Abstract
L'uso diffuso di Next Generation Sequencing ha aperto nuove strade per la ricerca sul cancro e la diagnosi. NGS porterà enormi quantità di nuovi dati sul cancro, e soprattutto la genetica del cancro. Le conoscenze attuali e future scoperte renderà necessario studiare un gran numero di geni che potrebbero essere coinvolti in una predisposizione genetica al cancro. A questo proposito, abbiamo sviluppato un progetto Nextera per studiare 11 geni completi coinvolti nella riparazione del DNA danni. Questo protocollo è stato sviluppato per studiare in modo sicuro 11 geni (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, e TP53) dal promotore a 3'-UTR in 24 pazienti contemporaneamente. Questo protocollo, basato sulla tecnologia trasposasi e gDNA arricchimento, dà un grande vantaggio in termini di tempo per la diagnosi genetica grazie a campione multiplexing. Questo protocollo può essere utilizzato in modo sicuro con gDNA sangue.
Introduction
Nel 2010, quasi 1,5 milioni di persone (essenzialmente donne) hanno sviluppato il cancro al seno in tutto il mondo. Si stima che dal 5 al 10% di questi casi erano ereditarie. Quasi 20 anni fa, BRCA1 e BRCA2 sono stati identificati come coinvolti in seno ereditario e tumori ovarici 1. Da circa 15 anni fa, BRCA1 e BRCA2 regioni codificanti sono stati sequenziati per determinare la predisposizione genetica al cancro della mammella e dell'ovaio. Alterazioni in BRCA1 e BRCA2 sono rilevati in 10 al 20% delle famiglie selezionate 2 suggeriscono che l'analisi di queste regioni non è sufficiente per lo screening efficace. Recentemente, l'analisi di sequenze non codificanti (introni, promotore, 3-'UTR) di BRCA1 e BRCA2 ha sottolineato che le nuove mutazioni / varianti potrebbero essere collegati ad un più elevato rischio di cancro al seno 3-6.
Proteine BRCA1 e BRCA2 sono coinvolti nella ricombinazione omologa Repair (HHR), che è completato da numerosi partner 7. Mentre le alterazioni in BRCA1 o BRCA2 indurre difetti nella riparazione del DNA, gli altri partner possono anche influenzare il rischio di cancro al seno. Questa ipotesi sembra essere stato convalidato dal BRIP1 8 e 9 PALB2 avere un impatto provato sul cancro del collo dell'utero e della mammella, rispettivamente. Inoltre, due altri geni di suscettibilità "rischio moderato" cancro al seno, ATM e CHEK2, possono anche essere studiati sistematicamente 10.
A seguito di questi studi, abbiamo deciso di sviluppare un protocollo per l'analisi di 11 geni (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, rad50, RAD51C, RAP80, e TP53) in 24 pazienti simultaneamente utilizzando un programma molto semplice e relativamente protocollo veloce basato sulla tecnologia trasposasi, con l'arricchimento e il sequenziamento su un dispositivo di throughput medio. Graziea questa tecnica, abbiamo sequenziato i geni completi dall'inizio del promotore al fine di 3'-UTR, tranne RAP80, per cui una regione intronic di 2.500 bp non era coperto (Chr5: 176,381,588-176,390,180). Questo rappresenta un totale di circa 1.000.300 bp studiato con 2.734 sonde. Di solito, BRCA1 e BRCA2 sequenze exonic vengono analizzati da Sanger sequenziamento, che ha bisogno di 1,5 mesi per meno di 20 pazienti. Con la presente protocollo (Figura 1), nello stesso tempo, 11 geni completi per più di 75 pazienti potrebbero essere analizzati.
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Protocol
1. Valutazione di gDNA (DNA genomico) Rendimento
- Quantificare appena estratto gDNA prima della preparazione della biblioteca. Utilizzare il metodo di valutazione di rendimento fluorimetrico quantificare gDNA intatto (evitare l'uso di uno spettrofotometro per la valutazione del rendimento gDNA). Misurare la (260/280 nm) Rapporto e assicurarsi che sia compresa tra 1,8 e 2 NOTA: 50 ng di gDNA sono necessari per l'esperimento.
2 gDNA Arricchimento: Giorno 1, Mattina
- Prima di iniziare
- Dal kit di arricchimento del DNA (vedi Tabella dei materiali / attrezzature), disgelo tampone di DNA (TD) e soluzioni di enzima DNA (TDE1) su ghiaccio. Almeno 30 minuti prima dell'uso, portare purificazione sfere magnetiche e smettere di destinazione (ST) tampone a temperatura ambiente (RT). Aggiungere 20 ml di campione gDNA a 2-2,5 ng / ml direttamente in una piastra a 96 pozzetti, 1 pozzetto per campione. IMPORTANTE: Utilizzare un controllo positivo per convalidare il protocollo (campione con nota variazione di sequenza).
- Tagmentation
- Mix tutti i reagenti completamente, agitando 5x, e spin down brevemente. A RT, aggiungere 25 ml di tampone TD in ciascun pozzetto contenente 50 ng (20 ml) di gDNA, e poi 5 ml di tampone TDE1. Impostare pipetta 50 ml, pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 10x.
- Coprire la piastra con pellicola adesiva e centrifugare per 1 min a 280 xg a 20 ° C. Quindi, posizionare la piastra in un termociclatore (coperchio riscaldato a 100 ° C) ed eseguire il seguente programma: 55 ° C per 5 min e 10 ° C per un tempo illimitato.
- Durante questa incubazione, preparare il foglio di esempio con il software Experiment Manager per definire gli indici che saranno utilizzati.
- Tagmentation Purificazione
NOTA: Questo passaggio è fondamentale. State molto attenti.- Verificare l'assenza di precipitato nella depurazione sfere magnetiche e buffer di ST. Se sono presenti precipitati, scaldare le soluzioni in mano. Tampone di risospensione Thaw (RSB) sul ghiaccio.
- A RT, vortice soluzione ST e aggiungere15 microlitri per ogni campione pozzetto contenente. Impostare pipetta 65 ml, pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 10x. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Coprire la piastra e centrifugare per 1 min a 280 xg a 20 ° C.
- Aggiungere 52 ml di sfere magnetiche di depurazione precedentemente misti in ogni pozzetto. Impostare pipetta a 117 ml, pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 10x. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Coprire la piastra e centrifugare per 1 min a 280 xg a 20 ° C.
- Rimuovere la pellicola adesiva. Posizionare la piastra a 96 pozzetti su un supporto magnetico per 2 minuti a temperatura ambiente. Assicurarsi che il surnatante appare del tutto chiaro.
- Preparare una soluzione di etanolo fresco 80% (per 24 campioni, aggiungere 2 ml di acqua distillata a 8 ml di etanolo). Rimuovere e scartare il surnatante facendo attenzione a non disturbare le perline.
- Pur mantenendo la piastra sul supporto magnetico, aggiungere 200 ml di preparato fresco 80% di etanolo a ciascun pozzetto senza disturbare le perline e incubare la piastra per almeno 30 seca temperatura ambiente. Eliminare il surnatante e ripetere questo lavaggio una seconda volta. Assicurarsi che l'etanolo è stato rimosso. Lasciare asciugare a temperatura ambiente per 10 minuti o fino a completa evaporazione dell'etanolo.
- Rimuovere la placca dal supporto magnetico e aggiungere 22,5 ml di RSB buffer. Impostare la pipetta a 22,5 ml, pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 10x. Posizionare la piastra a 96 pozzetti sul supporto magnetico e incubare per 2 min. Assicurarsi che il surnatante appare del tutto chiaro. Trasferire delicatamente 20 ml di surnatante in una nuova piastra a 96 pozzetti.
NOTA: Facoltativamente, determinare la dimensione dei campioni tagmented utilizzando un analizzatore frammento. Invece dei passi di cui sopra, utilizzare ad alta risoluzione elettroforesi su gel di acrilammide. Frammenti deve essere compresa tra 150 bp e 1000 bp.
- 1 ° PCR Amplificazione
- Master mix Thaw PCR contenente polimerasi (LP-PMM), indice 1 fondo, e indice 2 soluzioni di primer sul ghiaccio. Abbinare la combinazione oindici F con il foglio di esempio Experiment Manager. Per multiplexing, preparare i7 diverso dall'indice 1 (i7, N7xx) per ogni campione.
- In ogni bene, aggiungere 20 ml di LP-PMM, 5 ml di indice 1, e 5 ml di indice 2 Impostare la pipetta 50 ml, pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 10x. Coprire la piastra con una pellicola adesiva Microseal. Centrifugare per 1 min a 280 xg a 20 ° C.
- Porre la piastra in un termociclatore (coperchio riscaldato a 100 ° C) ed eseguire il programma 1 (Tabella 1).
NOTA: la procedura può essere interrotta a questo punto e le reazioni memorizzati durante la notte nel termociclatore o per 2 giorni tra 2 e 8 ° C.
3 gDNA Arricchimento: Giorno 1, Pomeriggio
- Prima di iniziare
- Oligo Scongelare (CSO), la cattura del buffer di destinazione 1 (NCT1), e soluzioni RSB su ghiaccio. Almeno 30 minuti prima dell'uso, portare purificazione sfere magnetiche a RT.
- PCR Purification
- Centrifugare la piastra dal punto 2.4, per 1 min a 280 xg a 20 ° C.
- A RT, aggiungere 45 ml di depurazione mista sfere magnetiche in ogni pozzetto. Impostare la pipetta 95 ml, pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 10x. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Posizionare la piastra a 96 pozzetti su un supporto magnetico per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Assicurarsi che il surnatante appare del tutto chiaro. Preparare una soluzione di etanolo fresco 80% (per 24 campioni, aggiungere 2 ml di acqua distillata a 8 ml di etanolo). Eliminare il surnatante facendo attenzione a non disturbare il pellet.
- Pur mantenendo la piastra sul supporto magnetico, aggiungere 200 ml di preparato fresco 80% di etanolo a ciascun pozzetto senza disturbare le perline e incubare la piastra per 30 secondi a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante e ripetere questo lavaggio una seconda volta. Assicurarsi che l'etanolo è stato rimosso. Lasciare asciugare a temperatura ambiente per 15 min.
- Rimuovere la placca dal supporto magnetico e aggiungere 40 ml di RSB buffer. Impostare il tubotte a 40 ml, pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 10x.
- Posizionare la piastra a 96 pozzetti sul supporto magnetico e incubare per 2 min. Il surnatante deve apparire completamente chiara. Delicatamente trasferire 38 ml di surnatante in una nuova piastra a 96 pozzetti.
- Determinare la resa di ciascun campione con un metodo fluorimetrico. Questa prima parte del protocollo sarà convalidata se i rendimenti sono valutati tra 30 e 50 ng / ml.
- 1 ° Ibridazione
- Pool fino a 12 campioni per piscina in questa fase mescolando 500 ng di ogni campione in una nuova piastra a 96 pozzetti. Assicurarsi che il volume finale di ogni pool non superi i 40 ml.
NOTA: Se necessario, diminuire il volume delle piscine utilizzando un dispositivo concentratore sotto vuoto a temperatura ambiente (Attenzione: la concentrazione di DNA non può essere modificato mediante riscaldamento, anche a 30 ° C, il riscaldamento provoca la degradazione del DNA). Regolare il volume finale di 40 ml da RSB soluzione aggiungendo. - Mescolare bene ilSoluzione NCT1. Per ogni pozzetto contenente 40 ml di campioni di DNA in pool, aggiungere 50 ml di NCT1, e 10 ml di CSO. Impostare la pipetta a 100 ml, pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 10x. Sigillare la piastra e centrifugare per 1 min a 280 xg a 20 ° C.
- Porre la piastra in un termociclatore (coperchio riscaldato a 100 ° C) ed eseguire il programma 2 (Tabella 1).
- Pool fino a 12 campioni per piscina in questa fase mescolando 500 ng di ogni campione in una nuova piastra a 96 pozzetti. Assicurarsi che il volume finale di ogni pool non superi i 40 ml.
4 gDNA Arricchimento: Day 2, Mattina
- Prima di iniziare
- Dal kit di arricchimento del DNA (vedi Tabella dei materiali / attrezzature) disgelo 2 N NaOH (HP3), obiettivo tampone di eluizione 1 (ET1), bersaglio tampone di eluizione 1 ET2, sfere magnetiche streptavidina (SMB), soluzione di lavaggio 1 (WS1), lavaggio Soluzione 2 (WS2), soluzione di lavaggio 3 (WS3), soluzioni CSO, e NCT1 a RT.
- 1 ° ibridazione Wash
- Rimuovere la piastra a 96 pozzetti del termociclatore e centrifugare 1 min a 280 xg a 20 ° C. Rimuovere la copertura adesiva molto carefully.
- Trasferire la miscela di reazione a 100 ml dalla piastra a una nuova piastra a 96 pozzetti MIDI e aggiungere 250 ml di soluzione di SMB bene in agitazione. Impostare la pipetta a 350 ml, pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 10x. Sigillare la piastra e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
- Centrifugare per 1 min a 280 xg a 20 ° C, rimuovere il sigillo adesivo e posizionare la piastra sul supporto magnetico per 2 min. Assicurarsi che il surnatante appare del tutto chiaro. Eliminare il supernatante e rimuovere la piastra dal supporto magnetico.
- Aggiungere 200 ml di soluzione WS1 ben miscelato nelle perline bene che contengono. Impostare la pipetta 200 ml e pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 15x evitando la formazione di bolle / schiuma.
- Posizionare la piastra sul supporto magnetico per 2 min. Assicurarsi che il surnatante appare del tutto chiaro. Eliminare il supernatante e rimuovere la piastra dal supporto magnetico.
- Aggiungere 200 ml di soluzione WS2 ben miscelato in pozzi Contaperline ining. Impostare la pipetta 200 ml e pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 15x evitando la formazione di bolle / schiuma.
- Posizionare la piastra sul supporto magnetico per 2 min. Assicurarsi che il surnatante appare del tutto chiaro. Eliminare il supernatante e rimuovere la piastra dal supporto magnetico.
- Aggiungere 200 ml di soluzione WS2 ben miscelato in pozzetti contenenti perline. Impostare la pipetta 200 ml e pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 15x.
- Trasferire l'intero volume in una nuova piastra a 96 pozzetti. Sigillare la piastra e posizionare la piastra in un termociclatore (coperchio riscaldato a 100 ° C). Avviare il termociclatore a 42 ° C per 30 min.
- Imediately posizionare la lastra sul supporto magnetico per 2 min. Assicurarsi che il surnatante appare del tutto chiaro. Rimuovere la guarnizione e gettare immediatamente tutto il surnatante. Quindi, rimuovere la piastra dal supporto magnetico.
- Aggiungere 200 ml di WS2 nei pozzetti contenenti perline. Impostare la pipetta a 200ml e pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 15x evitando la formazione di bolle / schiuma. Sigillare la piastra e posizionare la piastra in un termociclatore (coperchio riscaldato a 100 ° C). Avviare il termociclatore a 42 ° C per 30 min.
- Porre immediatamente la piastra sul supporto magnetico per 2 minuti. Assicurarsi che il surnatante appare del tutto chiaro. Rimuovere la guarnizione e gettare immediatamente tutto il surnatante. Quindi, rimuovere la piastra dal supporto magnetico.
- Aggiungere 200 ml di soluzione WS3 ben miscelato in pozzetti contenenti perline. Impostare la pipetta 200 ml e pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 15x.
- Posizionare la piastra sul supporto magnetico per 2 min. Assicurarsi che il surnatante appare del tutto chiaro. Eliminare tutto il surnatante e rimuovere la piastra dal supporto magnetico.
- Ripetere la WS3 lavare una seconda volta.
- Dopo aver rimosso il surnatante, sigillare la piastra e centrifugare brevemente per abbattere surnatante residuo. Posizionare la piastra suil supporto magnetico per 2 min. Eliminare il surnatante residuo.
- In una provetta da 0,2 ml, mescolare 28,5 ml di ET1 e 1,5 ml di soluzioni HP3. Questo mix è per 1 piscina, se più piscine sono preparati, moltiplicare questi volumi per il numero di piscine preparati.
- Rimuovere la placca dal supporto magnetico. Aggiungere 23 microlitri della miscela sopra preparato. Impostare la pipetta di 23 ml e pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 15x. Sigillare la piastra e lasciar riposare per 5 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare per 1 min a 280 xg a 20 ° C.
- Posizionare la piastra sul supporto magnetico per 2 min. Assicurarsi che il surnatante appare del tutto chiaro. Rimuovere la pellicola adesiva e trasferire 21 ml di surnatante in una nuova piastra a 96 pozzetti.
- Aggiungere 4 ml di soluzione ET2 in ciascun pozzetto. Impostare la pipetta di 25 ml e pipettare delicatamente l'intero volume su e giù per 10 volte e sigillare la piastra.
NOTA: la procedura può essere interrotta a questo punto e le reazioni conservato per un massimo di 7 giorni a -15 ° C. Se la piastra è congelato, scongelare completamente prima di iniziare l'ibridazione 2 °.
- 2 ° Ibridazione
- Centrifugare la piastra per 1 min a 280 xg a 20 ° C. Rimuovere la pellicola adesiva e aggiungere 50 ml di NCT1, 10 ml di CSO, e 15 ml di acqua di grado PCR a 25 ml di biblioteca. Impostare la pipetta di 100 microlitri e pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 10x.
- Sigillare la piastra e centrifugare per 1 min a 280 xg a 20 ° C.
- Porre la piastra in un termociclatore (coperchio riscaldato a 100 ° C) ed eseguire il programma 2 (Tabella 1).
5 gDNA Arricchimento: Day 2, Pomeriggio
- Prima di iniziare
- Thaw ET1, ET2, SMB, WS1, WS2, soluzioni HP3 a RT per lavaggio ibridazione WS3 e. Dal kit arricchimento DNA, scongelare PCR master mix contenente polimerasi (TC-PMM), PCR Primer cocktail (PPC), e le soluzioni RSB in ghiaccio per l'amplificazione PCR.
- 2 ° Ibridazione Wash
- Seguire esattamente lo stesso protocollo per 4,2-1 ° ibridazione lavaggio.
- PCR Amplificazione
- In una nuova piastra a 96 pozzetti, mescolare 20 ml di eluizione dal punto 5.2, 25 ml di TC-PMM, e 5 ml di PPC. Impostare la pipetta 50 ml e pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 10x. Sigillare la piastra e centrifugare per 1 min a 280 xg a 20 ° C.
- Porre la piastra in un termociclatore (coperchio riscaldato a 100 ° C) e il programma di esecuzione 3 (Tabella 1).
6 gDNA Arricchimento: Day 3
- Prima di iniziare
- Soluzione Thaw RSB sul ghiaccio. Almeno 30 minuti prima dell'uso, portare purificazione sfere magnetiche a RT.
- PCR Purification
- Centrifugare la piastra dal punto 5.3 per 1 min a 280 xg a 20 ° C, e rimuovere il coperchio adesivo.
- A RT, aggiungere 90 ml di previously misto di depurazione sfere magnetiche in ogni pozzetto. Impostare la pipetta a 140 ml, pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 10x. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Posizionare la piastra a 96 pozzetti su un supporto magnetico per 5 minuti a temperatura ambiente. Assicurarsi che il surnatante appare del tutto chiaro.
- Preparare una soluzione di etanolo fresco 80% (per 2 campioni, aggiungere 200 ml di acqua distillata a 800 ml di etanolo). Eliminare il surnatante facendo attenzione a non disturbare il pellet.
- Pur mantenendo la piastra sul supporto magnetico, aggiungere 200 ml di preparato fresco 80% di etanolo a ciascun pozzetto senza disturbare le perline e incubare la piastra per 30 secondi a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante e ripetere questo lavaggio ancora una volta. Assicurarsi che l'etanolo è stato rimosso. Lasciare asciugare a temperatura ambiente per 15 minuti o fino a completa evaporazione dell'etanolo mentre la piastra è sul supporto magnetico.
- Rimuovere la placca dal supporto magnetico e aggiungere 30 ml di RSB buffer. Impostare la pipetta di 30 microlitri, e delicatamente pipetta tegli intero volume su e giù 10x. Incubare la piastra per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Posizionare la piastra a 96 pozzetti sul supporto magnetico e incubare per 5 minuti o fino a quando il surnatante appare del tutto chiaro. Delicatamente trasferire 28 ml del surnatante in un nuovo 96-pozzetti (targhetta: TCY).
NOTA: La procedura può essere interrotta in questa fase e le reazioni conservato a -15 ° C per un massimo di 7 giorni.
- Biblioteca Validazione e quantificazione
- Determinare la qualità della biblioteca utilizzando un analizzatore di frammento. Alta risoluzione elettroforesi su gel di acrilamide può essere utilizzato per sostituire la procedura di cui sopra, ma non è raccomandato. Frammenti deve essere compresa tra 150 bp e 1000 bp.
NOTA: Consigliato: Quantificare la libreria da qPCR per ottenere il miglior numero di cluster durante la sequenziazione. - Come riferimento, utilizzare una libreria convalidato (2 nM). Se la prima libreria è in fase di preparazione, utilizzare il fago Phix DNA (10 nM) previsto per la calibrazione del SEQUENCdispositivo ing.
- Preparare diluizioni seriali di controllo positivo di ottenere 7 punti a 20, 16, 8, 6, 4, 2, e 01:00 a EBT (EB eluizione tampone + 0.1% Tween 20). Diluire la biblioteca di interesse a 1/1000 e 1/2000. Ogni punto deve essere analizzato in triplicato.
- Preparare la seguente miscela (volumi si moltiplicano per il numero di pozzi utilizzato): per 1 bene, aggiungere 10 ml di SYBR Green contenenti qPCR master mix (2x), 0,2 ml di primer forward (10 micron, AATGATACGGCGACCACCGAGAT), 0,2 ml di primer reverse (10 mM, CAAGCAGAAGACGGCATACGA), e 7.6 ml di acqua di grado PCR.
- Dopo la miscelazione, deporre in una piastra a 96 pozzetti, 18 ml di miscela in ogni microlitri bene e 2 di controllo e di biblioteca diluizioni positive. Sigillare la piastra e centrifugare per 1 min a 280 xg a 20 ° C. Quindi, posizionare la piastra in un termociclatore PCR quantitativa e di esecuzione del programma 4 (Tabella 1).
- Analizzare i risultati come convenzionale quantificazione assoluta per ottenere la resa di ogni library. Il vantaggio di qPCR è che quantifica solo DNA che interagirà con la cella di flusso.
NOTA: Non utilizzare fluorimetrico quantificazione del DNA per la presenza di DNA molecole mimetiche in uno dei reagenti. Questo metodo di quantificazione dovrebbe sopravvalutare la resa biblioteca e di conseguenza sottovalutare il punteggio di clustering.
- Determinare la qualità della biblioteca utilizzando un analizzatore di frammento. Alta risoluzione elettroforesi su gel di acrilamide può essere utilizzato per sostituire la procedura di cui sopra, ma non è raccomandato. Frammenti deve essere compresa tra 150 bp e 1000 bp.
- Sequencing lancio
- Diluire ogni libreria a 4 Nm in un volume finale di 30 ml di tampone di eluizione (EB), e in comune tutte le librerie e mescolare bene.
- Preparare una nuova soluzione 0,2 N NaOH in tampone EB e mescolare 10 ml di questa soluzione di NaOH con 10 ml di biblioteche pool. Mescolare bene e incubare esattamente 5 minuti a temperatura ambiente.
- Dopo 5 minuti, aggiungere immediatamente 980 ml di tampone di ibridazione (da cartuccia sequenziamento) e mescolare bene. Poi, mescolare 400 ml di questa miscela con 600 ml di tampone di ibridazione. Mescolare bene e trasferire 600 microlitri in una cartuccia 300 ciclo (2 x 150) per una iniezione di 8pM. Lancio sequenziamento.
Analisi dei dati 7.
- Una volta che il dispositivo ha elaborato i dati, trasferire la .bam ei file .vcf a un nuovo computer.
NOTA: trasposasi frammentazione incorpora impronte. Di conseguenza, il software rifila automaticamente questi dati. - Raccogliere variazioni genetiche ottenute con l'analisi del dispositivo.
- Analizzare i file esportati (.bam, .vcf) con un altro software (Alamut) seguendo le istruzioni del produttore. Poi, confrontare le variazioni genetiche ottenute con entrambe le analisi. Identificate solo due volte sono considerati presenti variazioni.
Tabella 1. condizioni di PCR
| Programma | Temperatura | Tempo | Num. di ripetizioni | |||
| 1 | 72 ° C | 3 min | 1 | 98 ° C | 30 sec | 1 |
| 98 ° C | 10 sec | 10 | ||||
| 60 ° C | 30 sec | |||||
| 72 ° C | 30 sec | |||||
| 72 ° C | 5 min | 1 | ||||
| 10 ° C | illimitato | |||||
| 2 | 95 ° C | 10 min | 1 | |||
| 93 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 91 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 89 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 87 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 85 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 83 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 81 ° C 1 min | 1 | |||||
| 79 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 77 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 75 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 71 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 69 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 67 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 65 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 63 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 61 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 59 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 58 ° C | 1 min | 16-18 hr | ||||
| 3 | 98 ° C | 30 sec | 1 | |||
| 98 ° C | 10 sec | 10 | ||||
| 60 ° C | 30 sec | |||||
| 72 ° C | 30 sec | |||||
| 72 ° C | 5 min | 1 | ||||
| 10 ° C | illimitato | |||||
| 4 | 95 ° C | 10 min | 1 | |||
| 95 ° C | 15 sec | 40 | ||||
| 60 ° C | 1 min | |||||
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Representative Results
Risultati campione di QC
La capacità di questo metodo per determinare sequenze di geni bersaglio si basa sulla qualità del gDNA (Figura 2A) e la qualità del passo tagmentation. Se il tagmentation non è sufficiente (Figura 2B, pannello superiore), il sequenziamento non sarà soddisfacente. Come accennato in precedenza, dopo la purificazione tagmentation, il gDNA opportuno tagmented in frammenti da 150 bp a 1.000 bp con la maggior parte dei frammenti di circa 300 bp (Figura 2B, pannello inferiore).
Alla fine della preparazione biblioteca, qualità libreria viene controllata utilizzando un Bioanalyser. Il profilo ottenuto dovrebbe essere circa la stessa come dopo tagmentation ma con un più elevato numero di frammenti (Figura 2C). Se la qualità di libreria non è identica alla figura 1C, sequenziamento non deve essere eseguita.
Una volta che la sequenza è lanciato suil dispositivo di sequenziamento, il punteggio di clustering è disponibile dopo 9 cicli e dovrebbe essere compreso tra 800.000 e 1.100.000 cluster / mm ² (Figura 3A). Se questo numero è inferiore, il sequenziamento non sarà soddisfacente, soprattutto in profondità di lettura. Se è superiore, le immagini vengono sfocate (Figura 3B), e nessuna analisi sarà fatto per l'impossibilità di differenziare i cluster.
Al termine della corsa, è importante controllare il punteggio di qualità. Seguendo il protocollo di cui sopra, il punteggio di qualità della corsa sarà conforme alla figura 4. La qualità di sequenziamento è rappresentato da un Q-score (Q-30). Per convalidare l'esperimento, almeno il 75% circa delle sequenze (cluster) dovrebbe avere un Q-score superiore o uguale a 30.
Risultati Sequencing
Questo esperimento è stato progettato per studiare le anomalie genetiche costituzionali. In questo caso, l'anomalia genetica è prESENT al 50% nel genoma. A causa di questo, la profondità sequenziamento non è molto importante. Qui, abbiamo preparato e sequenziato contemporaneamente 2 biblioteche di 12 pazienti per 11 geni completi. Per ottenere elevata profondità sequenziamento, il numero di pazienti multiplex deve essere diminuita. Come gDNA arricchimento è basato sulla cattura da sonde, l'arricchimento non è omogenea (Figura 5). Con il nostro protocollo, abbiamo generato circa 6 Gb di legge, inducendo una copertura media di 150 letture per ogni base, con un minimo di 20 e un massimo di 330 letture. Questi profondità di lettura sono conformi con l'uso di NGS nella pratica clinica 11. Nonostante l'eterogeneità della profondità di lettura, probabilmente a causa gDNA arricchimento per cattura, e non maggiore di riarrangiamento dei geni, è importante notare che la Q-score era sempre superiore a 30 (figura 5), convalidando in tal modo il sequenziamento.
Tuttavia, è importante per validare la tecnologia confrontando il risultatos ottenuti con quelli ottenuti con il sequenziamento Sanger. Nei 17 pazienti sequenziati sia sequenziamento Sanger e la tecnologia basata trasposasi (sequenze di BRCA1 e BRCA2 codifica), abbiamo rilevato le stesse 330 variazioni genetiche (SNP e mutazioni). Come esempio, una mutazione puntiforme nel gene BRCA1 (Figura 6 a sinistra) e una delezione di 4 basi nel gene BRCA2 (Figura 6 destra) sono stati rilevati sia Sanger e metodi basati trasposasi-. Come BRCA1 è sul filamento opposto del cromosoma 13, è importante notare che è necessario integrare (ma non invertire) la sequenza ottenuta, mentre per BRCA2 (sul filamento in avanti), la sequenza ottenuta non ha bisogno di essere integrata . Come indicato nella figura 5, la tecnologia NGS fornisce una frequenza stimata della variazione genetica, mentre il metodo Sanger non. Inoltre, in particolare per le variazioni INDEL, l'interpretazione è più facile con NGLa tecnologia S. Come mostrato in figura 6 a destra, sequenze variazione Indel appaiono come una dell'elettroferogramma strapazzato che ha bisogno di avanti e indietro sequenziamento di decifrare la sequenza inserita o eliminata. Con l'analisi NGS, la sequenza inserita o eliminata viene determinata direttamente, riducendo così il rischio di errori di interpretazione. Infine, la tecnologia basata trasposasi ci ha permesso di analizzare un maggior numero di geni bersaglio, e abbiamo trovato molte nuove sequenze di variazione genetica che non erano coperti da Sanger sequenziamento. Questi risultati saranno pubblicati altrove.
Figura 1 Schema del flusso di lavoro della procedura. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. controlli di qualità prima e dopo la preparazione biblioteca. Profilo A. spettrofotometrica del gDNA che può essere utilizzato in modo sicuro per tagmentation. La resa del DNA deve essere superiore a 5 ng / ml, 260/280 e 260/230 rapporti deve essere superiore a 1,8 e 2, rispettivamente. B. Frammento profili analizzatore di tagmented gDNA. Pannello superiore rappresenta sufficientemente tagmented gDNA. Pannello inferiore mostra un campione perfettamente tagmented. C. Frammento profilo analizzatore di biblioteca preparato poco prima sequenza di lancio. Dimensione del frammento è la stessa tagmented gDNA (B, pannello inferiore), ma con un importo amplificato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura generazione di cluster 3 Controllo. A. Schermata del dispositivo di sequenziamento durante la corsa. Densità di cluster deve essere compresa tra 800 e 1.000 K / mm ². B. Diverse immagini corrispondono a bassa densità (pannello superiore), ad alta densità (pannello inferiore) e la densità perfetta (pannello centrale). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .
Figura 4 Controllo del Q-score. Alla fine della corsa, sequenziamento convalidato dovrebbe avere almeno il 75% di cluster generati con un Q-score superiore a 30.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 Rappresentazione di dati di copertura e il loro corrispondente Q-score. La profondità di lettura è eterogenea lungo tutto il gene coperto. Tuttavia, il Q-score delle regioni interessate è sempre superiore a Q-30. Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6. risultati rappresentativi ottenuti con il sequenziamento Sanger e con la tecnologia basata trasposasi-. Tutte le variazioni genetiche osservate con Sanger sequenziamento sono stati detected con la tecnologia basata trasposasi-. Considerando che mutazioni puntiformi sono facili da interpretare, alterazioni INDEL sono a volte molto difficili da studiare con il metodo Sanger. Con la tecnologia basata trasposasi-associato ad un dispositivo di throughput medio, alterazioni INDEL sono semplici da scoprire. Tuttavia, è importante notare che è necessario integrare (ma non invertire) le sequenze ottenute quando il gene bersaglio si trova sul filo meno (qui il gene BRCA1). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'uso diffuso di dispositivi e tecnologie NGS ha fornito nuove opportunità nello studio dei tumori e malattie genetiche. Oltre al sequenziamento dell'intero genoma o RNA sequenziamento, l'analisi di una grande quantità di sequenze di gDNA selezionati in numerosi pazienti contemporaneamente offre grandi prospettive nella diagnosi. Qui, abbiamo sviluppato uno specifico progetto (disponibile su richiesta), utilizzando la tecnologia Nextera per studiare 11 geni completi in 24 pazienti contemporaneamente con un dispositivo di sequenziamento medio (Tabella dei materiali / attrezzature). Questo protocollo consente una rapida generazione di dati che consente una rapida risposta alle preoccupazioni dei pazienti a basso rischio di errore. Come illustrato in figura 6, tutte le variazioni genetiche rilevate con Sanger sequenziamento sono stati rilevati utilizzando il kit di preparazione basata trasposasi-. Questo metodo è affidabile e facile da interpretare, soprattutto per le alterazioni INDEL complessi che vengono analizzati direttamente. Tuttavia, è importantenotare che per geni localizzati nel filamento negativo, è necessario integrare (senza retromarcia) nucleotidi. Il presente lavoro è stato eseguito con un disegno per l'analisi di 11 geni complete, ma il protocollo è lo stesso qualunque sia il disegno scelto. Tecnologia basata transposase-può essere utilizzato anche per la preparazione biblioteca da lungo raggio PCR prodotti 12. Infatti, l'algoritmo (sviluppato dal produttore) utilizzato per la progettazione (sito web strumento di produttore, vedere la tabella dei materiali / attrezzature) è espressamente dedicato per questo protocollo. Oltre alla tecnologia trasposasi-based, altri due meccanismi di frammentazione del DNA prima della preparazione biblioteca sono disponibili anche: frammentazione meccanica e la frammentazione enzimatica. Frammentazione del DNA meccanica è riproducibile ma ha bisogno di un ultrasonicatore, e la preparazione biblioteca è più costoso e più tempo. Frammentazione del DNA enzimatica provoca spesso problemi per la cattura del DNA a causa di ubicazione dei siti di restrizione enzimi, con conseguentein una mancanza di copertura sequenza bersaglio. Tuttavia, ogni strategia di frammentazione del DNA ha vantaggi e svantaggi, ma sembra dare risultati abbastanza simili, almeno per lungo gamma di prodotti di PCR frammentazione 13. L'uso di un nuovo cocktail enzimatico sembra fornire gli stessi risultati come quelli ottenuti con la frammentazione del DNA meccanico 14. Tecnologia basata trasposasi-ha bisogno di DNA di alta qualità (non applicabile per il DNA estratto da tessuti FFPE). Inoltre, l'attività di trasposasi bisogno frammenti di oltre 300 pb, suggerendo che i frammenti di interesse deve essere più lungo di questa lunghezza. Questa specificità spiega la necessità di alta qualità, un-DNA frammentato.
Fino ad ora, le variazioni genetiche di BRCA1 e BRCA2 sono state studiate in seno familiare e tumori ovarici. Tuttavia, il coinvolgimento dei geni BRCA, e soprattutto BRCA2, è ora sospettato di altri tipi di tumore, in particolare nel pancreas 15, della prostata16, e tumori del testicolo 17. L'alterazione genetica di PALB2, un partner di geni BRCA, è anche associata a cancro del pancreas 18. Inoltre, recentemente apparso che i pazienti presentano mutazioni BRCA, e in misura minore mutazioni PALB2, ha mostrato una migliore risposta del loro cancro al pancreas agli inibitori PARP 19. Come BRCA1, BRCA2, e PALB2 sono associati con un rischio familiare di cancro, e possibilmente associati con suscettibilità a trattamenti specifici, sembra importante esplorare le BRCA1 e BRCA2 partner in screening per il rischio di cancro familiare e nello screening per la risposta al trattamento del cancro.
Da questi dati, l'analisi di rottura del DNA geni di riparazione correlati sembra essere importante non solo per lo screening di suscettibilità ma anche per un indicatore putativo di risposta al trattamento. Inoltre, l'analisi completa del gene proposta con questo protocollo potrebbe Cover tutte le modifiche che potrebbero essere congenitamente presente (e presente nelle cellule tumorali), come le mutazioni del promotore, siti di splicing o siti di splicing regolamentari ubicati in introni. Ad oggi, alterazioni nelle sequenze di geni non codificanti non sono stati studiati a fondo, ma lo sviluppo di studi di associazione sull'intero genoma potrebbero evidenziare importanti funzioni di queste sequenze.
In conclusione, il design basato trasposasi sviluppato in questo lavoro è un modo interessante per esplorare anomalie genetiche nei geni di suscettibilità cancro coinvolti nella riparazione del danno al DNA. La possibilità di sequenziare 11 geni completi per 24 pazienti è simultaneamente un vantaggio importante rispetto al metodo di sequenziamento Sanger, che è una tecnica molto difficile per lo screening.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well Plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Manufacturer website tool |
References
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