Abstract
차세대 시퀀싱의 광범위한 사용은 암 연구 및 진단을위한 새로운 길을 열었습니다. NGS는 거대한 암에 대한 새로운 데이터의 양, 특히 암 유전학을 가져올 것이다. 현재의 지식과 미래의 발견은 필요한 암의 유전 적 소인에 관여 할 수있는 유전자의 거대한 숫자를 연구 할 것입니다. 이러한 관점에서, 우리는 DNA 손상의 복구에 관여하는 유전자의 완전한 11 공부 Nextera 설계를 개발 하였다. 이 프로토콜은 안전하게 동시에 24 명에서 11 유전자 (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 및 TP53) 프로모터에서 3'-UTR을 연구하기 위해 개발되었다. transposase 기술과 gDNA를 농축에 따라이 프로토콜은, 다중화를 샘플링 할 수있는 유전자 진단 덕분에 시간의 측면에서 큰 장점을 제공합니다. 이 프로토콜은 혈액 gDNA를 안전하게 사용할 수있다.
Introduction
2010 년 (기본적으로 여성) 거의 1백50만명는 전 세계적으로 유방암을 개발했다. 그러나, 이들의 경우 5-10 %의 유전 있다고 추정된다. 유전성 유방암과 난소 암의 1에 관련된 거의 이십년 전, BRCA1과 BRCA2가 확인되었다. 약 15 년 전 이후로, BRCA1 및 BRCA2 코딩 영역은 유방암과 난소 암에 대한 유전 적 소인을 결정하는 순서가되었다. BRCA1 및 BRCA2의 변화는 이들 영역의 분석을 효과적으로 스크리닝 충분하지 않은 것을 시사 선택된 가족이 10-20 %가 검출된다. 최근, BRCA1 및 BRCA2의 비 - 코딩 서열 (프로모터, 인트론, 3 'UTR)의 분석은 새로운 돌연변이 / 변형 유방암 3-6의 높은 위험에 링크 될 수 있다는 것을 강조 하였다.
BRCA1과 BRCA2 단백질은 (상동 재조합 수리에 참여하고 있습니다수많은 파트너 (7)에 의해 완료 HHR). BRCA1 또는 BRCA2의 변화는 DNA 복구에 결함을 유발하지만, 다른 파트너는 유방암 위험에 영향을 미칠 수있다. 이 가설은 BRIP1 8 이후 확인 된 것으로 나타나고 PALB2 9는 각각 자궁 경부 암과 유방암에 대한 입증 영향을 미친다. 또한, 다른 두 "중등도 위험"유방암 감수성 유전자, ATM 및 CHEK2는 또한 정기적으로 열 연구 할 수있다.
이 연구에 이어, 우리는 동시에 상대적으로 매우 쉽고을 사용하여 24 명에서 11 유전자 (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80 및 TP53)를 분석 할 수있는 프로토콜을 개발하기로 결정 매체 처리 장치 및 농축 transposase 시퀀싱 기술을 기반으로 빠른 프로토콜. 감사합니다이 기술로, 우리는 2500 염기쌍의 인트론 영역이 포함되지 않은 RAP80, (: 176,381,588-176,390,180 CHR5)을 제외하고, 3'-UTR의 단부에 프로모터 개시로부터 완전한 유전자 서열. 이는 2734 프로브 연구에 대한 1,000,300 염기쌍의 합계를 나타냅니다. 일반적으로 BRCA1과 BRCA2 엑손 서열은 20 명 미만 환자의 1.5 개월을 필요로 생거 시퀀싱에 의해 분석된다. 본 프로토콜 (도 1)와 동일한 시간에, 75 개 이상 11 명의 환자에 대한 완전한 유전자를 분석 할 수있다.
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Protocol
gDNA를 1. 평가 (게놈 DNA) 수익률
- 갓 라이브러리의 준비를하기 전에 gDNA를 추출 정량화. (gDNA를 수익률 평가를위한 분광 광도계를 사용하지 마십시오) 그대로 gDNA를 정량화하기 위해 형광 수율의 평가 방법을 사용합니다. (280 분의 260 nm의) 비율을 측정하고 주 1.8 사이 2가 있는지 확인 : gDNA를 50 ng의 실험이 필요합니다.
2 gDNA를 보충 : 1 일, 아침
- 시작하기 전에
- DNA 농축 키트에서 DNA 버퍼 (TD) 및 얼음에 DNA 효소 (TDE1) 솔루션 해동 (자재 / 장비의 표 참조). 적어도 30 분 사용하기 전에, 정화 자석 구슬을 가져다 목표 명세서 (ST)를 중지 실온 (RT)에 버퍼. 샘플 당 잘 μL 직접 96 웰 플레이트에 / 2-2.5 NG에 일을 gDNA를 샘플의 20 μl를 추가합니다. 중요 : 프로토콜 (알려진 서열 변이 샘플)을 확인하는 긍정적 인 컨트롤을 사용합니다.
- Tagmentation
- MIX 모두 철저하게 배를 반전하여 시약 및 스핀 다운 잠시. RT에서 TDE1 버퍼의 각 웰 gDNA를 50 NG (20 μL)를 포함하고 5 μL에 TD 버퍼의 25 μl를 추가합니다. 부드럽게 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫, 50 μL에 피펫을 설정합니다.
- 20 ° C에서 280 XG에 1 분 접착 필름 및 원심 분리기와 함께 접시를 커버. 그런 다음 열 순환기의 판 (100 ° C로 가열 커버)를 배치하고 다음 프로그램을 실행시킵니다 5 분 동안 55 ° C 및 시간 제한없이 10 ° C를.
- 이 인큐베이션 동안 사용될 인덱스를 정의하는 실험 관리자 소프트웨어와 샘플 시트를 제작.
- Tagmentation 정화
참고 :이 단계는 매우 중요합니다. 매우주의해야합니다.- 정제 자기 구슬과 ST 버퍼에 침전물의 유무를 확인합니다. 석출물이 존재하는 경우, 손을 따뜻하게 해법. 얼음에 녹여 재 부상 버퍼 (RSB).
- RT에서, 소용돌이 ST 솔루션 및 추가각 웰에 포함 된 샘플 15 μL. 부드럽게 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫, 65 μL에 피펫을 설정합니다. 실온에서 5 분 동안 품어. 20 ° C에서 280 XG에 1 분 동안 접시와 원심 분리기를 커버.
- 각 웰에 이전에 혼합 정제 자석 구슬의 52 μl를 추가합니다. 부드럽게, 117 μL에 피펫을 설정 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫. 실온에서 10 분 동안 품어. 20 ° C에서 280 XG에 1 분 동안 접시와 원심 분리기를 커버.
- 접착 필름을 제거합니다. 실온에서 2 분 동안 자기 스탠드에 96 - 웰 플레이트를 놓습니다. 상층 액이 완전히 명확 나타나는지 확인합니다.
- (24 샘플 8 ㎖의 에탄올에 증류수 2 ㎖를 추가) 신선한 80 % 에탄올 용액을 준비합니다. 제거하고 구슬을 방해하지 뜨는 돌보는 폐기합니다.
- 자기 스탠드 플레이트 유지하면서, 비즈를 방해하지 않고, 각 웰에 새로 제조 된 80 % 에탄올 200 μL를 추가하고, 적어도 30 초 동안 배양 접시실온에서. 뜨는을 취소하고이 세척을 한 번 더 반복합니다. 에탄올이 꺼 졌는지 확인되었습니다. 10 분 동안 또는 에탄올을 완전히 증발 될 때까지 실온에서 건조하자.
- 자기 스탠드에서 플레이트를 제거하고 RSB 버퍼의 22.5 μl를 추가합니다. 부드럽게 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫, 22.5 μL에 피펫을 설정합니다. 자기 스탠드에 96 - 웰 플레이트를 놓고 2 분 동안 배양한다. 상층 액이 완전히 명확 나타나는지 확인합니다. 조심스럽게 새로운 96 웰 플레이트에 상층 액의 20 μl를 전송합니다.
NOTE : 선택적으로, 프래그먼트 분석기를 사용하여 tagmented 샘플의 크기를 결정한다. 대신에 상술 한 바와 같은 단계, 고해상도 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 사용한다. 조각은 150 BP와 1000 bp의 사이에 있어야한다.
- 1 차 PCR 증폭
- 얼음에 중합 효소 (LP-PMM), 인덱스 1 프라이머, 및 색인이 프라이머 솔루션을 포함 해동 PCR 마스터 믹스. 조합 O를 일치실험 관리자 샘플 시트와 F 인덱스. 다중화, 각 샘플에 대한 인덱스 1 (I7, N7xx) 다른 I7을 준비합니다.
- 각에서 잘 부드럽게, LP-PMM의 20 μL, 인덱스 1의 5 μL, 50 μL에 피펫을 설정 인덱스 2의 5 μl를 추가 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫. 접착제 microseal 필름과 플레이트를 커버. 20 ° C에서 280 XG에 1 분 동안 원심 분리기.
- 열 순환기의 판 (표지 100 ° C로 가열) 및 실행 프로그램 1 (표 1)를 배치합니다.
NOTE : 절차는이 시점에서 중단 될 수 있고, 반응은 열 순환기 또는 2, 8 ° C 사이의 2 일간 밤새 저장된다.
3 gDNA를 보충 : 1 일, 오후
- 시작하기 전에
- 해동 올리고 (CSO), 캡처 한 목표 버퍼 (NCT1) 및 얼음에 RSB 해법. 적어도 30 분 사용 전에, RT로 정제 자성 비드를 가져온다.
- PCR 정화
- 20 ° C에서 280 XG에서 1 분, 2.4 단계에서 접시를 원심 분리기.
- RT에서 각 웰에 혼합 정제 자석 구슬의 45 μl를 추가합니다. 부드럽게, 95 μL에 피펫을 설정 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫. 실온에서 10 분 동안 품어. RT에서 이분에 대한 자기 스탠드에 96 - 웰 플레이트를 놓습니다.
- 상층 액이 완전히 명확 나타나는지 확인합니다. (24 샘플 8 ㎖의 에탄올에 증류수 2 ㎖를 추가) 신선한 80 % 에탄올 용액을 준비합니다. 펠렛을 방해하지 뜨는 복용주의를 폐기하십시오.
- 자기 스탠드 플레이트 유지하면서, 비즈를 방해하지 않고, 각 웰에 새로 제조 된 80 % 에탄올 200 μL를 추가하고 실온에서 30 초 동안 배양 접시. 뜨는을 취소하고이 세척을 한 번 더 반복합니다. 에탄올이 꺼 졌는지 확인되었습니다. 15 분 동안 실온에서 건조하자.
- 자기 스탠드에서 플레이트를 제거하고 RSB 버퍼의 40 μl를 추가합니다. 파이프를 설정40 μL에 TTE는 부드럽게 아래로 10 배 전체 볼륨 업 및 피펫.
- 자기 스탠드에 96 - 웰 플레이트를 놓고 2 분 동안 배양한다. 상층 액을 완전히 명확 나타납니다. 조심스럽게 새로운 96 웰 플레이트에 상층 액의 38 μl를 전송합니다.
- 적인 형광 방법으로 각 샘플의 수율을 결정합니다. 평가 수익률이 30 및 50 NG / μL 사이에있는 경우 프로토콜의 첫 번째 부분은 검증 될 것이다.
- 1 일 하이브리드
- 새로운 96 - 웰 플레이트에 각 시료 500 ng를 혼합하여,이 단계에서 풀당 12 샘플까지 풀. 각 풀의 최종 부피가 40 μl를 초과하지 않도록하십시오.
NOTE : (: 가열 DNA 저하 원인으로 심지어 30 ° C에서, DNA의 농도는 가열에 의해 변형 될 수 없다주의) 필요한 경우, RT에서 진공 농축기 장치를 사용하여 풀의 양을 감소시킨다. 추가 RSB 용액 40 μL에 최종 볼륨을 조정합니다. - 철저하게 믹스NCT1 솔루션입니다. 풀링 된 DNA 샘플의 각 웰 포함하는 40 ㎕를 들어, NCT1의 50 μL 및 CSO의 10 μl를 추가합니다. 부드럽게 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫, 100 μL에 피펫을 설정합니다. 20 ° C에서 280 XG에서 1 분 동안 접시와 원심 분리기를 밀봉.
- 열 순환기의 판 (표지 100 ° C로 가열) 및 실행 프로그램 2 (표 1)를 배치합니다.
- 새로운 96 - 웰 플레이트에 각 시료 500 ng를 혼합하여,이 단계에서 풀당 12 샘플까지 풀. 각 풀의 최종 부피가 40 μl를 초과하지 않도록하십시오.
4 gDNA를 심화 : 2 일, 아침
- 시작하기 전에
- DNA 농축 키트에서 해동 (자재 / 장비의 표 참조)이 N의 NaOH, 용출 버퍼 1 ET2, 스트렙 타비 딘 자석 구슬 (SMB), 세척 용액 1 (WS1), 세척을 대상으로 (HP3), 대상 용출 버퍼 1 (ET1) 솔루션 2 (WS2), 세척 용액 3 (WS3), RT에서 CSO 및 NCT1 솔루션을 제공합니다.
- 1 일 하이브리드 워시
- 20 ° C에서 280 XG에 열 순환기 원심 분리기 1 분에서 96 웰 플레이트를 제거합니다. 매우 carefu 접착 덮개를 제거합니다에서야.
- 새로운 MIDI 96 웰 플레이트에 플레이트에서 100 ㎕의 반응 믹스를 전송하고 잘 텍싱 SMB 솔루션의 250 μl를 추가합니다. 부드럽게 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫, 350 μL에 피펫을 설정합니다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 30 분 동안 배양한다.
- 20 ° C에서 280 XG에 1 분 동안 원심 분리기, 접착제 씰을 제거하고 2 분 동안 자기 스탠드에있는 플레이트에 배치합니다. 상층 액이 완전히 명확 나타나는지 확인합니다. 상층 액을 버리고 자기 스탠드에서 플레이트를 제거합니다.
- 잘 들어있는 구슬로 잘 혼합 WS1 용액 200 μl를 추가합니다. 거품 / 거품의 형성을 피할 수 아래로 15 배 전체 볼륨 업 및 200 μL에 피펫을 설정하고 부드럽게 피펫.
- 2 분 동안 자기 스탠드에 접시를 놓습니다. 상층 액이 완전히 명확 나타나는지 확인합니다. 상층 액을 버리고 자기 스탠드에서 플레이트를 제거합니다.
- 우물 conta의로 잘 혼합 WS2 용액 200 μl를 추가ining 구슬입니다. 200 μL에 피펫을 설정하고 부드럽게 전체 볼륨 업을 피펫 아래로 15 배 거품 / 거품의 형성을 방지.
- 2 분 동안 자기 스탠드에 접시를 놓습니다. 상층 액이 완전히 명확 나타나는지 확인합니다. 상층 액을 버리고 자기 스탠드에서 플레이트를 제거합니다.
- 구슬을 포함 우물에 잘 혼합 WS2 용액 200 μl를 추가합니다. 200 μL에 피펫을 설정하고 부드럽게 위아래로 15 배 전체 볼륨을 피펫.
- 새로운 96 - 웰 플레이트의 전체 볼륨을 전송. 플레이트를 밀봉하고 열 순환기 (덮개가 100 ° C로 가열)에서 접시를 놓습니다. 30 분 동안 42 ° C에서 열 순환기를 시작합니다.
- 는 즉시 2 분 동안 자기 스탠드에있는 플레이트에 배치합니다. 상층 액이 완전히 명확 나타나는지 확인합니다. 봉인을 제거하고 즉시 모든 상층 액을 버린다. 그런 다음, 자기 스탠드에서 플레이트를 제거합니다.
- 구슬을 포함 우물에 WS2의 200 μl를 추가합니다. 200 피펫을 설정μl를 부드럽게 전체 볼륨 업을 피펫 아래로 15 배 거품 / 거품의 형성을 방지. 플레이트를 밀봉하고 열 순환기 (덮개가 100 ° C로 가열)에서 접시를 놓습니다. 30 분 동안 42 ° C에서 열 순환기를 시작합니다.
- 즉시 2 분 동안 자기 스탠드에있는 플레이트에 배치합니다. 상층 액이 완전히 명확 나타나는지 확인합니다. 봉인을 제거하고 즉시 모든 상층 액을 버린다. 그런 다음, 자기 스탠드에서 플레이트를 제거합니다.
- 구슬을 포함 우물에 잘 혼합 WS3 용액 200 μl를 추가합니다. 200 μL에 피펫을 설정하고 부드럽게 위아래로 15 배 전체 볼륨을 피펫.
- 2 분 동안 자기 스탠드에 접시를 놓습니다. 상층 액이 완전히 명확 나타나는지 확인합니다. 모든 상층 액을 버리고 자기 스탠드에서 플레이트를 제거합니다.
- WS3이 2 번 씻어 반복합니다.
- 상층 액을 제거한 후, 잔류 뜨는을 아래로 끌어 판과 간단히 원심 분리기를 밀봉. 에 접시를 놓고2 분 동안 자기 스탠드. 잔류 상층 액을 버린다.
- 0.2 ML 튜브에서 ET1의 28.5 μL 및 HP3 솔루션의 1.5 μl를 섞는다. 이 혼합 더 풀을 준비하는 경우, 준비 풀의 숫자로 이러한 볼륨을 곱 한 수영장입니다.
- 자기 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. 상기 제조 믹스 23 μl를 추가합니다. 23 μL에 피펫을 설정하고 부드럽게 위아래로 15 배 전체 볼륨을 피펫. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 5 분 동안 둡니다. 20 ° C에서 280 XG에 1 분 동안 원심 분리기.
- 2 분 동안 자기 스탠드에 접시를 놓습니다. 상층 액이 완전히 명확 나타나는지 확인합니다. 접착 필름을 제거하고 새로운 96 웰 플레이트에 상층 액의 21 μl를 전송합니다.
- 각 웰에 ET2 솔루션의 4 μl를 추가합니다. 25 μL에 피펫을 설정하고 부드럽게 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫 판을 밀봉하십시오.
참고 : 프로 시저가이 시점에서 중지 될 수 있고, 반응이 -15 ° C에서 최대 7 일간 저장. 플레이트가 고정되어있는 경우, 완전히 2 차 하이브리드를 시작하기 전에 해동.
- 2 차 혼성화
- 20 ° C에서 280 XG에서 1 분 동안 접시를 원심 분리기. 접착 필름을 제거하고 라이브러리의 25 μL에 NCT1의 50 μL, CSO의 10 μL, 그리고 PCR 등급 물 15 μl를 추가합니다. 100 μL에 피펫을 설정하고 부드럽게 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫.
- 20 ° C에서 280 XG에서 1 분 동안 접시와 원심 분리기를 밀봉.
- 열 순환기의 판 (표지 100 ° C로 가열) 및 실행 프로그램 2 (표 1)를 배치합니다.
5 gDNA를 심화 : 2 일, 오후
- 시작하기 전에
- 해동 ET1, ET2, SMB, WS1, WS2, WS3 및 하이브리드 세척에 대한 RT에서 HP3 솔루션을 제공합니다. DNA 농축 키트에서 PCR 증폭을위한 얼음에 PCR 마스터 믹스를 포함하는 중합 효소 (TC-PMM), PCR 프라이머 칵테일 (PPC)와 RSB 솔루션을 해동.
- 2 차 하이브리드 워시
- 1 차 혼성화 세척 - 4.2과 완전히 동일한 프로토콜을 따르십시오.
- PCR 증폭
- 새로운 96 웰 플레이트에서, 단계 5.2, TC-PMM의 25 μL 및 PPC의 5 μL에서 용출의 20 μl를 섞는다. 50 μL에 피펫을 설정하고 부드럽게 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫. 20 ° C에서 280 XG에서 1 분 동안 접시와 원심 분리기를 밀봉.
- 열 순환기의 판 (표지 100 ° C로 가열) 및 실행 프로그램 3 (표 1)를 배치합니다.
6 gDNA를 심화 : 3 일
- 시작하기 전에
- 얼음 해동 RSB 솔루션입니다. 적어도 30 분 사용 전에, RT로 정제 자성 비드를 가져온다.
- PCR 정화
- 20 ° C에서 280 XG에서 1 분 동안 단계 5.3에서 접시를 원심 분리기 및 접착 덮개를 제거합니다.
- RT에서, 페이지의 90 μl를 추가reviously 아니라 각 정제 자석 구슬을 혼합. 부드럽게 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫, 140 μL에 피펫을 설정합니다. 실온에서 15 분 동안 품어. 실온에서 5 분 동안 자기 스탠드에 96 - 웰 플레이트를 놓습니다. 상층 액이 완전히 명확 나타나는지 확인합니다.
- (이 샘플 800 ㎕의 에탄올에 증류수 200 μl를 추가) 신선한 80 % 에탄올 용액을 준비합니다. 펠렛을 방해하지 뜨는 복용주의를 폐기하십시오.
- 자기 스탠드 플레이트 유지하면서, 비즈를 방해하지 않고, 각 웰에 새로 제조 된 80 % 에탄올 200 μL를 추가하고 RT에서 30 초 동안 배양 접시. 뜨는을 취소하고이 세차를 한 번 더 반복합니다. 에탄올이 꺼 졌는지 확인되었습니다. 플레이트는 자기 스탠드에있는 동안 15 분 동안 또는 에탄올을 완전히 증발 할 때까지 실온에서 건조 보자.
- 자기 스탠드에서 플레이트를 제거하고 RSB 버퍼의 30 μl를 추가합니다. t 피펫 부드럽게 30 μL에 피펫을 설정하고그는 전체 볼륨 위아래로 10 배. 실온에서 2 분 동안 접시를 품어.
- 자기 스탠드에 96 - 웰 플레이트를 놓고, 5 분 동안 또는 완전히 맑은 상청액이 나타날 때까지 배양한다. 조심스럽게 새로운 96 웰 플레이트 (: TCY 플레이트 타입)에 상층 액의 28 μl를 전송합니다.
NOTE : 절차는이 단계에서 중단 될 수 있고, 반응은 최대 7 일 동안 -15 ℃에서 보관.
- 라이브러리 확인 및 정량
- 단편 분석기를 사용하여 라이브러리의 질을 결정한다. 고해상도 아크릴 아미드 겔 전기 영동은 위에서 언급 한 단계를 대체 할 수도 있지만, 권장되지 않는다. 조각은 150 BP와 1000 bp의 사이에 있어야한다.
권장 : 주 연속 동안 클러스터의 최적의 수를 얻기 위해 qPCR에 의해 라이브러리를 정량화. - 참고로, 검증 된 라이브러리 (2 nm의)를 사용합니다. 제 라이브러리를 제조하는 경우, sequenc의 교정을 위해 제공 PhiX 파지 DNA (10 nM의)을 사용장치를 보내고.
- , 20 (7)에서의 포인트를 획득하기 위해 양성 대조군의 일련의 희석액을 제조 16, 8, 6, 4, 2, 1 EBT시 (EB 용출 완충액 + 0.1 % 트윈 20). 1 / 1000과 1 / 2000에 관심있는 라이브러리를 희석. 각 점은 세중 분석해야합니다.
- 잘 일에 대한 qPCR에 마스터 믹스 (2 배)를 포함 SYBR 녹색의 10 μL, 앞으로 프라이머 0.2 ㎕의 (10 μM, AATGATACGGCGACCACCGAGAT), 역 프라이머 0.2 μl를 추가 (사용 우물의 수를 곱 볼륨) 다음 믹스를 준비 (10 μM, CAAGCAGAAGACGGCATACGA), 7.6 ㎕의 PCR 등급 물입니다.
- 혼합 한 후, 양성 대조군 도서관 희석액의 각 웰과 2 μL로, 96 웰 플레이트에 믹스 18 μl를 면직. 20 ° C에서 280 XG에서 1 분 동안 접시와 원심 분리기를 밀봉. 그런 다음, 정량 PCR 열 순환기 및 실행 프로그램 4 (표 1)에서 접시를 놓습니다.
- 각 L의 수율을 얻기 위해, 종래와 같은 절대 정량 결과를 분석ibrary. qPCR에의 장점은 오직 플로우 셀과 상호 작용 DNA 정량화한다는 것이다.
참고 : 인해 시약의 하나의 DNA 모방 분자의 존재로 DNA의적인 형광 정량을 사용하지 마십시오. 이 정량 방법은 라이브러리 수율을 과대 평가하고 그 결과 클러스터링 점수를 과소 평가하는 것입니다.
- 단편 분석기를 사용하여 라이브러리의 질을 결정한다. 고해상도 아크릴 아미드 겔 전기 영동은 위에서 언급 한 단계를 대체 할 수도 있지만, 권장되지 않는다. 조각은 150 BP와 1000 bp의 사이에 있어야한다.
- 시퀀싱 런칭
- 용출 버퍼 (EB)의 30 μL의 최종 볼륨에서 4 nm에서 각 라이브러리를 희석하고, 모든 라이브러리를 풀 잘 섞는다.
- EB 버퍼에 신선한 0.2 N NaOH 용액을 준비하고 풀링 라이브러리의 10 μL로이 NaOH 용액 10 μl를 섞는다. 잘 혼합하고 실온에서 정확히 5 분을 품어.
- 5 분 후, 즉시 (순서 카트리지에서) 하이브리드 버퍼의 980 μl를 추가하고 잘 섞는다. 그리고, 하이브리드 버퍼 600 μL이 혼합물의 400 μl를 섞는다. 잘 혼합하고 (8)의 주입을 위해 카트리지 300주기 (2 × 150)에 600 μl를 전송할시. 실행 순서.
7 데이터 분석
- 장치가 데이터를 처리 한 후에, 새 컴퓨터로 .bam 및 .VCF 파일을 전송.
참고 : Transposase 조각화 발자국을 통합합니다. 따라서, 소프트웨어는 자동으로 이러한 데이터를 트리밍. - 장치 분석을 얻은 유전 적 변이를 수집합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 다른 소프트웨어 (Alamut)와 함께 보낸 파일 (.bam, .VCF)를 분석 할 수 있습니다. 그런 다음 모두 분석 얻은 유전자 변이를 비교합니다. 만 변화는 두 번 본 것으로 간주됩니다 발견했습니다.
표 1 PCR 조건
| 프로그램 | 온도 | 시간 | 민. 반복 | |||
| 1 | 72 ° C | 3 분 | 1 | 98 ° C | 30 초 | 1 |
| 98 ° C | 10 초 | 10 | ||||
| 60 ° C | 30 초 | |||||
| 72 ° C | 30 초 | |||||
| 72 ° C | 5 분 | 1 | ||||
| 10 ° C | 무제한 | |||||
| 이 | 95 ° C | 10 분 | 1 | |||
| 93 ° C | 1 분 | 1 | ||||
| 91 ° C | 1 분 | 1 | ||||
| 89 ° C | 1 분 | 1 | ||||
| 87 ° C | 1 분 | 1 | ||||
| 85 ° C | 1 분 | 1 | ||||
| 83 ° C | 1 분 | 1 | ||||
| 81 ° C 1 분 | 1 | |||||
| 79 ° C | 1 분 | 1 | ||||
| 77 ° C | 1 분 | 1 | ||||
| 75 ° C | 1 분 | 1 | ||||
| 71 ° C | 1 분 | 1 | ||||
| 69 ° C | 1 분 | 1 | ||||
| 67 ° C | 1 분 | 1 | ||||
| 65 ° C | 1 분 | 1 | ||||
| 63 ° C | 1 분 | 1 | ||||
| 61 ° C | 1 분 | 1 | ||||
| 59 ° C | 1 분 | 1 | ||||
| 58 ° C | 1 분 | 16 ~ 18 시간 | ||||
| 3 | 98 ° C | 30 초 | 1 | |||
| 98 ° C | 10 초 | 10 | ||||
| 60 ° C | 30 초 | |||||
| 72 ° C | 30 초 | |||||
| 72 ° C | 5 분 | 1 | ||||
| 10 ° C | 무제한 | |||||
| 4 | 95 ° C | 10 분 | 1 | |||
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Representative Results
샘플 QC 결과
표적 유전자의 서열을 결정하는 본 방법의 기능은 gDNA를 (도 2a)의 품질 및 tagmentation 단계의 품질에 기초한다. tagmentation은 (도 2b를 참조하면, 상부 패널) 충분하지 않은 경우, 시퀀스는 만족스럽지 않을 것이다. 전술 한 바와 같이, tagmentation 정제 후, gDNA를 약 300 bp의 단편의 대부분 (도 2B, 하부 패널)로 1000 염기쌍 150로부터 염기쌍 조각으로 tagmented한다.
라이브러리 제제의 끝에서, 라이브러리 품질 Bioanalyser을 사용하여 판정한다. 얻어진 프로파일 tagmentation 후 그러나 단편 높은 숫자 (도 2C)와 대략 동일해야한다. 라이브러리 품질 1C 그림과 동일하지 않은 경우, 순서는 수행 할 수 없습니다.
염기 서열에 시작되면시퀀싱 장치는 클러스터링 점수는주기 후 가능하며, 800,000 및 1,100,000 클러스터 / ㎟ (그림 3A) 사이 여야합니다. 이 값이 낮은 경우, 판독 순서는 특히 깊이에서 만족스럽지 않을 것이다. 이 높으면 영상 (도 3b) 흐리게되며, 어떠한 분석에 의한 클러스터를 구별하는 것이 불가능하여 수행되지 않는다.
런의 끝에서, 그 품질 점수를 확인하는 것이 중요하다. 위에 설명 된 프로토콜에 따라, 실행의 품질 평가 점수는 그림 4에 해당하는 것입니다. 시퀀싱의 품질은 Q-점수 (Q-30)로 표현된다. 우수 또는 30에 해당하는 Q-점수가 있어야합니다, 시퀀스 (클러스터)의 적어도 약 75 %가 실험의 유효성을 검사합니다.
시퀀싱 결과
이 실험은 헌법 유전 적 이상을 연구하기 위해 설계되었습니다. 이 경우, 유전 적 이상이 PR이다게놈의 50 % ESENT. 이 때문에, 깊이 시퀀싱이 매우 중요하지 않다. 여기서, 우리는 준비하고 11 완전한 유전자를 동시에 12 명의 환자의 2 라이브러리 염기 서열. 높은 시퀀싱 깊이를 얻기 위해, 다중화 된 환자의 수가 감소되어야한다. gDNA를 농축가 프로브에 의해 캡쳐를 기반으로, 농축 균질 (도 5)이 아니다. 우리의 프로토콜로, 우리는 약 6 기가 바이트의 150의 평균 범위를 유도, 읽기 (20)의 최소 330 읽기의 최대 각 기지 읽고 생성합니다. 선택된 판독 깊이는 임상 11 NGS의 사용에 따른다. 아마 캡처하여 gDNA를 농축에 의한, 그리고 유전자하지 주요 재 배열 읽기 깊이의 이질성에도 불구하고, 그것은 따라서 순서의 유효성을 검사, Q-점수가 30에 항상 (그림 5) 우월주의하는 것이 중요하다.
그럼에도 불구하고, 그 결과를 비교하여 확인하는 기술이 중요생거 시퀀싱으로 얻은 결과를 얻을 s의. 모두 생거 시퀀싱에 의해 염기 서열을 17 명에서와 transposase 기반 기술 (BRCA1과 BRCA2의 시퀀스를 코딩), 우리는 같은 330 유전 변이 (SNP 돌연변이)를 발견했습니다. 예로서, BRCA1 유전자에서 점 돌연변이 (왼쪽 그림 6) 및 BRCA2 유전자의 염기 4 (오른쪽 그림 6)의 삭제는 생거와 transposase 기반 방식 모두에서 검출되었다. BRCA1은 13 번 염색체의 반대 가닥에있는 바와 같이, 그것은 (순방향 가닥) BRCA2 대해 얻어진 서열은 보충 될 필요가없는 반면, 시퀀스가 얻어 편안하게 (하지만 반전되지 않음) 할 필요가 있음에 유의해야 . 도 5에 나타낸 바와 같이 생거 방법이되지 않는 반면, NGS 기술은, 유전 적 변이의 주파수 추정을 제공한다. 또한, 특히 INDEL 변동, 해석 NG와 쉽게S 기술. 그림 6에 나타낸 바와 같이, 오른쪽 INDEL 변화 시퀀스는 앞으로이 필요하고 삽입 또는 삭제 순서를 해독 순서를 역 스크램블 electropherogram로 나타납니다. NGS 분석으로, 삽입 또는 삭제 직접 시퀀스 따라서 오해의 위험을 줄이고, 결정된다. 마지막으로, transposase 기반 기술은 표적 유전자의 더 많은 수를 분석하기 위해 우리를 허용, 우리는 생거 시퀀싱에 포함되지 않은 많은 새로운 유전 적 변이 시퀀스를 발견했다. 이 결과는 다른 곳에 게시됩니다.
그림 1의 절차의 도식 워크 플로우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 품질 관리 전 라이브러리 준비 후. 안전 tagmentation 사용할 수 있습니다 gDNA를의 A. 분광 프로필. DNA 수익률보다 높은 5 NG가 / μL, 280 분의 260과 230분의 260 비율은 각각 1.8 및이 우수해야해야합니다. tagmented 된 gDNA의 B. 조각 분석기 프로파일. 상단 패널은 충분히 gDNA를 tagmented을 나타냅니다. 낮은 패널은 완벽 tagmented 샘플을 보여줍니다. 준비 라이브러리의 C. 조각 분석기 프로파일을 단지 순서 시작하기 전에. 조각의 크기는 tagmented gDNA를 (B, 낮은 패널)로하지만, 증폭 된 금액과 동일합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 3의 확인 클러스터 생성. 운전 중 시퀀싱 장치의 A. 스크린 샷. K / ㎟. B. 다른 이미지 저밀도 (상판), 고밀도 (하판)과 완벽한 밀도 (가운데 패널).에 해당하는 800 사이 1000 클러스터 밀도가 있어야한다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4 Q 점수를 확인하고 있습니다. 실행의 끝에서은 검증 순서는 30 우수 Q-점수로 생성 클러스터의 75 % 이상이 있어야합니다.JPG "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 대표 커버리지 데이터 및 해당 Q 점수. 읽기 깊이는 모든 덮여 유전자를 따라 이기종입니다. 그럼에도 불구하고, 적용 지역의 Q 점수는 Q-30에 항상 우수하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
생거 시퀀싱 및 transposase 기반 기술로 얻은 그림 6 대표 결과는. 생어 시퀀싱으로 관찰 모든 유전 적 변화는 거라고했다transposase 기반 기술 etected. 점 돌연변이 (point mutation)가 쉽게 해석 할 수있는 반면, INDEL의 변화는 때때로 생거 방법으로 공부하는 것은 매우 어렵습니다. 매체 처리 장치와 관련된 transposase 기반 기술로 INDEL 변화는 발견 간단하다. 그럼에도 불구하고,이 목표 유전자가 마이너스 가닥 (여기에서 BRCA1 유전자)에 위치 할 때이 순서를 얻을 보완 (그러나 반전되지 않음) 할 필요가 있음을 주목하는 것이 중요하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
NGS 장치 및 기술의 광범위한 사용은 암과 유전 질환의 연구에 새로운 기회를 제공하고 있습니다. 전체 게놈 염기 서열 또는 RNA 서열에 더하여, 다수의 환자에서 선택된 서열의 gDNA를 다량의 분석을 동시에 진단에 큰 가능성을 제공한다. 여기에, 우리는 중간 서열 분석 장치 (자재 / 장비의 표)와 동시에 24 명에서 11 완전한 유전자를 연구하는 Nextera 기술을 사용하여 (필요시) 특정 디자인을 개발했다. 이 프로토콜은 오류의 위험이 낮은 환자의 관심사에 대한 신속한 대응을 가능하게 데이터를 신속하게 생성 할 수 있습니다. 도 6에 도시 된 바와 같이, 생거 시퀀싱 검출 모든 유전 적 변이는 또한 transposase 기반 제조 키트를 사용하여 검출 하였다. 이 방법은 특히 직접 분석 복잡한 INDEL의 변화에 대해, 신뢰성과 쉽게 해석 할 수있다. 그럼에도 불구하고, 중요하다마이너스 가닥에있는 유전자,이 뉴클레오티드 (반전)없이 보완 할 필요가 있습니다입니다. 본 연구는 11 전체 유전자 분석을위한 설계로 실시하지만, 프로토콜 설계 선택된간에 동일 하였다. Transposase 기반 기술은 또한 장거리 PCR 제품 (12)로부터 라이브러리 제조를 위해 사용될 수있다. 사실, (제조 업체에 의해 개발) 알고리즘이 설계에 사용되는 구체적으로이 프로토콜에 대한 전용 (제조 업체의 웹 사이트 도구, 재료 / 장비의 표 참조). 외에도 기술을 transposase 기반도 사용할 수있는 라이브러리를 준비하기 전에 DNA 조각의 두 가지 다른 메커니즘 : 기계 조각과 효소 조각. 기계 DNA 단편화 재현하지만 초음파 세척기를 필요 및 라이브러리 제제보다 더 비싸고 시간 소모적이다. 효소 DNA 단편화는 종종 결과적으로 인해 제한 효소 사이트 위치에 DNA 캡쳐에 문제를 유발표적 서열 커버리지의 부족. 그럼에도 불구하고, DNA 조각에 대한 각각의 전략은 장점과 단점이 있지만, 적어도 장거리 PCR 제품 조각 (13)에 대해 매우 유사한 결과를 보인다. 새로운 효소 칵테일의 사용은 기계적 DNA 절편 (14)로 얻은 것과 동일한 결과를 제공하는 것처럼 보였다. Transposase 기반 기술은 고품질의 DNA (FFPE 조직에서 추출 된 DNA에는 적용되지 않음)을 필요로한다. 또한, transposase의 활동은 관심의 조각이 길이보다 더 긴해야한다는 제안, 300 개 이상의 BP의 조각을 필요로한다. 이 특이성은 고품질 않은 DNA 단편화의 필요성을 설명한다.
지금까지, BRCA1과 BRCA2의 유전자 변화는 가족 성 유방암과 난소 암에서 연구되고있다. 그러나 BRCA 유전자, 특히 BRCA2의 참여, 지금은 특히 췌장 15, 전립선, 다른 암에 의심(16) 및 고환 암 17. PALB2, BRCA 유전자의 파트너의 유전 적 변화는 췌장암 (18)와 연결되어 있습니다. 또한, 최근에 환자 BRCA 돌연변이를 은닉하고, 낮은 정도 PALB2 돌연변이로, PARP 억제제 19 그들의 췌장암 더 반응을 보였다 것으로 나타났다. BRCA1, BRCA2 및 PALB2 암의 가족 위험과 연관 가능성이 특정 치료에 대한 감수성과 연관되어, 그것은 가족 암 위험과 암 치료 반응에 대한 검사에서 검사에서 BRCA1과 BRCA2 파트너를 탐구하는 것이 중요합니다 나타납니다.
이러한 데이터에서 DNA 브레이크 수리 관련 유전자의 분석은 감수성 검사를 위해뿐만 아니라 치료 반응의 추정 표시기뿐만 아니라 중요한 것 같다. 또한,이 프로토콜을 제안 완전한 유전자 분석 COV 있었다그러한 프로모터의 돌연변이, 접합의 사이트 또는 인트론 스 플라이 싱에 위치 규제 사이트 등 선천적 본 (암세포에 존재) 일 수 ER 모든 변경,. 지금까지 유전자의 염기 서열을 비 코딩의 변화는 깊이 연구되지 않았지만 게놈 넓은 협회 연구 개발은 이러한 서열의 중요한 기능을 강조 할 수있다.
결론적으로, 본 연구에서 개발 된 transposase 기반 설계는 DNA 손상 복구에 관여하는 암 감수성 유전자의 유전 적 이상을 탐험하는 흥미로운 방법입니다. 24 명의 환자에 대한 완전한 11 유전자 서열 가능성 동시에 스크리닝 매우 어려운 기술이다 생거 시퀀싱 방법에 비해 중요한 이점이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well Plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Manufacturer website tool |
References
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