Abstract
השימוש הנרחב בדור הבא של הרצף נפתח אפיקים חדשים לחקר סרטן ואבחון. NGS יביא כמויות עצומות של נתונים חדשים על הסרטן, ובמיוחד סרטן גנטיקה. ידע נוכחי ותגליות עתידיות יעשו את זה צריך ללמוד מספר עצום של גנים שיכולים להיות מעורב בנטייה גנטית לסרטן. בהקשר זה, פיתחנו עיצוב Nextera ללמוד 11 גנים שלמים מעורבים בתיקון נזק לדנ"א. פרוטוקול זה פותח כדי ללמוד בבטחה 11 גנים (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, וTP53) מאמרגן ל3'-UTR ב24 מטופלים בו זמנית. פרוטוקול זה, המבוסס על טכנולוגיית transposase והעשרת gDNA, נותן יתרון גדול במונחים של זמן להודות אבחון הגנטי כדי לדגום ריבוב. פרוטוקול זה ניתן להשתמש בבטחה עם gDNA דם.
Introduction
בשנת 2010, כמעט 1.5 מיליון בני אדם (בעצם נשים) פיתחו סרטן השד ברחבי העולם. ההערכה היא כי 5 עד 10% מהמקרים הללו היו תורשתיים. לפני כמעט 20 שנים, BRCA1 ו BRCA2 זוהו כמעורב בשד תורשתי וסרטן השחלות 1. מאז לפני כ -15 שנים, אזורי קידוד BRCA1 ו BRCA2 היו רצף כדי לקבוע את הנטייה הגנטית לסרטן שד וסרטן השחלה. שינויים בBRCA1 ו BRCA2 מתגלים ב10 עד 20% ממשפחות שנבחרו 2 מצביעים על כך שהניתוח של אזורים אלה אינו מספיק להקרנה יעילה. לאחרונה, ניתוח רצפי קידוד שאינו (אמרגן, אינטרונים, 3-'UTR) של BRCA1 ו BRCA2 הדגיש כי מוטציות חדשות / וריאציות יכולות להיות קשורות לסיכון גבוה יותר לסרטן השד 3-6.
חלבוני BRCA1 ו BRCA2 מעורבים בתיקון הומולוגי רקומבינציה (HHR), אשר הושלם על ידי מספר רב של שותפים 7. בעוד שינויים בBRCA1 או BRCA2 לגרום פגמים בתיקון DNA, שותפים האחרים עשויים גם להשפיע על הסיכון לסרטן השד. השערה זו נראית אומתו מאז BRIP1 8 ויש לי PALB2 9 השפעה מוכחת על סרטן צוואר רחם וסרטן שד, בהתאמה. בנוסף, שני גנים אחרים "מתון בסיכון" לסרטן שד רגישות, כספומט וCHEK2, יכולים להיות גם למדו באופן שגרתי 10.
בהמשך למחקרים הללו, החלטנו לפתח פרוטוקול לנתח 11 גנים (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80, וTP53) ב24 מטופלים בו זמנית באמצעות מאוד קל ויחסית פרוטוקול מהיר המבוסס על טכנולוגיית transposase, עם העשרה ורצף על מכשיר תפוקה בינוני. תודהלטכניקה זו, אנו רצף גנים שלמים כבר מההתחלה של האמרגן לסוף 3'-UTR, פרט לRAP80, שאזור intronic של 2,500 נ"ב לא היה מכוסה (Chr5: 176,381,588-176,390,180). זה מייצג כולל של כ 1000300 נ"ב למד עם 2,734 בדיקות. בדרך כלל, רצפי exonic BRCA1 ו BRCA2 מנותחות סנגר רצף, אשר צריך 1.5 חודשים פחות מ 20 חולים. עם הפרוטוקול הנוכחי (איור 1), באותו הזמן, 11 גנים שלמים יותר מ75 חולים יכולים להיות מנותחים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
.1 הערכת gDNA תשואה (הדנ"א הגנומי)
- לכמת חילוץ טרי gDNA לפני ההכנה של הספרייה. השתמש בשיטת הערכת תשואת fluorometric לכמת gDNA שלם (להימנע משימוש בספקטרופוטומטר להערכת תשואת gDNA). מדוד את היחס (260/280 ננומטר) ולוודא שהוא בין 1.8 ו -2 הערה: 50 ng של gDNA נדרש לצורך הניסוי.
.2 GDNA העשרה: יום 1, בוקר
- לפני שמתחיל
- מערכת העשרת DNA (ראה טבלה של חומרים / ציוד), הפשרת חיץ DNA (TD) ופתרונות אנזים DNA (TDE1) על קרח. לפחות 30 דקות לפני השימוש, להביא חרוזים מגנטיים טיהור ולהפסיק היעד (ST) חיץ לטמפרטורת חדר (RT). הוסף 20 μl של מדגם gDNA ב2-2.5 ng / μl ישירות לתוך צלחת 96 היטב, 1 גם לדגימה. חשוב: השתמש בבקרה חיובית כדי לאמת את הפרוטוקול (לדוגמא עם וריאציה רצף ידועה).
- Tagmentation
- Mix כל ריאגנטים ביסודיות על ידי היפוך 5x, ובקצרה ספין למטה. ב RT, להוסיף 25 μl של חיץ TD היטב כל אחד מכיל 50 ng (20 μl) של gDNA, ולאחר מכן 5 μl של חיץ TDE1. הגדר פיפטה 50 μl, פיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x כל הנפח.
- מכסה את הצלחת עם סרט דבק ו צנטריפוגות 1 דקות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מניח את צלחת thermocycler (הכיסוי מחומם ב100 ° C) ולהפעיל את התכנית הבאה: 55 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו10 מעלות צלזיוס למשך זמן בלתי מוגבל.
- במהלך דגירה זה, להכין את הגיליון לדוגמא עם תוכנת מנהל הניסוי להגדיר מדדים שישמשו.
- Tagmentation טיהור
הערה: שלב זה הוא קריטי. להיות זהיר מאוד.- בדוק על היעדריו של משקע בחרוזים מגנטיים טיהור וחיץ ST. אם משקעים נמצאים, לחמם את הפתרונות בידיים. חיץ הפשרת resuspension (RSB) על קרח.
- ב RT, פתרון ST מערבולת ולהוסיף15 μl לכל דגימה המכילה גם. הגדר פיפטה ל65 μl, פיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x כל הנפח. דגירה של 5 דקות ב RT. מכסה את הצלחת ו צנטריפוגות 1 דקות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס.
- הוספת 52 μl של חרוזים מגנטיים טיהור מעורבות בעבר בכל טוב. הגדר פיפטה ל117 μl, פיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x כל הנפח. דגירה של 10 דקות ב RT. מכסה את הצלחת ו צנטריפוגות 1 דקות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס.
- הסר את הסרט הדביק. מניחים את צלחת 96 היטב על מעמד מגנטי עבור 2 דקות ב RT. ודא שsupernatant מופיע ברור לחלוטין.
- הכן פתרון אתנול 80% טרי (ל24 דגימות, להוסיף 2 מ"ל של מים מזוקקים עד 8 מ"ל אתנול). להסיר ולסלק מטפל supernatant לא להפריע חרוזים.
- תוך שמירה על הצלחת על הדוכן המגנטי, להוסיף 200 μl של מוכן טרי אתנול 80% לכל אחד גם מבלי להפריע חרוזים ודגירה את הצלחת לפחות 30 שניותבטמפרטורת חדר. בטל supernatant וחזור לשטוף זו פעם שנייה. ודא אתנול הוסר. בואו יבש בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות או עד אידוי של אתנול מלא.
- הסר את הצלחת מהדוכן המגנטי ולהוסיף 22.5 μl של חיץ RSB. הגדר את פיפטה ל22.5 μl, פיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x כל הנפח. מניחים את צלחת 96 היטב על הדוכן המגנטי ודגירה של 2 דקות. ודא שsupernatant מופיע ברור לחלוטין. בעדינות להעביר 20 μl של supernatant ב96 גם צלחת חדשה.
הערה: לחלופין, לקבוע את הגודל של דגימות tagmented באמצעות מנתח בר. במקום הצעדים שהוזכרו לעיל, להשתמש בג'ל אלקטרופורזה acrylamide ברזולוציה גבוהה. שברים צריכים להיות בין 150 נ"ב ו -1,000 נ"ב.
- 1 st PCR הגברה
- תערובת אב ההפשרה PCR המכילה פולימראז (LP-PMM), פריימר אינדקס 1, ופתרונות פריימר 2 מפתח על קרח. התאם את o שילובמדדי f עם סדין מדגם מנהל ניסוי. לריבוב, להכין i7 שונה ממדד 1 (i7, N7xx) עבור כל דגימה.
- בכל טוב, להוסיף 20 μl של LP-PMM, 5 μl מדד 1, ו -5 μl מדד .2 הגדר את פיפטה ל50 μl, פיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x כל הנפח. מכסה את הצלחת עם סרט microseal דבק. צנטריפוגה 1 דקות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס.
- מניחים את הצלחת בthermocycler (הכיסוי המחומם ב100 ° C) ולהפעיל תכנית 1 (טבלה 1).
הערה: ההליך ניתן יהיה לעצור בנקודה זו והתגובות מאוחסנות לילה בthermocycler או 2 ימים בין C 2 ו -8 מעלות.
.3 GDNA העשרה: יום 1, אחה"צ
- לפני שמתחיל
- oligos הפשרה (CSO), חיץ לכידת יעד 1 (NCT1), ופתרונות RSB על קרח. לפחות 30 דקות לפני השימוש, להביא חרוזים מגנטיים טיהור לRT.
- טיהור PCR
- צנטריפוגה את הצלחת מהצעד 2.4, 1 דקות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס.
- ב RT, להוסיף 45 μl של חרוזים מגנטיים מעורבת טיהור בכל טוב. הגדר את פיפטה ל95 μl, פיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x כל הנפח. דגירה של 10 דקות ב RT. מניחים את צלחת 96 היטב על מעמד מגנטי למשך 2 דקות ב RT.
- ודא שsupernatant מופיע ברור לחלוטין. הכן פתרון אתנול 80% טרי (ל24 דגימות, להוסיף 2 מ"ל של מים מזוקקים עד 8 מ"ל אתנול). מחק את טיפול לקיחת supernatant לא להפריע גלולה.
- תוך שמירה על הצלחת על הדוכן המגנטי, להוסיף 200 μl של מוכן טרי אתנול 80% לכל אחד גם מבלי להפריע חרוזים ודגירה את הצלחת ל30 שניות בטמפרטורת חדר. בטל supernatant וחזור לשטוף זו פעם שנייה. ודא אתנול הוסר. בואו יבש בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות.
- הסר את הצלחת מהדוכן המגנטי ולהוסיף 40 μl של חיץ RSB. הגדר את הצינורטטי ל40 μl, בעדינות פיפטה כל הנפח למעלה ולמטה 10x.
- מניחים את צלחת 96 היטב על הדוכן המגנטי ודגירה של 2 דקות. Supernatant אמור להופיע ברור לחלוטין. בעדינות להעביר 38 μl של supernatant לתוך צלחת 96 היטב חדשה.
- לקבוע את התשואה של כל דגימה על ידי שיטת fluorimetric. זה חלק הראשון של הפרוטוקול יהיה תוקף אם התשואות העריכו הן בין 30 50 ng / μl.
- 1 st הכלאה
- בריכה עד 12 דגימות לברכה בשלב זה על ידי ערבוב 500 ng של כל דגימה בצלחת 96 היטב חדשה. ודא שהנפח הסופי של כל בריכה לא יעלה על 40 μl.
הערה: במידת צורך, להחליש את עוצמת הקול של בריכות באמצעות מכשיר concentrator הוואקום ב RT (זהירות: הריכוז של DNA לא ניתן לשנות על ידי חימום, אפילו ב30 מעלות צלזיוס כפי שהחימום גורם להשפלת DNA). התאם את הנפח הסופי 40 μl על ידי פתרון הוספת RSB. - לערבב ביסודיותפתרון NCT1. ל40 כל μl היטב המכיל דגימות דנ"א ונקוו, להוסיף 50 μl של NCT1, ו10 μl של CSO. הגדר את פיפטה ל100 μl, פיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x כל הנפח. חותם את הצלחת ו צנטריפוגות 1 דקות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס.
- מניחים את הצלחת בthermocycler (הכיסוי המחומם ב100 ° C) ולהפעיל תכנית 2 (טבלה 1).
- בריכה עד 12 דגימות לברכה בשלב זה על ידי ערבוב 500 ng של כל דגימה בצלחת 96 היטב חדשה. ודא שהנפח הסופי של כל בריכה לא יעלה על 40 μl.
.4 GDNA העשרה: יום 2, בוקר
- לפני שמתחיל
- מערכת העשרת DNA (ראה טבלה של חומרים / ציוד) הפשרה 2 N NaOH (HP3), חיץ elution יעד 1 (ET1), לכוון חיץ elution 1 ET2, חרוזים מגנטיים streptavidin (SMB), פתרון לשטוף 1 (WS1), לשטוף פתרון 2 (WS2), לשטוף פתרון 3 (WS3), פתרונות CSO, וNCT1 ב RT.
- 1 st הכלאה לשטוף
- הסר את צלחת 96 היטב מthermocycler ו1 דקות צנטריפוגות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס. הסר את כיסוי הדבק מאוד carefully.
- העבר את תערובת תגובת 100 μl מהצלחת לצלחת 96 היטב MIDI חדש ולהוסיף 250 μl של פתרון SMB גם vortexed. הגדר את פיפטה ל350 μl, פיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x כל הנפח. חותם את הצלחת ולדגור על RT למשך 30 דקות.
- צנטריפוגה 1 דקות ב280 XG ב 20 ° C, להסיר את החותם דבק ומניח את הצלחת על הדוכן המגנטי למשך 2 דקות. ודא שsupernatant מופיע ברור לחלוטין. בטל supernatant ולהסיר את הצלחת מהדוכן המגנטי.
- הוסף 200 μl של פתרון WS1 מעורב היטב בחרוזים המכילים גם. הגדר את פיפטה ל200 μl ובעדינות פיפטה כל הנפח למעלה ולמטה 15x למנוע את ההיווצרות של בועות / קצף.
- מניחים את הצלחת על הדוכן המגנטי למשך 2 דקות. ודא שsupernatant מופיע ברור לחלוטין. בטל supernatant ולהסיר את הצלחת מהדוכן המגנטי.
- הוסף 200 μl של פתרון WS2 מעורב היטב לתוך conta בארותחרוזים ining. הגדר את פיפטה ל200 μl ובעדינות פיפטה כל הנפח למעלה ולמטה 15x הימנעות היווצרותן של בועות / קצף.
- מניחים את הצלחת על הדוכן המגנטי למשך 2 דקות. ודא שsupernatant מופיע ברור לחלוטין. בטל supernatant ולהסיר את הצלחת מהדוכן המגנטי.
- הוסף 200 μl של פתרון WS2 מעורב היטב לתוך בארות המכילות חרוזים. הגדר את פיפטה ל200 μl ופיפטה בעדינות מעלה ומטה 15x כל הנפח.
- העבר את כל הנפח ב96 גם צלחת חדשה. חותם את הצלחת ומניח את הצלחת בthermocycler (כיסוי מחומם ב100 ° C). הפעל את thermocycler ב42 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- , מייד מניח את הצלחת על הדוכן המגנטי למשך 2 דקות. ודא שsupernatant מופיע ברור לחלוטין. הסר את החותם ולמחוק את כל supernatant מייד. לאחר מכן, הסר את הצלחת מהדוכן המגנטי.
- הוסף 200 μl של WS2 לבארות המכילות חרוזים. הגדר את פיפטה ל200μl ובעדינות פיפטה כל הנפח למעלה ולמטה 15x הימנעות היווצרותן של בועות / קצף. חותם את הצלחת ומניח את הצלחת בthermocycler (כיסוי מחומם ב100 ° C). הפעל את thermocycler ב42 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- מייד מניח את הצלחת על הדוכן המגנטי למשך 2 דקות. ודא שsupernatant מופיע ברור לחלוטין. הסר את החותם ולמחוק את כל supernatant מייד. לאחר מכן, הסר את הצלחת מהדוכן המגנטי.
- הוסף 200 μl של פתרון WS3 מעורב היטב לתוך בארות המכילות חרוזים. הגדר את פיפטה ל200 μl ופיפטה בעדינות מעלה ומטה 15x כל הנפח.
- מניחים את הצלחת על הדוכן המגנטי למשך 2 דקות. ודא שsupernatant מופיע ברור לחלוטין. מחק את כל supernatant ולהסיר את הצלחת מהדוכן המגנטי.
- חזור על WS3 לשטוף בפעם שנייה.
- לאחר הסרת supernatant, לאטום את צנטריפוגות הצלחת ובקצרה לניתץ supernatant השיורי. מניחים את הצלחת עלהמעמד המגנטי עבור 2 דקות. בטל supernatant השיורי.
- בצינור 0.2 מ"ל, לערבב 28.5 μl של ET1 ו1.5 μl של פתרונות HP3. התמהיל הזה הוא בשביל בריכה 1, אם יותר בריכות מוכנות, להכפיל כרכים אלה במספר הבריכות שהוכנו.
- הסר את הצלחת מהדוכן המגנטי. הוספת 23 μl של הבלבול מוכן לעיל. הגדר את פיפטה ל23 μl ופיפטה בעדינות מעלה ומטה 15x כל הנפח. חותם את הצלחת ולהשאיר למשך 5 דקות ב RT. צנטריפוגה 1 דקות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס.
- מניחים את הצלחת על הדוכן המגנטי למשך 2 דקות. ודא שsupernatant מופיע ברור לחלוטין. הסר את סרט ההדבקה ולהעביר 21 μl של supernatant ל96 גם צלחת חדשה.
- הוסף 4 μl של פתרון ET2 היטב כל אחד. הגדר את פיפטה ל25 μl ובעדינות פיפטה כל הנפח למעלה ולמטה 10x ולאטום את הצלחת.
הערה: ההליך ניתן יהיה לעצור בנקודה זו והתגובות לאחסן עד 7 ימים ב-15 ° C. אם הצלחת קפוא, להפשיר לחלוטין לפני שמתחיל הכלאת 2 nd.
- הכלאה 2 nd
- צנטריפוגה הצלחת 1 דקות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס. הסר את סרט ההדבקה ולהוסיף 50 μl של NCT1, 10 μl של CSO, ו15 μl מים כיתה PCR ל25 μl של ספרייה. הגדר את פיפטה ל100 μl ופיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x כל הנפח.
- חותם את הצלחת ו צנטריפוגות 1 דקות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס.
- מניחים את הצלחת בthermocycler (הכיסוי המחומם ב100 ° C) ולהפעיל תכנית 2 (טבלה 1).
.5 GDNA העשרה: יום 2, אחה"צ
- לפני שמתחיל
- הפשירי ET1, ET2, SMB, WS1, WS2, WS3 ופתרונות HP3 ב RT לשטיפת הכלאה. מערכת העשרת DNA, להפשיר פולימראז PCR תערובת האב מכיל (TC-PMM), קוקטייל PCR פריימר (PPC), ופתרונות RSB על קרח להגברת PCR.
- 2 nd הכלאה לשטוף
- בצע את אותו הפרוטוקול בדיוק כפי של4.2-1 לשטוף הכלאת st.
- PCR הגברה
- ב96 גם צלחת חדשה, לערבב 20 μl של elution מצעד 5.2, 25 μl של TC-PMM, ו5 μl של PPC. הגדר את פיפטה ל50 μl ופיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x כל הנפח. חותם את הצלחת ו צנטריפוגות 1 דקות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס.
- מניחים את הצלחת בthermocycler (הכיסוי המחומם ב100 ° C) ולהפעיל תכנית 3 (טבלה 1).
.6 GDNA העשרה: יום 3
- לפני שמתחיל
- פתרון הפשרת RSB על קרח. לפחות 30 דקות לפני השימוש, להביא חרוזים מגנטיים טיהור לRT.
- טיהור PCR
- צנטריפוגה את הצלחת מצעד 5.3 1 דקות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס, ולהסיר את כיסוי הדבק.
- ב RT, להוסיף 90 μl של previously מעורב חרוזים מגנטיים טיהור בכל טוב. הגדר את פיפטה ל140 μl, פיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x כל הנפח. דגירה של 15 דקות ב RT. מניחים את צלחת 96 היטב על מעמד מגנטי עבור 5 דקות ב RT. ודא שsupernatant מופיע ברור לחלוטין.
- הכן פתרון אתנול 80% טרי (ל2 דוגמאות, להוסיף 200 μl של מים מזוקקים ל800 אתנול μl). מחק את טיפול לקיחת supernatant לא להפריע גלולה.
- תוך שמירה על הצלחת על הדוכן המגנטי, להוסיף 200 μl של מוכן טרי אתנול 80% לכל אחד גם מבלי להפריע חרוזים ודגירה את הצלחת ל30 שניות ב RT. בטל supernatant וחזור לשטוף זה עוד פעם אחת. ודא אתנול הוסר. בוא יבש ב RT במשך 15 דקות או עד אידוי של אתנול מלא תוך הצלחת היא על הדוכן המגנטי.
- הסר את הצלחת מהדוכן המגנטי ולהוסיף 30 μl של חיץ RSB. הגדר את פיפטה ל30 μl, ובעדינות פיפטה tהוא כל נפח למעלה ולמטה 10x. דגירה את הצלחת למשך 2 דקות ב RT.
- מניחים את צלחת 96 היטב על הדוכן המגנטי ודגירה של 5 דקות או עד supernatant מופיע ברור לחלוטין. בעדינות להעביר 28 μl של supernatant ל96, גם צלחת (סוג צלחת: TCY) חדש.
הערה: ההליך ניתן יהיה לעצור בשלב זה והתגובות המאוחסנות ב-15 מעלות צלזיוס למשך עד 7 ימים.
- ספריית אימות וכימות
- לקבוע את האיכות של הספרייה על ידי שימוש במנתח בר. ג'ל אלקטרופורזה acrylamide רזולוציה גבוהה עשויה לשמש כדי להחליף את השלבים שהוזכרו לעיל, אך לא מומלצת. שברים צריכים להיות בין 150 נ"ב ו -1,000 נ"ב.
הערה: מומלץ: לכמת את הספרייה על ידי qPCR כדי לקבל את המספר הטוב ביותר של אשכולות במהלך רצף. - כנקודת התייחסות, להשתמש בספריית תוקף (2 ננומטר). אם הספרייה הראשונה היא להיות מוכנה, השתמש בהפאג PhiX DNA (10 ננומטר) הניתן לכיול של sequencing מכשיר.
- הכן דילולים סידוריים של בקרה חיובית כדי להשיג 7 נקודות ב20, 16, 8, 6, 4, 2, וראש הממשלה 1 בEBT (חיץ Tween 0.1% elution EB 20). לדלל את הספרייה של ריבית ב1 / 1,000 ו 1 / 2,000. כל נקודה יש לנתח בשלושה עותקים.
- מכין את התערובת הבאה (הכרכים להכפיל במספר הבארות בשימוש): ל1 גם, להוסיף 10 μl של SYBR ירוק המכיל תערובת אב qPCR (2x), 0.2 μl של פריימר קדימה (10 מיקרומטר, AATGATACGGCGACCACCGAGAT), 0.2 μl של פריימר ההפוכה (10 מיקרומטר, CAAGCAGAAGACGGCATACGA), ו7.6 מים כיתה PCR μl.
- לאחר הערבוב, להדיח בצלחת 96 היטב, 18 μl של תערובת לתוך כל μl היטב ו2 של דילולים שליטה וספרייה חיוביים. חותם את הצלחת ו צנטריפוגות 1 דקות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מניח את הצלחת PCR כמו תכנית thermocycler וריצת 4 (טבלה 1).
- לנתח את התוצאות ככימות מוחלט קונבנציונלי כדי להשיג את התשואה של כל ליטרibrary. היתרון של qPCR הוא שזה רק מכמת DNA שיהיה אינטראקציה עם תא הזרימה.
הערה: אין להשתמש בכימות fluorimetric של DNA בשל נוכחותם של מולקולות DNA כוזבות באחד מהחומרים הכימיים. שיטת כימות זה יהיה להעריך את תשואת הספרייה וכתוצאה מכך להמעיט בערכו ציון קיבוץ באשכולות.
- לקבוע את האיכות של הספרייה על ידי שימוש במנתח בר. ג'ל אלקטרופורזה acrylamide רזולוציה גבוהה עשויה לשמש כדי להחליף את השלבים שהוזכרו לעיל, אך לא מומלצת. שברים צריכים להיות בין 150 נ"ב ו -1,000 נ"ב.
- השקת רצף
- לדלל כל ספרייה ב4 ננומטר בנפח סופי של μl 30 של חיץ elution (EB), וברכה כל הספריות ומערבבים היטב.
- הכן פתרון N NaOH טרי 0.2 במאגר EB ולערבב 10 μl של פתרון NaOH זה עם 10 μl של ספריות ותקווינה. מערבבים היטב דגירה בדיוק 5 דקות ב RT.
- לאחר 5 דקות, להוסיף באופן מיידי 980 μl של חיץ הכלאה (ממחסנית רצף) ומערבבים היטב. לאחר מכן, לערבב 400 μl של תערובת זו עם 600 μl של חיץ הכלאה. מערבבים היטב ולהעביר 600 μl לתוך מחסנית 300 מחזור (2 x 150) להזרקה של 8PM. רצף הפעלה.
ניתוח .7 הנתונים
- ברגע שהמכשיר עבד את הנתונים, להעביר את קבצי .vcf .bam ולמחשב חדש.
הערה: פיצול Transposase משלב עקבות. כתוצאה מכך, התוכנה באופן אוטומטי trims נתונים אלה. - לאסוף וריאציות גנטיות שהושגו עם ניתוח המכשיר.
- ניתוח קבצים מיוצאים (.bam, .vcf) עם תוכנה אחרת (Alamut) על ידי ביצוע הוראות היצרן. לאחר מכן, השווה את הווריאציות הגנטיות שהושגו עם שני הניתוחים. רק וריאציות זוהו פעמיים נחשבות נוכחי.
.1 תנאי PCR שולחן
| תכנית | טמפרטורה | זמן | Num. חזרות | |||
| 1 | 72 מעלות צלזיוס | 3 דקות | 1 | 98 ° C | 30 שניות | 1 |
| 98 ° C | 10 שניות | 10 | ||||
| 60 ° C | 30 שניות | |||||
| 72 מעלות צלזיוס | 30 שניות | |||||
| 72 מעלות צלזיוס | 5 דקות | 1 | ||||
| 10 ° C | ללא הגבלה | |||||
| 2 | 95 מעלות צלזיוס | 10 דקות | 1 | |||
| 93 ° C | 1 דקות | 1 | ||||
| 91 ° C | 1 דקות | 1 | ||||
| 89 ° C | 1 דקות | 1 | ||||
| 87 ° C | 1 דקות | 1 | ||||
| 85 ° C | 1 דקות | 1 | ||||
| 83 ° C | 1 דקות | 1 | ||||
| 81 ° C 1 דקות | 1 | |||||
| 79 ° C | 1 דקות | 1 | ||||
| 77 ° C | 1 דקות | 1 | ||||
| 75 ° C | 1 דקות | 1 | ||||
| 71 ° C | 1 דקות | 1 | ||||
| 69 ° C | 1 דקות | 1 | ||||
| 67 ° C | 1 דקות | 1 | ||||
| 65 מעלות צלזיוס | 1 דקות | 1 | ||||
| 63 ° C | 1 דקות | 1 | ||||
| 61 ° C | 1 דקות | 1 | ||||
| 59 ° C | 1 דקות | 1 | ||||
| 58 ° C | 1 דקות | 16-18 לשעה | ||||
| 3 | 98 ° C | 30 שניות | 1 | |||
| 98 ° C | 10 שניות | 10 | ||||
| 60 ° C | 30 שניות | |||||
| 72 מעלות צלזיוס | 30 שניות | |||||
| 72 מעלות צלזיוס | 5 דקות | 1 | ||||
| 10 ° C | ללא הגבלה | |||||
| 4 | 95 מעלות צלזיוס | 10 דקות | 1 | |||
| 95 מעלות צלזיוס | 15 שניות | 40 | ||||
| 60 ° C | 1 דקות | |||||
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאות QC המדגם
היכולת של שיטה זו כדי לקבוע רצפים של גני המטרה מבוססת על איכות gDNA (איור 2 א) והאיכות של צעד tagmentation. אם tagmentation אינו מספיק (איור 2, פנל עליון), הרצף לא יהיה משביע רצון. כפי שצוין לעיל, לאחר טיהור tagmentation, gDNA יש tagmented לרסיסים מ150 נ"ב ל1,000 נ"ב עם רוב הברים ברחבי -300 נ"ב (איור 2, פנל תחתון).
בסופו של הכנת ספרייה, איכות ספרייה נבדק על ידי שימוש בBioanalyser. הפרופיל שהושג צריך להיות בערך כמו אחרי tagmentation אבל עם מספרים גבוהים יותר של שברים (איור 2 ג). אם איכות ספרייה אינה זהה לאיור 1C, לא צריך להיות מבוצע רצף.
ברגע שהרצף הוא הושק עלמכשיר הרצף, ציון האשכולות זמין לאחר 9 מחזורים וצריך להיות בין 800,000 ו1,100,000 אשכולות / mm² (איור 3 א). אם מספר זה הוא נמוך יותר, הרצף לא יהיה משביע רצון, במיוחד בעומק של קריאה. אם היא גבוהה, התמונות יהיו מטושטשות (איור 3 ב), ולא ניתוח ייעשה בשל חוסר האפשרות להבחין אשכולות.
בסוף הריצה, זה חשוב לבדוק את הציון האיכות. על ידי ביצוע הפרוטוקול המפורט לעיל, ציון האיכות של הריצה יהיה מתאים לאיור 4. איכות רצפים מיוצגת על ידי Q-ציון (Q-30). כדי לאמת את הניסוי, לפחות סביב 75% מרצפים (אשכולות) צריך להיות Q-ציון מעולה או שווה ל 30.
תוצאות רצף
ניסוי זה נועד ללמוד מומים גנטיים חוקתיים. במקרה זה, הפגם הגנטי הוא יחסי ציבורesent ב50% בגנום. בגלל זה, את עומק הרצף הוא לא מאוד חשוב. בזאת, אנו מוכנים והרצף בו זמנית 2 ספריות של 12 חולים ל11 גנים שלמים. כדי להשיג עומק רצף גבוה, מספר החולים מרובבים צריך להיות ירידה. כהעשרת gDNA מבוססת על לכידה על ידי בדיקות, ההעשרה אינה הומוגנית (איור 5). עם הפרוטוקול שלנו, אנחנו שנוצרנו על 6 Gb של קורא, גרימת כיסוי ממוצע 150 של קורא לכל בסיס, עם מינימום של 20 ועד למקסימום של 330 קוראים. מעמקי קריאה אלה בהתאם לשימוש של NGS בפרקטיקה קלינית 11. למרות ההטרוגניות של מעמקי קריאה, ככל הנראה בשל העשרת gDNA על ידי לכידה, ולא הסידור מחדש הגדול של גנים, זה חשוב לציין כי Q-הציון תמיד היה עדיף על 30 (איור 5), וכך אימות הרצף.
עם זאת, חשוב לאמת את הטכנולוגיה על ידי השוואת התוצאהs שהושג עם אלו שהושגו עם סנגר רצף. ב17 חולי רצף על ידי שני סנגר הרצף (קידוד רצפים של BRCA1 ו BRCA2) המבוססת על טכנולוגיית transposase ו, זיהינו את אותו 330 וריאציות גנטיות (SNP ומוטציות). כדוגמא, מוטציה נקודתית בגן BRCA1 (איור 6 משמאל) ומחיקה של 4 בסיסים בגן BRCA2 (איור 6 מימין) התגלו על ידי שני סנגר ושיטות המבוסס על transposase. כBRCA1 הוא על הגדיל ההפוך של כרומוזום 13, חשוב לשים לב כי יש צורך להשלים (אבל לא להפוך) את הרצף שהושג, ואילו עבור BRCA2 (על הגדיל קדימה), הרצף שהושג לא צריך להיות כהשלמה . כפי שצוין באיור 5, טכנולוגית NGS נותנת תדירות משוערת של השונות הגנטיות, ואילו בשיטת סנגר לא. יתר על כן, במיוחד עבור וריאציות indel, הפרשנות היא קלה יותר עם NG טכנולוגית S. כפי שניתן לראות באיור 6 תקין, רצפי הווריאציה indel יופיעו כelectropherogram מקושקשת שצריך קדימה לאחור רצף לפענח את הרצף המוכנס או נמחק. עם ניתוח NGS, הרצף הוכנס או שנמחק ישירות נקבע, ובכך להקטין את הסיכון לפרשנות שגוי. לבסוף, טכנולוגיה מבוססת transposase אפשרה לנו לנתח מספר גדול יותר של גני המטרה, ומצאנו רצפים שונים גנטי רבים חדשים שלא כוסו על ידי סנגר רצף. תוצאות אלו תפורסמנה במקום אחר.
איור 1 עבודה סכמטי של ההליך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ether.within-page = "תמיד"> 
2 בקרות איכות איור לפני ואחרי הכנת ספרייה. פרופיל א spectrophotometric של gDNA שניתן להשתמש בבטחה לtagmentation. תשואת DNA צריכה להיות גבוה מ 5 ng / μl, 260/280 ו260/230 יחסים חייבים להיות עדיפים על 1.8 ו2, בהתאמה. פרופילי מנתח ב 'שבר gDNA tagmented. פנל עליון מייצג tagmented מספיק gDNA. פנל תחתון מציג מדגם tagmented בצורה מושלמת. פרופיל מנתח ג קטע של ספרייה מוכנה ממש לפני השקת רצף. גודל שבר זהה gDNA tagmented (B, פנל תחתון), אבל עם כמות מוגברת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
> 
דור אשכול .3 בדיקת איור. א צילום המסך של המכשיר לקביעת רצף בזמן הריצה. צפיפות אשכול צריכה להיות בין 800 ו -1,000 תמונות שונות K / mm². B. מתאימות לצפיפות נמוכה (פנל עליון), צפיפות גבוהה (פנל תחתון) וצפיפות מושלמת (פנל באמצע). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .
איור 4 בדיקת Q-הציון. בסוף הריצה, רצף תוקף צריך לפחות 75% מאשכולות שנוצרו עם Q-ציון מעולה ל30.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5 נתוני כיסויי ייצוג וQ-הציון המקביל שלהם. עומק הקריאה הוא הטרוגנית לכל אורך הגן המכוסה. אף על פי כן, Q-הציון של אזורים המכוסים הוא תמיד עדיף על Q-30. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
.6 תוצאות נציג נתון שהושגו עם סנגר רצף ועם טכנולוגיה מבוססת transposase. כל הווריאציות הגנטיות שנצפו עם סנגר רצף היו דetected עם הטכנולוגיה מבוססת transposase. ואילו מוטציות נקודה קלות לפרש, שינויי indel הם לפעמים די קשים ללמוד עם שיטת סנגר. עם טכנולוגיה מבוססת transposase הקשורים למכשיר תפוקה בינוני, שינויי indel הם פשוט לגלות. עם זאת, חשוב לשים לב כי יש צורך להשלים (אבל לא להפוך) רצפים מתקבלים כאשר גן המטרה ממוקם על גדיל מינוס (כאן גן BRCA1). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השימוש הנרחב במכשירי NGS וטכנולוגיות סיפקו הזדמנויות חדשות בחקר הסרטן והפרעות גנטיות. בנוסף לרצף הגנום כולו או רצף RNA, הניתוח של כמות גדולה של רצפי gDNA נבחרו בחולים רבים בו זמנית מציע סיכויים רבים באבחנה. כאן, פיתחנו עיצוב ספציפי (זמין על פי דרישה) באמצעות טכנולוגיית Nextera ללמוד 11 גנים שלמים ב24 מטופלים בו זמנית עם מכשיר בינוני רצף תפוקה (טבלה של חומרים / ציוד). פרוטוקול זה מאפשר דור מהיר של נתונים, שמאפשר תגובה מהירה לחששותיהם של חולים עם סיכון נמוך לשגיאה. כפי שמודגם באיור 6, כל הווריאציות הגנטיות שזוהו עם סנגר רצף היו גם זוהו על ידי שימוש בערכת ההכנה מבוסס transposase. שיטה זו היא אמינה וקלה להבנה, במיוחד לשינויי indel מורכבים שנתחו באופן ישיר. עם זאת, חשובלציין כי לגנים ממוקמים בגדיל מינוס, יש צורך להשלים (ללא היפוך) נוקלאוטידים. העבודה הנוכחית נערכה עם עיצוב לניתוח 11 גנים שלמים, אבל הפרוטוקול הוא אותו כל מה שהעיצוב שבחר. גם טכנולוגיה מבוססת Transposase יכולה לשמש להכנת ספרייה ממוצרי PCR לטווח ארוך 12. ואכן, האלגוריתם (שפותח על ידי היצרן) המשמש לעיצוב (הכלי באתר יצרן, ראה טבלה של חומרים / ציוד) מוקדש במיוחד לפרוטוקול זה. בנוסף לtransposase מבוסס טכנולוגיה, שני מנגנונים אחרים של פיצול DNA לפני הכנת ספרייה זמינות גם: פיצול מכאני ופיצול האנזימטית. פיצול DNA מכאני הוא לשחזור אבל צריך ultrasonicator, והכנת ספרייה היא יקרה יותר וזמן רב יותר. פיצול אנזימתי DNA לעתים קרובות גורם לבעיות עבור לכידת DNA בשל מיקומי אתר אנזים הגבלה, וכתוצאה מכךבהעדר כיסוי רצף היעד. אף על פי כן, לכל אסטרטגיה לפיצול DNA יתרונות וחסרונות אבל נראה לי לתת תוצאות די דומות, לפחות לטווח ארוך פיצול מוצר PCR 13. נראה השימוש בקוקטייל אנזים חדש שיספק לאותן תוצאות כמו אלה שהושגו עם פיצול DNA המכני 14. טכנולוגיה מבוססת Transposase צריך DNA באיכות גבוהה (לא ישים עבור DNA שחולץ מרקמות FFPE). יתר על כן, הפעילות של transposase צריך שברים של יותר מ -300 נ"ב, המצביע על כך שברים של עניין חייבים להיות ארוכים יותר מהאורך הזה. סגוליות זה מסביר את הצורך באיכות גבוהה, DNA בלתי מפוצל.
עד עכשיו, וריאציות גנטיות של BRCA1 ו BRCA2 נחקרו בשד משפחתי וסרטן השחלות. עם זאת, מעורבותם של גני BRCA, ובמיוחד BRCA2, כעת חשודה בסוגי סרטן אחרים, במיוחד בלבלב 15, ערמונית16, ואשך סרטן 17. השינוי הגנטי של PALB2, שותף של גני BRCA, קשור גם בסרטן לבלב 18. יתר על כן, זה הופיע לאחרונה כי חולי מחסה מוטציות BRCA, ומוטציות PALB2 מידה פחותה, הראו תגובה טובה יותר של סרטן הלבלב שלהם למעכבי PARP 19. כBRCA1, BRCA2, וPALB2 קשורים לסיכון משפחתי של סרטן, ואולי קשורים ברגישות לטיפולים ספציפיים, נראה חשוב לחקור את שותפי BRCA1 ו BRCA2 בבדיקות סינון לסיכון לסרטן משפחתי ובהקרנה לתגובה לטיפול בסרטן.
מתוך נתונים אלה, נראה הניתוח של גנים הקשורים לתיקון הפסקת DNA להיות חשוב לא רק להקרנה של רגישות, אלא גם לחיווי משוער של תגובה לטיפול. יתר על כן, הניתוח הגנטי המלא מוצע עם פרוטוקול זה יכול COVאה כל השינויים שיכולים להיות מלידה הנוכחית (ובהווה בתאי סרטן), כגון מוטציות באמרגן, אתרי שחבור או אתרי שחבור רגולציה ממוקמים באינטרונים. נכון להיום, שינויים בללא קידוד רצפים של גנים לא נחקרו לעומק, אבל הפיתוח של מחקרי עמותת הגנום יכול לסמן פונקציות חשובות של רצפים אלה.
לסיכום, התכנון מבוסס transposase שפותח בעבודה זו הוא דרך מעניינת לחקור מומים גנטיים בגנים רגישות לסרטן מעורבים בתיקון נזק לדנ"א. האפשרות לרצף 11 גנים שלמים ל24 מטופלים בו זמנית היא יתרון חשוב בהשוואה לשיטה סנגר הרצף, שהיא טכניקה די קשה להקרנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well Plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Manufacturer website tool |
References
- Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
- Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
- Cox, D. G., et al. Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers. Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).
- Maia, A. T., et al. Effects of BRCA2 cis-regulation in normal breast and cancer risk amongst BRCA2 mutation carriers. Breast Cancer Res. 14 (2), 63 (2012).
- Anczuków, O., et al. BRCA2 deep intronic mutation causing activation of a cryptic exon: opening toward a new preventive therapeutic strategy. Clin. Cancer Res. 18 (18), 4903-4909 (2012).
- Brewster, B. L., et al. Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3'UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site. Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).
- Ma, X. D., et al. First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer. Gene. 524 (2), 208-213 (2013).
- Haanpää, M., Pylkäs, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families. BMC Med. Genet. 14, 82 (2013).
- Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation. Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).
- Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice. Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).
- Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing. J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).
- Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing. Plos One. 6, e28240 (2011).
- de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borràs, E., Mañé, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing. Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).
- The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers. J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).
- Levy-Lahad, E., Friedman, E. Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).
- Risch, H. A., et al. Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada. J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).
- Slater, E. P., et al. PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families. Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).
- Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W.
