Abstract
广泛使用的新一代测序开辟了为癌症研究和诊断的新途径。农工商会带来癌症大量的新数据，尤其是癌症遗传学。目前的知识和未来发现将使得有必要研究一种巨大的基因可能涉及遗传因素对癌症的数目。在这方面，我们开发了一个Nextera设计研究11参与DNA损伤修复完整的基因。该协议的开发是为了安全地同时学习11个基因（ATM，BARD1，BRCA1，BRCA2，BRIP1，CHEK2，PALB2，RAD50，RAD51C，RAD80和TP53）从启动到3'-UTR 24例。这个协议中，根据转座技术和基因组DNA富集，给出了一个很大的优点的时间为基因诊断由于采样复用条件。这个协议可以安全地使用与血液的gDNA。
Introduction
2010年，有近150万人（主要是女性）开发的全球乳腺癌。据估计，5％至10％的这些情况是遗传的。大约20年前，BRCA1和BRCA2被认定为参与遗传性乳腺癌和卵巢癌1。自从大约15年前，BRCA1和BRCA2基因的编码区已被测序，以确定遗传倾向的乳腺癌和卵巢癌。在BRCA1和BRCA2的变化在10％至20％选家庭2表明这些区域的分析是不够有效的筛查检测。近日，BRCA1和BRCA2基因的非编码序列（启动子，内含子，3'UTR）的分析，强调了新的基因突变/变异可能与乳腺癌3-6的风险较高。
BRCA1和BRCA2蛋白参与同源重组修复（HHR），它是由众多的合作伙伴7完成。而在BRCA1或BRCA2基因的改变诱发的DNA修复缺陷，其他伙伴也可能会影响到乳腺癌的危险性。这个假设似乎因为BRIP1 8已被验证，PALB2 9对宫颈癌和乳腺癌的一个行之有效的影响，分别为。此外，还有两个其他的“中度风险”的乳腺癌易感基因，ATM和CHEK2，也可以定期研究10。
从这些研究之后，我们决定开发一个协议分析11个基因（ 自动取款机，BARD1，BRCA1，BRCA2，BRIP1，CHEK2，PALB2，RAD50，RAD51C，RAP80和TP53），24例同时使用一个非常简单且相对基于转座技术快速的协议，以充实和测序中等吞吐量的设备上。谢谢该技术，我们测序完成基因的启动子的3'-UTR的端部的起动，除了RAP80，对于其中的2500 bp的内含子区域没有被覆盖的（CHR 5：176,381,588-176,390,180）。这代表共约1000300 BP研究与2,734探头。通常，BRCA1和BRCA2的外显子序列由Sanger测序，这需要1.5个月时间少于20名患者进行分析。本协议（ 图1），在相同的时间，11个完整的基因为大于75的病人可以进行分析。
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Protocol
基因组DNA 1。评估（基因组DNA）产量
- 量化新鲜提取基因组DNA的制备图书馆前。使用荧光估产方法量化完整的基因组DNA（避免使用分光光度计进行基因组DNA的产量评估）。测量（二百八十零分之二百六十nm）的比率，并确保它是在1.8和2注：50纳克基因组DNA的需要进行实验。
2，基因组DNA富集：第1天，上午
- 开始之前
- 从DNA富集试剂盒（见表材料/设备），解冻DNA缓冲液（TD）和冰的DNA酶（TDE1）解决方案。至少30分钟，在使用前，使纯化的磁珠和停止目标（ST）的缓冲液至室温（RT）。每个样品中添加20微升基因组DNA样品在2-2.5纳克/微升直接放入96孔板中，1个井。重要提示：使用阳性对照，以验证协议（与已知序列变异样本）。
- Tagmentation
- M九，所有试剂彻底颠倒5倍，后短暂离心。在室温，加入25微升的TD缓冲液到每个孔中含有50的gDNA纳克（20微升），然后取5μl的TDE1缓冲器。将吸管50微升，轻轻吸取整个音量上下10倍。
- 覆盖板用粘接膜和离心机在280 XG 1分钟，在20℃。然后，将板在热循环仪（盖在100℃加热），然后运行下面的程序：55℃5分钟，10℃，无时间限制。
- 在此培养后，制备与实验管理器软件的样品片材，以定义将要使用的索引。
- Tagmentation净化
注意：该步骤是关键的。要非常小心。- 检查无沉淀净化磁珠和ST缓冲器。如果沉淀物存在，热身手中的解决方案。解冻再悬浮缓冲（RSB）冰上。
- 在RT下，涡街溶液和添加15μl到每个孔中含有的样品。将吸管65微升，轻轻吸取整个音量上下10倍。孵育5分钟，在室温。覆盖板和离心机在280 XG 1分钟，在20℃。
- 加入52微升的预先混合纯化的磁珠在每个孔中。将吸管117微升，轻轻吸取整个音量上下10倍。下室温温育10分钟。覆盖板和离心机在280 XG 1分钟，在20℃。
- 除去粘合膜。放置在96孔板上的磁性支架在室温2分钟。确保上清出现彻底清除。
- 制备新鲜的80％乙醇溶液（24个样品，加入2毫升蒸馏水至8毫升乙醇中）。取出并弃去上清液，注意不要打扰珠。
- 同时使板在磁性支架，加入200微升新鲜制备的80％乙醇中，以每孔，而不会干扰珠孵育该板为至少30秒在室温下进行。弃上清，重复此洗了第二次。确保乙醇已被删除。让干燥，在室温下搅拌10分钟或直到乙醇完全蒸发。
- 从磁底座上卸下板并添加22.5微升RSB缓冲。移液器设置为22.5微升，轻轻吸取整个体积上下10倍。放置在96孔板上的磁性支架并孵育2分钟。确保上清出现彻底清除。轻轻的转移在一个新的96孔板20μL上清液。
注意：任选地，通过使用一个片段分析器确定tagmented样本的大小。而不是上面提到的步骤，使用高分辨率的丙烯酰胺凝胶电泳。片段应为150个基点至1000个基点之间。
- 第1次PCR扩增
- 解冻PCR扩增预混含有聚合酶（LP-PMM），索引1引，索引2引物溶液在冰上。匹配组合Ø˚F指标与实验管理器示例表。对于多路，准备从索引1（I7，N7xx）对每个样品不同I7。
- 在每孔加入20微升的LP-PMM，5微升指数1和5微升指数2将吸管50微升，轻轻吸取整个音量上下10倍。覆盖板用粘合剂微密封膜。离心机在280 XG 1分钟，在20℃。
- 将板在热循环仪（盖在100℃加热），然后运行程序1（ 表1）。
注：该过程可以停止在这一点上与该反应过夜储存在热循环或2至8℃下2天。
3，基因组DNA富集：第1天，下午
- 开始之前
- 融寡聚物（CSO），捕获目标缓冲器1（NCT1），并在冰上RSB的解决方案。至少30分钟，在使用前，使纯化的磁珠至室温。
- PCR纯化
- 从步骤2.4离心盘，持续1分钟，在280 XG在20℃。
- 在RT下，在各孔中加入45微升混合纯化的磁珠。移液器设置为95微升，轻轻吸取整个体积上下10倍。下室温温育10分钟。放置在96孔板上的磁性支架在室温2分钟。
- 确保上清出现彻底清除。制备新鲜的80％乙醇溶液（24个样品，加入2毫升蒸馏水至8毫升乙醇中）。弃去上清液，注意不要打扰颗粒。
- 同时使板在磁性支架，加入200微升新鲜制备的80％乙醇中，以每孔，而不会干扰珠孵育该板进行30秒，在室温下进行。弃上清，重复此洗了第二次。确保乙醇已被删除。让干燥，在室温下搅拌15分钟。
- 从磁底座上卸下板加入40μl的RSB缓冲。设置管TTE至40微升，轻轻吸取整个音量上下10倍。
- 放置在96孔板上的磁性支架并孵育2分钟。上清应该出现彻底清除。轻轻转移38微升上清液到新的96孔板中。
- 测定各样品的通过荧光法的产率。如果所评估的产率是30至50纳克/微升之间的协议的第一部分将被验证。
- 1号杂交
- 普尔高达每池12个样本在这个阶段通过将500ng的每种样品中一种新的96孔板中。确保每个池的最终体积不超过40微升。
注：如果需要的话，减少池的体积通过使用真空浓缩装置在RT（注意：DNA的浓度而不能加热进行修改，即使在30℃下加热使DNA降解）。通过添加RSB溶液调整最终体积至40微升。 - 充分混匀NCT1解决方案。对于每个孔含有40微升合并的DNA样品中，加50微升NCT1的，和10μl的CSO。移液器设置为100微升，轻轻吸取整个体积上下10倍。密封该板，并离心1分钟，在280 XG在20℃。
- 将板在热循环仪（盖在100℃加热），然后运行程序2（ 表1）。
- 普尔高达每池12个样本在这个阶段通过将500ng的每种样品中一种新的96孔板中。确保每个池的最终体积不超过40微升。
4，基因组DNA富集：2日，上午
- 开始之前
- 从DNA富集试剂盒（见表材料/设备）解冻2 N氢氧化钠（HP3），目标洗脱缓冲液1（ET1），目标洗脱缓冲液1 ET2，链亲和素磁珠（SMB），洗涤液1（WS1），洗解决方案2（WS2），洗涤液3（WS3），CSO和NCT1解决方案，在室温。
- 1号杂交洗
- 从该热循环和离心分离1分钟，在280 XG取出96孔板在20℃。取下粘合盖很carefuLLY。
- 从平板转移100μl的反应混合物到新的MIDI 96孔板中并加入250微升以及涡旋SMB溶液。移液器设置为350微升，轻轻吸取整个体积上下10倍。密封该板，并在室温下孵育30分钟。
- 离心机在280 XG 1分钟，在20℃下，除去了粘合剂密封，并放置在盘上的磁性支架，持续2分钟。确保上清出现彻底清除。弃去上清液，并从磁性底座上卸下盘。
- 加入200μl的良好混合WS1溶液进入井含珠。移液器设置为200微升，轻轻吸取的整个体积上下15X避免气泡/泡沫形成。
- 将板在磁性支架，持续2分钟。确保上清出现彻底清除。弃去上清液，并从磁性底座上卸下盘。
- 加入200μl的良好混合WS2溶液进入井其所含进不去珠。移液器设置为200微升，轻轻吸取的整个体积上下15倍，避免形成气泡/泡沫。
- 将板在磁性支架，持续2分钟。确保上清出现彻底清除。弃去上清液，并从磁性底座上卸下盘。
- 加入200μl的良好混合WS2溶液到含有珠的孔中。移液器设置为200微升，轻轻吸取的整个体积上下15x连接。
- 传送在新的96孔板的整个体积。密封该板，并将该板在热循环仪（盖加热至100℃）。在42℃下启动热循环30分钟。
- Imediately放置盘上的磁性支架，持续2分钟。确保上清出现彻底清除。取下密封并立即丢弃所有上清液。然后，从磁底座上卸下盘。
- 加入200μlWS 2成含珠孔。将吸管200微升，轻轻吸取的整个体积上下15倍，避免形成气泡/泡沫。密封该板，并将该板在热循环仪（盖加热至100℃）。在42℃下启动热循环30分钟。
- 立即将板在磁性支架，持续2分钟。确保上清出现彻底清除。取下密封并立即丢弃所有上清液。然后，从磁底座上卸下盘。
- 加入200μl的良好混合WS3溶液到含有珠的孔中。移液器设置为200微升，轻轻吸取的整个体积上下15x连接。
- 将板在磁性支架，持续2分钟。确保上清出现彻底清除。丢弃所有上清液，并从磁性底座上卸下盘。
- 重复此WS3洗了第二次。
- 除去上清液后，密封板，并短暂离心拉下残留上清。在放置板磁性支架，持续2分钟。丢弃剩余的上清液。
- 在0.2 ml管中，混匀28.5微升ET1和1.5微升HP3解决方案。这样的搭配是1池，若再池准备，以备池的数量乘以这些卷。
- 从磁底座上卸下板。加入23微升上述制备的混合物。移液器设置为23微升，轻轻吸取的整个体积上下15x连接。密封该板，并留下5分钟，在室温。离心机在280 XG 1分钟，在20℃。
- 将板在磁性支架，持续2分钟。确保上清出现彻底清除。除去粘合膜和转移21微升上清液到新的96孔板中。
- 加入4微升ET2溶液到每个孔中。移液器设置为25微升，轻轻吸取的整个体积的上下10倍和密封板。
注：该过程可以停止在这一点上与反应贮存7天，在-15℃下。如果板被冻结，启动第二杂交之前完全解冻。
- 第二杂交
- 离心盘，持续1分钟，在280 XG在20℃。除去粘合膜，并添加50μl的NCT1，10微升的CSO，与15微升的PCR级水至25μl的库。移液器设置为100微升，轻轻吸取的整个体积上下10倍。
- 密封该板，并离心1分钟，在280 XG在20℃。
- 将板在热循环仪（盖在100℃加热），然后运行程序2（ 表1）。
5，基因组DNA富集：2日，下午
- 开始之前
- 解冻ET1，ET2，SMB，WS1，WS2，WS3和HP3溶液在RT杂交洗涤。从DNA富集试剂盒，解冻PCR扩增预混含有聚合酶（TC-PMM），PCR引物鸡尾酒（PPC），和RSB的解决方案，在冰上进行PCR扩增。
- 第二杂交洗
- 按照完全相同的协议为4.2 - 1号杂交洗。
- PCR扩增
- 在新的96孔板中，混合20微升洗脱的来自步骤5.2中，将25μl的TC-PMM的，和5μl的PPC。移液器设置为50微升，轻轻吸取的整个体积上下10倍。密封该板，并离心1分钟，在280 XG在20℃。
- 将板在热循环仪（盖在100℃加热），然后运行程序3（ 表1）。
6，基因组DNA富集：3天
- 开始之前
- 冰解冻RSB的解决方案。至少30分钟，在使用前，使纯化的磁珠至室温。
- PCR纯化
- 离心反应板从步骤5.3，持续1分钟，在280 XG在20℃，并除去粘合剂覆盖。
- 在室温下，加入90微升的previously混合纯化的磁珠在每个孔中。移液器设置为140微升，轻轻吸取整个体积上下10倍。孵育15分钟，在室温。放置在96孔板上的磁性底座5分钟，在室温。确保上清出现彻底清除。
- 制备新鲜的80％乙醇溶液（2样品中，加入200微升的蒸馏水，以800微升乙醇）。弃去上清液，注意不要打扰颗粒。
- 同时使板在磁性支架，加入200微升新鲜制备的80％乙醇中，以每孔，而不会干扰珠孵育该板进行30秒，在室温。弃上清，重复此清洗一次。确保乙醇已被删除。让干燥在室温进行15分钟或直到乙醇完全蒸发，而该板是在磁性支架上。
- 从磁底座上卸下板，加入30微升的RSB缓冲。移液器设置为30微升，并轻轻吸取吨他整个音量上下10倍。将培养板在室温下2分钟。
- 放置在96孔板上的磁性支架并孵育5分钟，或直至上清液出现完全清楚。轻轻转移28微升上清液到新的96孔板（板类型：TCY）。
注：该过程可以停止在这个阶段，并存储在-15℃下进行长达7天的反应。
- 库验证和定量
- 通过使用片段分析仪确定库的质量。高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用来代替上述的步骤，但不推荐使用。片段应为150个基点至1000个基点之间。
注：推荐：通过qPCR定量库测序过程中获得集群的最佳数量。 - 作为参考，使用经过验证库（2米）。如果第一个库正在准备中，使用规定的sequenc校准噬菌体PhiX的DNA（10纳米）荷兰国际集团的设备。
- 制备阳性对照的系列稀释液，得到7个点，20，16，8,6，4,2，和下午1点在EBT（EB洗脱缓冲液+0.1％吐温20）。淡化利益图书馆在1/1000〜1/2000。每一点必须以一式三份进行分析。
- 制备下列混合物（乘法卷所使用的孔的数目）：对于1个孔中，添加10微升的SYBR Green含有定量PCR主混合物（2×），0.2微升正向引物（10μM，AATGATACGGCGACCACCGAGAT），0.2微升反向引物的（10μM，CAAGCAGAAGACGGCATACGA），和7.6微升的PCR级水。
- 混合后，废除在96孔板中，18微升混合液到每个孔中，并加入2μl的阳性对照和文库稀释。密封该板，并离心1分钟，在280 XG在20℃。然后，把平板的定量PCR热循环和运行程序4（ 表1）。
- 分析结果如常规绝对量化，得到每个升的产率ibrary。定量PCR的优点是，它仅量化的DNA，将与流动池进行交互。
注：请不要使用的DNA荧光定量由于DNA分子模拟在试剂中的一个存在。这种量化方法将高估图书馆产量，从而低估了集群得分。
- 通过使用片段分析仪确定库的质量。高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用来代替上述的步骤，但不推荐使用。片段应为150个基点至1000个基点之间。
- 排序下水
- 稀释每个库在4纳米的30微升的洗脱缓冲液（EB）的最终体积，并集中所有的图书馆，拌匀。
- 准备在EB缓冲液新鲜的0.2N的NaOH溶液，搅拌10微升该NaOH溶液与10微升汇集库。搅拌均匀，准确地孵育5分钟在室温。
- 5分钟后，立即加入980μL杂交液（从测序盒）拌匀。然后，混合400μL与600μL杂交液这种混合物。拌匀并注入了8转600微升到300周期盒（2×150）PM。启动顺序。
7，数据分析
- 一旦设备处理的数据中，.bam和.vcf文件转移到新电脑上。
注：转座子碎片结合的脚印。因此，软件会自动修剪这些数据。 - 收集与所述设备分析所获得的遗传变异。
- 通过按照制造商的指示进行分析导出的文件（.bam，的.vcf）与另一软件（阿拉穆特）。然后，比较用两种分析中得到的遗传变异。唯一的变化检测两次都被认为存在。
表1 PCR条件
| 节目 | 温度 | 时间 | 民。重复 | |||
| 1 | 72℃ | 3分钟 | 1 | 98℃ | 30秒 | 1 |
| 98℃ | 10秒 | 10 | ||||
| 60℃ | 30秒 | |||||
| 72℃ | 30秒 | |||||
| 72℃ | 5分钟 | 1 | ||||
| 10℃ | 无限 | |||||
| 2 | 95℃ | 10分钟 | 1 | |||
| 93℃ | 1分钟 | 1 | ||||
| 91℃ | 1分钟 | 1 | ||||
| 89℃ | 1分钟 | 1 | ||||
| 87℃ | 1分钟 | 1 | ||||
| 85°C | 1分钟 | 1 | ||||
| 83℃ | 1分钟 | 1 | ||||
| 81℃ 1分钟 | 1 | |||||
| 79℃ | 1分钟 | 1 | ||||
| 77℃ | 1分钟 | 1 | ||||
| 75℃ | 1分钟 | 1 | ||||
| 71℃ | 1分钟 | 1 | ||||
| 69℃ | 1分钟 | 1 | ||||
| 67℃ | 1分钟 | 1 | ||||
| 65℃ | 1分钟 | 1 | ||||
| 63℃ | 1分钟 | 1 | ||||
| 61℃ | 1分钟 | 1 | ||||
| 59℃ | 1分钟 | 1 | ||||
| 58℃ | 1分钟 | 16-18小时 | ||||
| 3 | 98℃ | 30秒 | 1 | |||
| 98℃ | 10秒 | 10 | ||||
| 60℃ | 30秒 | |||||
| 72℃ | 30秒 | |||||
| 72℃ | 5分钟 | 1 | ||||
| 10℃ | 无限 | |||||
| 4 | 95℃ | 10分钟 | 1 | |||
| 95℃ | 15秒 | 40 | ||||
| 60℃ | 1分钟 | |||||
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Representative Results
样品QC成果
这种方法来确定靶基因的序列的能力是基于基因组DNA（ 图2A）的质量和tagmentation步骤的质量。如果tagmentation是不够（ 图2B，上图），测序将不会令人满意。如上面所提到的，tagmentation纯化后，将基因组DNA的应tagmented成片段从150 100bp到1000bp的多数大约300 bp的片段（ 图2B，下图）。
在文库制备结束，库质量是通过使用生物分析器检查。所获得的信息应该是大致相同tagmentation后但具有更高数目的片段（ 图2C）。如果文库质量不等同于图1C中 ，测序不应该执行。
一旦测序发动的测序装置，该聚类的得分是在9个周期可用的和应该是80万和110万簇/平方毫米（ 图3A）之间。如果这个数较低，则排序将不令人满意，尤其是在阅读深度。如果它是高时，图像会模糊（ 图3B），并没有分析将由于不可能区分集群完成。
在运行结束时，重要的是要检查的质量得分。按照上面详述的方案，该运行的质量得分将对应于图4。测序的质量是由Q-得分（Q-30）来表示。以验证实验中，至少约75％的序列（群）应具有的Q分数大于或等于30。
测序结果
这个实验的目的是研究宪法的遗传异常。在这种情况下，基因异常为prESENT在基因组的50％。正因为如此，在测序深度不是很重要。在此，我们准备同时进行测序2库12例为11完整的基因。以获得高的测序深度，多路复用患者数目必须减少。作为基因组DNA富集是基于捕获由探针中，富集不均质的（ 图5）。与我们的协议，我们产生了大约6千兆读取，诱导150的平均覆盖率为读取每个基地，以最小20，最大为330读取。这些读出的深度是根据在临床实践11使用NGS的。尽管读取深处，这可能是由于基因组DNA富集捕获和基因不是主要的重排的非均质性，值得注意的是，在Q-得分总是优于30（ 图5），从而验证所述序列是很重要的。
然而，通过比较的结果来验证技术是很重要的■对于那些与Sanger测序获得的所得。在17例由双方Sanger测序法测序（编码BRCA1和BRCA2基因的序列）和转座基础的技术，我们发现同样的330遗传变异（SNP和突变）。作为一个例子，在BRCA1基因的点突变（ 图6左）和缺失中的BRCA2基因4个碱基（ 图6右）由两个桑格和转座为基础的方法进行检测。如BRCA1是13号染色体上的反向链，值得注意的是，它是必要的，以补充（但不反转）中获得的序列，而对于BRCA2（正链），将获得的序列并不需要进行补充是重要。如示于图5中 ，NGS技术给出了遗传变异的估计频率，而桑格方法没有。此外，特别是对于插入缺失变异的解释是，吴更容易的技术。 如图6右边，插入缺失变异的序列显示为加扰的电泳图谱，需要正向和反向测序破译插入或删除序列。与NGS分析，插入或删除的序列被直接确定，从而减少误解的危险。最后，转座基础的技术使我们能够分析更多的靶基因，我们发现并没有涵盖的Sanger测序许多新的遗传变异序列。这些结果将另行公布。
图1的程序流程示意图。 请点击这里查看该图的放大版本。
图2：质量控制之前和图书馆准备了。 A.光度法信息的gDNA，可以安全地用于tagmentation。该DNA产率必须高于5纳克/微升，二百八十○分之二百六和二百三十〇分之二百六十零比率必须高于1.8和2。tagmented的gDNA B.片段分析器配置文件。上图表示不够tagmented基因组DNA。下图显示了一个完美的tagmented样本。备库的三片段分析仪配置文件只是顺序启动之前。片段的大小是一样的tagmented基因组DNA（B，下图），但放大的量。 请点击这里查看该图的放大版本。
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图3：检查集群生成。在运行过程中的测序设备的答屏幕截图。集群密度应介于800至1,000 K /平方毫米。B.不同的图像对应低密度（上图），高密度（下图）和完善的密度（中图）。 请点击这里查看该图的放大版本。 。
图4检查的Q分数。在运行结束时，验证序列应具有生成的群中的至少75％具有Q得分高于30。JPG“目标=”_ blank将“>请点击这里查看该图的放大版本。
图5代表按覆盖数据和其对应的Q分数的阅读深度是异质所有沿覆盖基因。然而，Q分数覆盖区域总是优于Q-30， 请点击这里查看该图的放大版本。
与Sanger测序和转座为基础的技术得到图6。代表性的成果。与Sanger测序发现所有的遗传变异进 行了Ðetected与转座为基础的技术。而点突变很容易理解，插入缺失的改变有时是相当困难的桑格方法来研究。与中等通量设备相关的转座为基础的技术，插入缺失的改变是简单的发现。不过，需要注意的是，有必要补充（而不是反转）获得序列时，靶基因位于负链（这里的BRCA1基因）是非常重要的。 请点击这里查看该图的放大版本。
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Discussion
广泛使用的NGS的设备和技术已经在癌症和遗传疾病的研究提供新的机会。除了全基因组测序和RNA测序，产生大量的无数的患者选择的基因组DNA序列的分析同时提供了诊断的前景十分广阔。在这里，我们开发了使用Nextera技术，同时研究11完整的基因在24例中等通量测序装置（表材料/设备）的特定设计（随叫随到）。该协议允许快速生成的数据，使患者的错误的低风险的担忧快速反应。如示于图6中 ，用Sanger测序检测到的所有遗传变异，通过使用转座子为基础的制备试剂盒，还检测到。该方法是可靠和容易理解，尤其适用于直接分析复杂的插入缺失的改变。然而，重要的是要注意，对于基因位于负链，它是必要的补充（不可逆）的核苷酸。目前的工作进行了设计的完整的11个基因的分析，但该协议是任何设计的选择是一样的。转座为基础的技术也可以用于从远距离的PCR产物12的文库制备。实际上，该算法（由生产商开发的）用于设计（制造商网站工具，请参阅表的材料/设备）特别地专用于该协议。除了转座为基础的技术，DNA片段化的另外两个机制图书馆前的准备工作还有：机械破碎和酶的碎片。机械DNA片段是可重现的，但需要一个超声发生器，以及库制剂是更昂贵和更耗时。酶的DNA片段往往导致因限制性酶切位点的位置问题进行DNA采集，导致在缺乏靶序列覆盖。然而，每一个策略的DNA片段都有优点和缺点，但似乎得到相当类似的结果，至少在长范围PCR产物的碎片13。使用一个新的酶鸡尾酒的似乎提供了相同的结果的那些机械DNA片段14获得。转座为基础的技术需要高质量的DNA（不适用于从DNA FFPE组织中提取）。此外，转座活性的需要超过300 bp的片段，表明感兴趣的片段必须比该长度更长。这种特殊性说明需要为高质量的，未片段化DNA。
到现在为止，BRCA1和BRCA2的遗传变异进 行了研究，在家族性乳腺癌和卵巢癌。然而，BRCA基因，特别是BRCA2的介入，现在怀疑在其他癌症，特别是在胰腺15，前列腺16，和睾丸癌17。 PALB2，BRCA基因的合作伙伴，对基因的改变也与胰腺癌相关的18。此外，最近出现患者窝藏BRCA基因突变，以及在较小程度上PALB2的突变，表现出他们的胰腺癌到PARP抑制剂19更好的反应。由于BRCA1，BRCA2和PALB2与癌症的家族性风险，并可能与易患具体的治疗有关，它探索了BRCA1和BRCA2伙伴筛查家族性癌症的风险，并在筛查癌症治疗的反应似乎很重要。
从这些数据中，DNA断裂修复相关基因的分析似乎不仅对敏感性的筛选，而且对治疗应答的推测的指示器是很重要的。而且，随着该协议提出完整的基因分析，可以COV呃所有改变，可能是先天本（以及存在于癌细胞），如突变的启动子，剪接位点，或位于内含子调控剪接位点。迄今为止，在非编码基因序列的改变还没有深入研究，但全基因组关联研究的发展能够突出这些序列的重要功能。
总之，本文研制的转座为基础的设计是一个有趣的方式来探索基因异常在参与DNA损伤修复的癌症易感基因。测序11完整基因的24名患者的可能性同时是一个重要的优点与Sanger测序方法，这是一个相当困难的技术进行筛选比较。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well Plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Manufacturer website tool |
References
- Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
- Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
- Cox, D. G., et al. Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers. Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).
- Maia, A. T., et al. Effects of BRCA2 cis-regulation in normal breast and cancer risk amongst BRCA2 mutation carriers. Breast Cancer Res. 14 (2), 63 (2012).
- Anczuków, O., et al. BRCA2 deep intronic mutation causing activation of a cryptic exon: opening toward a new preventive therapeutic strategy. Clin. Cancer Res. 18 (18), 4903-4909 (2012).
- Brewster, B. L., et al. Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3'UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site. Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).
- Ma, X. D., et al. First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer. Gene. 524 (2), 208-213 (2013).
- Haanpää, M., Pylkäs, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families. BMC Med. Genet. 14, 82 (2013).
- Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation. Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).
- Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice. Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).
- Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing. J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).
- Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing. Plos One. 6, e28240 (2011).
- de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borràs, E., Mañé, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing. Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).
- The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers. J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).
- Levy-Lahad, E., Friedman, E. Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).
- Risch, H. A., et al. Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada. J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).
- Slater, E. P., et al. PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families. Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).
- Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W.
