инкубировать пластины не менее 30 секпри комнатной температуре. Удалите супернатант и повторите этой промывки во второй раз. Убедитесь, что этанол был удален. Дайте высохнуть при комнатной температуре в течение 10 мин или до полного испарения этанола.
- Снять пластину из магнитного стенда и добавить 22,5 мкл RSB буфера. Установите пипетку до 22,5 мкл, мягко пипетки весь объем вверх и вниз 10 раз. Поместите 96-луночного планшета на магнитной подставке и инкубируют в течение 2 мин. Убедитесь, что супернатант выглядит вполне ясно. Аккуратно перенести 20 мкл супернатанта в новом 96-луночного планшета.
Примечание: При желании, определить размер tagmented образцов с помощью анализатора фрагмента. Вместо шагов, указанных выше, использовать электрофореза гель акриламида с высоким разрешением. Фрагменты должны быть между 150 б.п. и 1000 б.п..
- 1-й ПЦР-амплификация
- Оттепель ПЦР мастер смесь, содержащая полимеразы (LP-PMM), индекс 1 грунтовку, и индекс 2 праймеров решения на льду. Подходим комбинированный OF индексы с образца листа Эксперимент Manager. Для мультиплексирования, подготовить различные i7 от индекса 1 (i7, N7xx) для каждого образца.
- В каждую лунку, добавить 20 мкл LP-РММ, 5 мкл индекс 1 и 5 мкл индекса 2 Установите пипеткой 50 мкл, мягко пипетки весь объем вверх и вниз 10 раз. Закройте планшет клейкой microseal фильма. Центрифуга в течение 1 мин при 280 х г при 20 ° С.
- Место пластины в амплификаторе (крышку нагревают при 100 ° С) и программу запуска 1 (Таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: процедура может быть остановлена в этот момент и реакции хранили в течение ночи в амплификаторе или в течение 2 дней между 2 и 8 ° C.
3 гДНК Обогащение: День 1, День
- Перед началом
- Оттепель олиго (ОГО), захват цели буферные 1 (NCT1), и RSB решения на льду. По крайней мере, за 30 минут до использования, принести очистки магнитных шариков в РТ.
- ПЦР Очистка
- Центрифуга пластину с шагом 2,4, в течение 1 мин при 280 х г при 20 ° С.
- При комнатной температуре добавляют 45 мкл смешанного очистки магнитных шариков в каждой лунке. Установите пипетку до 95 мкл, мягко пипетки весь объем вверх и вниз 10 раз. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре. Поместите 96-луночного планшета на магнитной подставке в течение 2 минут при комнатной температуре.
- Убедитесь, что супернатант выглядит вполне ясно. Подготовьте свежий 80% раствором этанола (в течение 24 образцов, добавляют 2 мл дистиллированной воды до 8 мл этанола). Удалите супернатант заботящийся, чтобы не нарушить гранул.
- Удерживая пластину на магнитной подставке, добавить 200 мкл свежеприготовленного 80% этанола в каждую лунку, не нарушая бусы и инкубировать пластины в течение 30 сек при комнатной температуре. Удалите супернатант и повторите этой промывки во второй раз. Убедитесь, что этанол был удален. Дайте высохнуть при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Снять пластину из магнитного стенда и добавить 40 мкл RSB буфера. Установите трубуTTE 40 мкл, мягко пипетки весь объем вверх и вниз 10 раз.
- Поместите 96-луночного планшета на магнитной подставке и инкубируют в течение 2 мин. Верхний слой должен появиться совершенно ясно. Аккуратно перенести 38 мкл супернатанта в новый 96-луночный планшет.
- Определить доходность каждого образца на более флуориметрическим методом. Это первая часть протокола будут проверяться, если начисленные урожайность от 30 до 50 нг / мкл.
- 1-й Гибридизация
- Бассейн до 12 выборок в бассейне на этой стадии путем смешивания 500 нг каждого образца в новом 96-луночного планшета. Убедитесь, что окончательный объем каждого бассейна не превышает 40 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости, уменьшить объем бассейнов с помощью вакуумного концентратора устройство при комнатной температуре (Внимание: концентрация ДНК не могут быть изменены при нагревании, даже при 30 ° С, как отопление приводит к деградации ДНК). Регулировка конечного объема 40 мкл путем добавления раствора RSB. - Тщательно перемешайтеРешение NCT1. Для каждой лунке, содержащей 40 мкл объединенных образцов ДНК, добавить 50 мкл NCT1, и 10 мкл CSO. Установите пипеткой 100 мкл, мягко пипетки весь объем вверх и вниз 10 раз. Печать тарелку и центрифуги в течение 1 мин при 280 х г при 20 ° С.
- Место пластины в амплификаторе (крышку нагревают при 100 ° С) и программу запуска 2 (Таблица 1).
- Бассейн до 12 выборок в бассейне на этой стадии путем смешивания 500 нг каждого образца в новом 96-луночного планшета. Убедитесь, что окончательный объем каждого бассейна не превышает 40 мкл.
4 гДНК Обогащение: День 2, Утро
- Перед началом
- Из комплекта по обогащению ДНК (см таблицу материалов / оборудования) оттепели 2 N NaOH (HP3), цель элюирование буфер 1 (ET1), задачи буфера для элюции 1 ET2, стрептавидиновой магнитных шариков (SMB), промывочный раствор 1 (WS1), мытье Решение 2 (WS2), моющий раствор 3 (WS3), решения ОГО, и NCT1 в РТ.
- 1-й Гибридизация Wash
- Извлеките 96-луночного планшета с амплификатор и центрифуги 1 мин при 280 х г при 20 ° С. Удалите клейкую крышку очень сторожныLLY.
- Перенести 100 мкл реакционной смеси от пластины к новому MIDI 96-луночного планшета и добавляют 250 мкл раствора хорошо перемешивали SMB. Установите пипеткой 350 мкл, мягко пипетки весь объем вверх и вниз 10 раз. Уплотнение пластину и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Центрифуга в течение 1 мин при 280 х г при 20 ° С, снимите клейкую уплотнения и поместите пластину на магнитной подставке в течение 2 мин. Убедитесь, что супернатант выглядит вполне ясно. Удалите супернатант и удалить пластину из магнитного стенде.
- Добавить 200 мкл хорошо смешанный раствор WS1 в хорошо содержащих бисером. Установите пипеткой 200 мкл и осторожно пипеткой весь объем вверх и вниз 15х избегая образования пузырьков / пены.
- Место пластины на магнитной подставке в течение 2 мин. Убедитесь, что супернатант выглядит вполне ясно. Удалите супернатант и удалить пластину из магнитного стенде.
- Добавить 200 мкл хорошо смешанный раствор WS2 в скважинах Контатка бусы. Установите пипеткой 200 мкл и осторожно пипеткой весь объем вверх и вниз 15x избежать образования пузырей / пены.
- Место пластины на магнитной подставке в течение 2 мин. Убедитесь, что супернатант выглядит вполне ясно. Удалите супернатант и удалить пластину из магнитного стенде.
- Добавить 200 мкл хорошо смешанный раствор WS2 в лунки, содержащие шарики. Установите пипеткой 200 мкл и осторожно пипеткой весь объем вверх и вниз 15x.
- Передача весь объем в новом 96-луночного планшета. Печать тарелку и поместите пластину в амплификаторе (крышка нагревали при 100 ° C). Запустите амплификаторе при 42 ° С в течение 30 мин.
- Imediately разместить тарелку на магнитной подставке в течение 2 мин. Убедитесь, что супернатант выглядит вполне ясно. Снять уплотнение и сразу отбросить все супернатант. Тогда, удалить пластину из магнитного стенде.
- Добавить 200 мкл WS2 в лунки, содержащие шарики. Установите пипетку до 200мкл и осторожно пипеткой весь объем вверх и вниз 15x избежать образования пузырей / пены. Печать тарелку и поместите пластину в амплификаторе (крышка нагревали при 100 ° C). Запустите амплификаторе при 42 ° С в течение 30 мин.
- Сразу же место пластину на магнитной подставке в течение 2 мин. Убедитесь, что супернатант выглядит вполне ясно. Снять уплотнение и сразу отбросить все супернатант. Тогда, удалить пластину из магнитного стенде.
- Добавить 200 мкл хорошо смешанный раствор WS3 в лунки, содержащие шарики. Установите пипеткой 200 мкл и осторожно пипеткой весь объем вверх и вниз 15x.
- Место пластины на магнитной подставке в течение 2 мин. Убедитесь, что супернатант выглядит вполне ясно. Откажитесь все супернатант и удалить пластину из магнитного стенде.
- Повторите WS3 мыть второй раз.
- После удаления супернатанта, запечатать пластины и кратко центрифуги снести остаточный супернатант. Поместите пластину намагнитный стенд в течение 2 мин. Откажитесь от остаточного супернатант.
- В 0,2 мл пробирку, перемешивают 28,5 мкл ЕТ1 и 1,5 мкл растворов HP3. Эта смесь в течение 1 бассейн, если больше бассейны, получают, умножают эти объемы на количество пулов, приготовленных.
- Снять пластину из магнитного стенде. Добавить 23 мкл полученной выше смеси. Установите пипеткой 23 мкл и осторожно пипеткой весь объем вверх и вниз 15x. Печать тарелку и оставьте на 5 минут при комнатной температуре. Центрифуга в течение 1 мин при 280 х г при 20 ° С.
- Место пластины на магнитной подставке в течение 2 мин. Убедитесь, что супернатант выглядит вполне ясно. Удалите клейкую пленку и передачи 21 мкл супернатанта к новому 96-луночного планшета.
- Добавить 4 мкл раствора ET2 в каждую лунку. Установите пипеткой 25 мкл и осторожно пипеткой весь объем вверх и вниз 10 раз и заклеить плашки.
ПРИМЕЧАНИЕ: процедура может быть остановлена в этот момент и реакции храниться до 7 дней при температуре от -15 ° С. Если пластина заморожены, полностью оттаять перед началом 2-й гибридизации.
- 2-й Гибридизация
- Центрифуга пластину в течение 1 мин при 280 х г при 20 ° С. Удалите клейкую пленку и добавить 50 мкл NCT1 10 мкл CSO и 15 мкл ПЦР воду, содержащую до 25 мкл библиотеки. Установите пипеткой 100 мкл и осторожно пипеткой весь объем вверх и вниз 10 раз.
- Печать тарелку и центрифуги в течение 1 мин при 280 х г при 20 ° С.
- Место пластины в амплификаторе (крышку нагревают при 100 ° С) и программу запуска 2 (Таблица 1).
5 гДНК Обогащение: День 2, Во второй половине дня
- Перед началом
- Оттепель ET1, ET2, SMB, WS1, WS2, WS3 и HP3 решения при комнатной температуре гибридизации стирки. Из комплекта по обогащению ДНК, оттепель ПЦР мастер микс, содержащий полимеразы (TC-PMM), грунтовки коктейль ПЦР (PPC), и RSB решения на льду для ПЦР-амплификации.
- 2-й Гибридизация Wash
- Следуйте точно такой же протокол, что и для 4,2 - 1 м гибридизации стирки.
- ПЦР-амплификация
- В новом 96-луночного планшета, смешивают 20 мкл элюции с шагом 5,2, 25 мкл TC-РММ, и 5 мкл КПП. Установите пипеткой 50 мкл и осторожно пипеткой весь объем вверх и вниз 10 раз. Печать тарелку и центрифуги в течение 1 мин при 280 х г при 20 ° С.
- Место пластины в амплификаторе (крышку нагревают при 100 ° С) и программу запуска 3 (Таблица 1).
6 гДНК Обогащение: День 3
- Перед началом
- Оттепель RSB решение на льду. По крайней мере, за 30 минут до использования, принести очистки магнитных шариков в РТ.
- ПЦР Очистка
- Центрифуга тарелку с шага 5.3 в течение 1 мин при 280 х г при 20 ° С, и снимите клейкую крышку.
- В РТ, добавить 90 мкл рreviously смешивается очистки магнитных шариков в каждой лунке. Установите пипетку до 140 мкл, мягко пипетки весь объем вверх и вниз 10 раз. Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре. Поместите 96-луночного планшета на магнитной стоять в течение 5 минут при комнатной температуре. Убедитесь, что супернатант выглядит вполне ясно.
- Подготовьте свежий 80% раствором этанола (в течение 2 образцов, добавьте 200 мкл дистиллированной водой до 800 мкл этанола). Удалите супернатант заботящийся, чтобы не нарушить гранул.
- Удерживая пластину на магнитной подставке, добавить 200 мкл свежеприготовленного 80% этанола в каждую лунку, не нарушая бусы и инкубировать пластины в течение 30 сек при комнатной температуре. Удалите супернатант и повторите этой промывки еще раз. Убедитесь, что этанол был удален. Дайте высохнуть при комнатной температуре в течение 15 мин или до полного испарения этанола в то время как пластина на магнитной подставке.
- Снять пластину из магнитного стенда и добавить 30 мкл RSB буфера. Установите пипеткой 30 мкл, и осторожно пипеткой тон весь объем вверх и вниз 10 раз. Инкубируйте в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Место пластины 96-а на магнитной подставке и инкубировать 5 мин или до супернатант выглядит вполне ясно. Аккуратно перенести 28 мкл супернатанта в новый 96-луночный планшет (пластинчатого типа: TCY).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура может быть остановлена на данном этапе и реакции хранить при -15 ° С в течение 7 дней.
- Библиотека Валидация и Количественное
- Определения качества библиотеки с помощью анализатора фрагмента. Гель-электрофорез акриламида высокого разрешения может быть использован для замены описанные выше шаги, но не рекомендуется. Фрагменты должны быть между 150 б.п. и 1000 б.п..
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется: Количественная библиотеку КПЦР для получения наилучшего числа кластеров во секвенирования. - В качестве эталона, использовать проверенную библиотеку (2 Нм). Если первая библиотека готовится, использовать фаг PhiX ДНК (10 нМ), предусмотренное калибровки sequencчисле устройство.
- Готовят серийные разведения положительного контроля, чтобы получить 7 баллов по 20, 16, 8, 6, 4, 2 и 1 вечера в EBT (EB элюирование буфера + 0,1% Твин-20). Развести библиотеку интерес в 1/1000 и 1/2000. Каждая точка должна быть проанализирована в трех экземплярах.
- Подготовьте следующую смесь (умножить объемы по количеству скважин используется): для 1 а, добавить 10 мкл SYBR Green содержащие КПЦР основной смеси (2x), 0,2 мкл прямого праймера (10 мкм, AATGATACGGCGACCACCGAGAT), 0,2 мкл обратного праймера (10 мкМ, CAAGCAGAAGACGGCATACGA), и 7,6 мкл ПЦР сорта воды.
- После смешивания, сместить в 96-луночный планшет, 18 мкл смеси в каждую лунку и 2 мкл положительного контроля и библиотеки разведений. Печать тарелку и центрифуги в течение 1 мин при 280 х г при 20 ° С. Затем поместите пластину в количественном ПЦР термоциклер и выполнение программы 4 (Таблица 1).
- Проанализируйте результаты как обычной абсолютной количественной получать суммы дохода по каждой лibrary. Преимущество количественной ПЦР является то, что только количественно ДНК, которые будут взаимодействовать с проточной ячейки.
Примечание: Не следует использовать флуориметрического количественное определение ДНК в связи с наличием миметиков молекул ДНК в одного из реагентов. Этот метод количественного бы переоценить библиотеки доходность и, следовательно, недооценивают счет кластеризации.
- Определения качества библиотеки с помощью анализатора фрагмента. Гель-электрофорез акриламида высокого разрешения может быть использован для замены описанные выше шаги, но не рекомендуется. Фрагменты должны быть между 150 б.п. и 1000 б.п..
- Секвенирование Запуск
- Развести каждый библиотеки в 4 нМ в конечном объеме 30 мкл буфера для элюции (EB), и объединить все библиотеки и хорошо перемешать.
- Подготовка свежий раствор 0,2 N NaOH в EB буфера и перемешивают 10 мкл этого раствора NaOH с 10 мкл объединенных библиотек. Все хорошо перемешать и инкубировать точно 5 мин при комнатной температуре.
- После 5 мин, сразу добавить 980 мкл гибридизации буфера (от секвенирования картриджа) и хорошо перемешать. Затем смешать 400 мкл этой смеси с 600 мкл буфера гибридизации. Все хорошо перемешать и перенести 600 мкл в картридже 300 цикла (2 х 150) для инъекции 8вечера. Запуск последовательности.
Анализ 7. данных
- После того, как устройство обработки данных, передачи .bam и .vcf файлы на новый компьютер.
ПРИМЕЧАНИЕ: фрагментация транспозазу включает следы. Следовательно, программа автоматически обрезает эти данные. - Соберите генетические вариации, полученные при анализе устройства.
- Анализ экспортируемые файлы (.bam, .vcf) с другим программным обеспечением (Аламут), следуя инструкциям производителя. Тогда, сравнить генетические вариации, полученные с обоих анализов. Только вариации выявляется дважды считаются присутствует.
Таблица 1 Условия ПЦР
| Программа | Температура | Время | Кол. повторов | |||
| 1 | 72 ° C | 3 мин | 1 | 98 ° С | 30 сек | 1 |
| 98 ° С | 10 сек | 10 | ||||
| 60 ° С | 30 сек | |||||
| 72 ° C | 30 сек | |||||
| 72 ° C | 5 мин | 1 | ||||
| 10 ° С | неограниченное | |||||
| 2 | 95 ° C | 10 мин | 1 | |||
| 93 ° C | 1 мин | 1 | ||||
| 91 ° C | 1 мин | 1 | ||||
| 89 ° C | 1 мин | 1 | ||||
| 87 ° C | 1 мин | 1 | ||||
| 85 ° С | 1 мин | 1 | ||||
| 83 ° С | 1 мин | 1 | ||||
| 81 ° C 1 мин | 1 | |||||
| 79 ° С | 1 мин | 1 | ||||
| 77 ° C | 1 мин | 1 | ||||
| 75 ° C | 1 мин | 1 | ||||
| 71 ° C | 1 мин | 1 | ||||
| 69 ° С | 1 мин | 1 | ||||
| 67 ° С | 1 мин | 1 | ||||
| 65 ° С | 1 мин | 1 | ||||
| 63 ° C | 1 мин | 1 | ||||
| 61 ° С | 1 мин | 1 | ||||
| 59 ° С | 1 мин | 1 | ||||
| 58 ° С | 1 мин | 16-18 ч | ||||
| 3 | 98 ° С | 30 сек | 1 | |||
| 98 ° С | 10 сек | 10 | ||||
| 60 ° С | 30 сек | |||||
| 72 ° C | 30 сек | |||||
| 72 ° C | 5 мин | 1 | ||||
| 10 ° С | неограниченное | |||||
| 4 | 95 ° C | 10 мин | 1 | |||
| 95 ° C | 15 сек | 40 | ||||
| 60 ° С | 1 мин | |||||
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Образец КК Результаты
Способность этого метода для определения последовательности генов-мишеней на основе качества гДНК (фиг.2А) и качества шаге tagmentation. Если tagmentation не является достаточным (фиг.2В, верхняя панель), секвенирование не будет удовлетворительным. Как упоминалось выше, после очистки tagmentation, гДНК следует tagmented на фрагменты из 150 п.о. до 1000 п.о. с большинством фрагментов около 300 пар оснований (фиг.2В, нижняя панель).
В конце библиотеки подготовки, библиотека качество проверяется с помощью Bioanalyser. Полученный профиль должен быть примерно таким же, как после tagmentation но с более высокими номерами фрагментов (Рисунок 2C). Если библиотека качество не совпадает с фиг.1С, последовательности не должны быть выполнены.
После секвенирования запускается наСеквенирование устройство, оценка кластеризации доступна после 9 циклов и должна быть между 800 000 и 1100000 кластеров / мм (Рисунок 3А). Если это число меньше, секвенирование не будет удовлетворительным, особенно в глубине чтения. Если она выше, изображения будут размыты (3В), и ни один анализ не будет сделано в связи с невозможностью дифференцировать кластеров.
В конце концов, важно, чтобы проверить счет качества. Следуя протокол описано выше, оценка качества в перспективе будет соответствовать Рисунок 4. Качество секвенирования представлена Q-счетом (Q-30). Чтобы проверить эксперимент, по крайней мере, около 75% последовательностей (кластеров) должны иметь Q-счет выше или равно 30.
Секвенирование Результаты
Этот эксперимент был предназначен для изучения конституционных генетические отклонения. В этом случае, генетические аномалии является прESENT на 50% в геноме. В связи с этим, глубина последовательности не очень важен. При этом мы готовы и секвенировали одновременно 2 библиотеки 12 пациентов в течение 11 полных генов. Чтобы получить высокую глубину секвенирования, количество мультиплексированных пациентов должна быть уменьшена. Как гДНК обогащение на основе захвата зондов, обогащение не является однородным (фиг.5). С нашего протокола, мы сгенерировали около 6 Гб читает, вызывая средний охват 150 читает для каждой базы, с минимум 20 и максимум 330 читает. Эти чтения глубины в соответствии с использованием NGS в клинической практике 11. Несмотря на неоднородность глубине чтения, вероятно, в связи с гДНК обогащения путем захвата, а не основным перегруппировки генов, важно отметить, что Q-счет был всегда превосходит 30 (Рисунок 5), что подтверждает секвенирование.
Тем не менее, важно, чтобы проверить эту технологию путем сравнения результатаы получены с результатами, полученными с Sanger последовательности. В 17 пациентов секвенированных обоими Sanger секвенирования (кодирующих последовательностей генов BRCA1 и BRCA2) и технологии, основанной транспозазы, мы обнаружили те же самые 330 генетических вариаций (SNP и мутации). В качестве примера, точка мутации в гене BRCA1 (фиг.6 слева) и удаление 4 оснований в гене BRCA2 (фиг.6 справа) были обнаружены как Sanger и транспозазу на основе методов. Как BRCA1 на обратной цепи хромосомы 13, важно отметить, что необходимо дополнить (но не инвертировать), полученного последовательность, тогда как для BRCA2 (по прямой цепи), полученной последовательности не должны быть дополнены . Как показано на рисунке 5, технологии NGS дает сайта частоту генетической изменчивости, в то время как метод Sanger нет. Кроме того, специально для INDEL вариаций, интерпретация легче с НГS технология. Как показано на рисунке 6 прямо, вариации INDEL последовательности появляются как яичницы electropherogram, который нуждается в прямой и обратной последовательности, чтобы расшифровать вставлен или удален последовательность. С анализа NGS, вставленный или удаленный последовательность определяется непосредственно, тем самым уменьшая риск неправильного толкования. Наконец, технология, основанная транспозаза позволило нам проанализировать большее количество генов-мишеней, и мы нашли много новых последовательностей генетической изменчивости, которые не были охвачены Sanger секвенирования. Эти результаты будут опубликованы в другом месте.
Рис.1 Принципиальная рабочий процедуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2 Контроль качества до и после библиотеки подготовки. А. Спектрофотометрический профиль гДНК что можно безопасно использовать для tagmentation. Выход ДНК должна быть выше, чем 5 нг / мкл, 260/280 и 260/230 отношения должны быть выше 1,8 и 2, соответственно. Б. Фрагмент анализатор профили tagmented гДНК. Верхняя панель представляет недостаточно tagmented гДНК. Нижняя панель показывает совершенно tagmented образец. С. Фрагмент профиля анализатора подготовленной библиотеки как раз перед секвенирования запуска. Размер фрагмента такой же, как tagmented гДНК (B, нижней панели), но с усиленным суммы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
> 
Рисунок 3 Проверка поколение кластера. А. Скриншот из секвенирования устройства во время бега. Плотность кластера должна быть между 800 и 1000 К / мм ². Б. Разные изображения соответствуют низкой плотности (верхняя панель), высокой плотности (нижняя панель) и совершенной плотностью (средняя панель). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры .
Рисунок 4 Проверка Q-счет. В конце пробега, подтверждено секвенирования должны иметь не менее 75% создаваемых кластеров с Q-счетом превосходит 30.JPG "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5 Представление данных по охвату и их соответствующее Q-оценка. Глубина чтения неоднородна по всей покрытой гена. Тем не менее, Q-оценка крытых регионов всегда превосходит Q-30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Фигура 6. Представитель Результаты, полученные с Sanger секвенирования и с транспозазы основе технологии. Все генетические вариации, наблюдаемые с Sanger секвенирования были Detected с технологией транспозазы основе. В то время как точечные мутации легко интерпретировать, INDEL изменения иногда довольно трудно изучать с помощью метода Sanger. С транспозазы основе технологии, связанные со средней пропускной устройства, INDEL изменения просты, чтобы обнаружить. Тем не менее, важно отметить, что необходимо дополнить (но не инвертировать) получены последовательности, когда ген-мишень находится на минус нити (здесь гена BRCA1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Широкое использование устройств и технологий NGS предоставил новые возможности в изучении рака и генетических нарушений. В дополнение к целой секвенирования генома или РНК последовательности, анализ большого количества выбранных гДНК последовательностей в многочисленных пациентов одновременно предлагает большие перспективы в диагностике. Здесь, мы разработали специфический дизайн (предоставляется по запросу), используя технологию Nextera учиться 11 генов полной у 24 пациентов одновременно со средней пропускной последовательности устройства (таблица материаловедения / Оборудование). Этот протокол позволяет быстро создавать данных, что позволяет быстро реагировать на озабоченности пациентов с низким риском ошибки. Как показано на рисунке 6, все генетические вариации, обнаруженные с Sanger секвенирования были также обнаружены с помощью подготовки комплекта транспозазу основе. Этот метод является надежным и легко интерпретировать, особенно для сложных INDEL изменений, которые анализируются непосредственно. Тем не менее, важноотметить, что для генов, расположенных в минус нити, необходимо дополнить (без вращения) нуклеотидов. Настоящая работа была проведена с дизайном для анализа 11 полных генов, но протокол то же самое независимо от выбранного дизайна. Транспозазу основе технологии также могут быть использованы для библиотеки препарата из дальнобойных продуктов ПЦР 12. Действительно, алгоритм (разработан производителем) использованы для проектирования (Сайт производителя инструмента, табл материалов / оборудования) специально предназначены для этого протокола. В дополнение к технологии транспозазу основе, две другие механизмы фрагментации ДНК до библиотеки подготовки также доступны: механическая фрагментация и ферментативная фрагментация. Фрагментация Механическая ДНК является воспроизводимым, но нуждается в ультразвукового, и подготовка библиотека является более дорогим и более трудоемким. Фрагментация Ферментативный ДНК часто вызывает проблемы для захвата ДНК вследствие местах сайта рестрикции, в результатев отсутствие покрытия последовательности-мишени. Тем не менее, каждая стратегия для фрагментации ДНК имеет свои преимущества и недостатки, но, кажется, дает довольно схожие результаты, по крайней мере, на большие расстояния фрагментации ПЦР продукта 13. Использование нового фермента коктейль, казалось, обеспечивают те же результаты, что и полученные с фрагментацией механическая ДНК 14. Транспозазу основе технологических потребностей высокого качества ДНК (не применимо к ДНК, извлеченной из FFPE тканей). Кроме того, активность транспозазы необходим фрагменты из более чем 300 б.п., что предполагает, что фрагменты интерес должен быть длиннее этой длины. Эта специфика объясняется необходимость высококачественного, не-фрагментированной ДНК.
До сих пор, генетические вариации в генах BRCA1 и BRCA2 были изучены в семейной рака груди и яичников. Тем не менее, участие BRCA генов, и особенно BRCA2, теперь подозревается в других раковых заболеваний, в частности, в поджелудочной железе 15 простаты16, и яичка рака 17. Генетического изменения PALB2, партнера BRCA генов, также связан с раком поджелудочной железы 18. Кроме того, недавно выяснилось, что пациенты укрывательство BRCA мутации, и в меньшей степени PALB2 мутаций, показал лучший ответ их поджелудочной железы к ингибиторам PARP 19. Как BRCA1, BRCA2, и PALB2 связаны с семейной риском рака, и, возможно, связано с восприимчивостью к специфической терапии, представляется важным, чтобы исследовать BRCA1 и BRCA2 партнеров в скрининге для семейного риска рака и скрининга для ответа лечения рака.
Из этих данных, анализ ремонтных связанных генов перерыва ДНК представляется важным не только для скрининга восприимчивости, но и для предполагаемого показателя ответной реакции на лечение. Кроме того, полный анализ гена предложено с этим протоколом может COVER все изменения, которые могут быть врожденной присутствует (присутствуют и в раковых клетках), такие как мутации в промоторе, сайтов сплайсинга или регуляторных сайтов сплайсинга интронов, расположенных в. На сегодняшний день, изменения в последовательности генов некодирующих не были изучены в глубину, но развитие генома исследования ассоциации может выделить важные функции этих последовательностей.
В заключение, дизайн транспозаза основе разработаны в данной работе является интересным способом исследовать генетические аномалии в генах предрасположенность к раку, участвующих в репарации повреждений ДНК. Возможность упорядочить 11 полных гены 24 пациентов одновременно является важным преимуществом по сравнению с методом секвенирования Sanger, что вполне сложная техника для скрининга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well Plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Manufacturer website tool |
References
- Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
- Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
- Cox, D. G., et al. Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers. Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).
- Maia, A. T., et al. Effects of BRCA2 cis-regulation in normal breast and cancer risk amongst BRCA2 mutation carriers. Breast Cancer Res. 14 (2), 63 (2012).
- Anczuków, O., et al. BRCA2 deep intronic mutation causing activation of a cryptic exon: opening toward a new preventive therapeutic strategy. Clin. Cancer Res. 18 (18), 4903-4909 (2012).
- Brewster, B. L., et al. Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3'UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site. Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).
- Ma, X. D., et al. First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer. Gene. 524 (2), 208-213 (2013).
- Haanpää, M., Pylkäs, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families. BMC Med. Genet. 14, 82 (2013).
- Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation. Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).
- Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice. Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).
- Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing. J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).
- Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing. Plos One. 6, e28240 (2011).
- de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borràs, E., Mañé, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing. Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).
- The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers. J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).
- Levy-Lahad, E., Friedman, E. Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).
- Risch, H. A., et al. Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada. J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).
- Slater, E. P., et al. PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families. Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).
- Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W. BRCA and pancreatic cancer. J.O.P. 14 (4), 325-328 (2013).
